High Five昆蟲細(xì)胞系的致瘤性研究

汪偉，周俊明，王小敏，何孔旺，溫立斌，倪艷秀

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014)

研究報告

High Five昆蟲細(xì)胞系的致瘤性研究

汪偉，周俊明，王小敏，何孔旺*，溫立斌，倪艷秀

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014)

目的 檢測High Five昆蟲細(xì)胞系對BALB/c裸鼠致瘤性情況，以確保其作為疫苗生產(chǎn)細(xì)胞株的安全性。 方法 將裸鼠隨機(jī)分為 5 組，分別為High Five基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞試驗(yàn)組、High Five最高限制代次細(xì)胞試驗(yàn)組、HEp-2細(xì)胞陽性對照組、CEF細(xì)胞陰性對照組和不作任何處理的空白對照組，用細(xì)胞懸液背部皮下接種裸鼠。3周和12周后對裸鼠解剖及病理組織學(xué)檢查，其是否有腫瘤形成。結(jié)果 陽性對照HEp-2細(xì)胞組裸鼠接種后3周注射部位形成結(jié)節(jié)，病理組織學(xué)檢查為鱗狀細(xì)胞癌；陰性對照CEF細(xì)胞組和High Five細(xì)胞組均無結(jié)節(jié)形成，接種后12周經(jīng)解剖用病理組織學(xué)檢查，均無腫瘤形成。結(jié)論 基礎(chǔ)代次和最高限制代次High Five細(xì)胞均不具有致瘤性，可安全地應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)。

致瘤性；裸鼠；High Five細(xì)胞

High Five 細(xì)胞系(BTI-Tn5B1-4)是從親代粉紋夜蛾(Trichoplusiani)胚胎細(xì)胞系分離得到的克隆，由博伊斯·湯普森植物研究所(Boyce Thompson Institute for Plant Research, BTI)構(gòu)建，通常用于使用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng) (BEVS) 的重組蛋白表達(dá)[1-3]。該細(xì)胞系具有以下4個特性：①細(xì)胞數(shù)目倍數(shù)時間少于24 h；②貼壁生長良好，但能形成無規(guī)則單層細(xì)胞，使得確定蝕斑更加困難；③能夠懸浮培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中；④比在Sf9細(xì)胞中蛋白表達(dá)量要高5～10倍[4]。

目前昆蟲細(xì)胞Sf9已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)基因工程亞單位疫苗[5,6],取得良好的經(jīng)濟(jì)、社會效益[7,8]。若使用High Five細(xì)胞代替Sf9/21細(xì)胞系表達(dá)重組蛋白，提高蛋白產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，進(jìn)一步降低疫苗的市場價格，提高豬場疫苗的使用率，使更多豬群得到高質(zhì)量疫苗的免疫保護(hù)。為確保High Five細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞株時的安全性，需對其致瘤性進(jìn)行檢測[9]。

細(xì)胞的致瘤性檢測一般采用動物體內(nèi)接種法，可以根據(jù)細(xì)胞的特性及動物的敏感性選擇動物的種類，農(nóng)業(yè)部及WHO建議可以采用裸鼠(無胸腺小鼠)或經(jīng)抗胸腺抗體處理過的新生小鼠，以一定的細(xì)胞量進(jìn)行體內(nèi)接種[10,11]，檢測細(xì)胞的致瘤性。

本研究將不同細(xì)胞代次的High Five細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)裸鼠致瘤性研究，旨在說明High Five細(xì)胞對裸鼠的致瘤性影響，從而為High Five細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)細(xì)胞株的安全性提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

3周齡SPF級雌性BALB/c裸鼠50只，每只20 g左右，購自上海靈暢生物科技有限公司【SCXK(滬)2013-0018】。自購買之日起，一直放置于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心屏障系統(tǒng)【SYXK(蘇)2015-0020】的隔離器中，同時嚴(yán)格按照裸鼠飼養(yǎng)要求進(jìn)行飼養(yǎng)。飲用水均為高壓滅菌純凈水，小鼠飼料及墊料均為輻照滅菌產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞

High Five原始細(xì)胞購自上海Invitrogen公司，培養(yǎng)基為Gibco?公司Express Five? SFM培養(yǎng)基，按照細(xì)胞說明書培養(yǎng)、擴(kuò)大、凍存。致瘤性試驗(yàn)使用細(xì)胞：(1)High Five基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞，為High Five原始細(xì)胞擴(kuò)增20代，本實(shí)驗(yàn)室液氮保存；(2)High Five最高限制代次細(xì)胞，為High Five原始細(xì)胞擴(kuò)增第60代，本實(shí)驗(yàn)室液氮保存；(3)人喉癌細(xì)胞(HEp-2細(xì)胞)第20代，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，原始細(xì)胞擴(kuò)增20代，本實(shí)驗(yàn)室液氮保存；(4)雞胚成纖維細(xì)胞(CEF細(xì)胞)，使用SPF雞胚，微生物等級1級，本實(shí)驗(yàn)室自行分離，為原代細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞接種

將50只裸鼠隨機(jī)分為5組，分別為High Five基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞試驗(yàn)組、High Five最高限制代次細(xì)胞試驗(yàn)組、HEp-2細(xì)胞陽性對照組、CEF細(xì)胞陰性對照組和不作任何處理的空白對照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組裸鼠每只背部皮下注射1×107/0.2 mL基礎(chǔ)細(xì)胞庫、最高限制代次High Five細(xì)胞懸液，陽性對照組裸鼠每只背部皮下注射1×106/0.2 mL HEp-2細(xì)胞懸液，陰性對照組裸鼠每只背部皮下注射1×106/0.2 mL CEF細(xì)胞懸液，空白對照組裸鼠每只背部皮下注射生理鹽水0.2 mL。

1.4 觀察指標(biāo)、時間及判定方法

逐日觀察2 周，檢查有無結(jié)節(jié)或腫瘤形成。如有結(jié)節(jié)或可疑病灶，應(yīng)在觀察至少 1～2 周后剖檢，取病變部位組織，4%多聚甲醛固定液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下做病理組織學(xué)檢查。對未發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)的動物，對其中的一半動物觀察3周后剖檢，對另外一半動物觀察12周后剖檢，對接種部位進(jìn)行解剖和病理學(xué)檢查，觀察各個淋巴結(jié)和器官中是否形成結(jié)節(jié)，如有懷疑，應(yīng)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。不應(yīng)有移植瘤形成。

2 結(jié)果

2.1 外部觀察、解剖和病理學(xué)檢查

試驗(yàn)期間，各組動物均存活。接種后2周，陽性對照HEp-2細(xì)胞組裸鼠，外部觀察注射部位有結(jié)節(jié)(腫塊)形成，至3周，結(jié)節(jié)變得稍大(圖1-A1)，進(jìn)行剖解，發(fā)現(xiàn)注射部位有結(jié)節(jié)(圖1-A2)，其他部位未見結(jié)節(jié)形成；而陰性對照CEF細(xì)胞組、High Five基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組、High Five最高限制代次細(xì)胞組外部觀察、剖解，注射部位未見有結(jié)節(jié)形成。

在接種后12周，陰性對照CEF細(xì)胞組(圖1-B1與B2)、High Five基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組(圖1-C1與C2)和High Five最高限制代次細(xì)胞組(圖1-D1與D2)裸鼠，外部觀察、注射部位未見有結(jié)節(jié)形成；解剖后，注射部位未見有結(jié)節(jié)，各淋巴結(jié)、各內(nèi)臟器官正常，未見有結(jié)節(jié)形成。

2.2 病理組織學(xué)檢查

陽性對照HEp-2細(xì)胞組裸鼠，在接種細(xì)胞3周后，進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)注射部位有米粒大小的結(jié)節(jié)，取注射部位病變組織，病理組織學(xué)檢查顯示，病變部位組織灶內(nèi)細(xì)胞巢狀和(或)腺樣排列，細(xì)胞分裂像多見，偶可見瘤巨細(xì)胞，灶中大片細(xì)胞溶解性壞死，為鱗狀細(xì)胞癌(圖2-A1與A2)，陽性對照組接種腫瘤形成率為100%。

注：A1/A2：陽性對照HEp-2細(xì)胞組；B1/B2:陰性對照CEF細(xì)胞組；C1/C2：High Five基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組；D1/D2：High Five最高限制代次細(xì)胞組。圖1 裸鼠大體解剖學(xué)檢查Note. A1/A2：Positive control (HEp-2 cell group); B1/B2: Negative control (CEF cell group); C1/C2: High Five cell group of basic cell bank; D1/D2: High Five cell group of the highest limited passages. Fig.1 The gross anatomy examination of the nude mice

注：A1/A2：陽性對照HEp-2細(xì)胞組注射部位病變組織出現(xiàn)鱗狀細(xì)胞癌；B1/B2：High Five細(xì)胞組；C1/C2：陰性對照CEF細(xì)胞組。圖2 裸鼠注射部位及臟器病理組織學(xué)檢查(×400)Note. A1/A2: Squamous cell carcinoma was found in the diseased tissue at the injection site in positive controls (HEp-2 cell group); B1/B2: High Five cell group; C1/C2: Negative control (CEF cell group).Fig.2 Histopathological examination of tissues at the injection site and viscera of the nude mice

在接種12周后，陰性對照CEF細(xì)胞組、High Five基礎(chǔ)細(xì)胞庫細(xì)胞組、High Five最高限制代次細(xì)胞組外部觀察、剖解，注射部位未見有結(jié)節(jié)形成；各淋巴結(jié)、各內(nèi)臟器官正常，未見有結(jié)節(jié)形成。隨機(jī)選取High Five細(xì)胞試驗(yàn)組和CEF細(xì)胞陰性對照組的腎、脾做病理組織學(xué)檢查，未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞(圖2-B1、B2、C1、C2)。

3 討論

自1969年 Rygarrd和 Povlsen首次將人結(jié)腸癌移植于裸鼠并獲得成功以來，裸鼠在腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、藥品及生物制品的安全性評價領(lǐng)域占據(jù)愈來愈重要的地位。鑒于裸鼠先天性胸腺缺失，胸腺依賴性免疫功能缺乏，或T淋巴細(xì)胞功能基本缺乏，故異種移植時不產(chǎn)生排斥反應(yīng)[12,13]。裸鼠皮下接種可致瘤(或癌)性細(xì)胞系的細(xì)胞懸液，在特定環(huán)境、特定時間可生長成實(shí)體瘤，能夠保持原發(fā)瘤的組織學(xué)形態(tài)、免疫學(xué)特點(diǎn)及其特有的染色體組型[14]，是一種較好的動物模型，并廣泛應(yīng)用于動物疫苗研發(fā)中。而High Five細(xì)胞作為一種應(yīng)用于桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng) (BEVS) 的表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞株[15,16]，必將在疫苗及其他生物制品生產(chǎn)中發(fā)揮越來越重要的作用，評價其安全性，具有重要的意義。

本研究將High Five基礎(chǔ)細(xì)胞庫及最高限制代次細(xì)胞分別移植在BALB/c裸鼠皮下，移植3周后無結(jié)節(jié)形成，經(jīng)12周后病理組織學(xué)檢查無異常。而陽性對照HEp-2細(xì)胞注射部位出現(xiàn)結(jié)節(jié)，病理組織學(xué)檢查確定為鱗狀細(xì)胞瘤；同時陰性對照CEF細(xì)胞組與High Five試驗(yàn)組相似，無腫瘤形成。以上數(shù)據(jù)證明，High Five細(xì)胞在基礎(chǔ)代次和限制最高代次內(nèi)均對裸鼠不具有致瘤性，具有良好的安全性，可作為疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞株。

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Tumorigenicity of High Five insect cell line

WANG Wei, ZHOU Jun-ming, WANG Xiao-min, HE Kong-wang*, WEN Li-bin， NI Yan-xiu

(Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory of Veterinary Biologicals Engineering and Technology, Ministry of Agriculture; National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-Products, Nanjing 210014, China)

Objective To observe the tumorigenicity of High Five insect cell line in Balb/c nude mice, and make sure the safety of the cells when used in vaccine production. Methods Balb/c nude mice were randomly divided into 5 groups: the basic cell bank of High Five group, the highest limited passages of High Five group, HEp-2 cell group as positive control, CEF cell group as negative control, and blank control. Except of the blank control, cell suspension was injected subcutaneously into the nude mice in the different groups, respectively. At 3 and 12 weeks after injection, anatomical observation and histopathologic examination were performed to detect the tumor formation. Results At 3 and 12 weeks after injection, the tumorigenicity study results showed that no tumor developed at the transplantation site in the blank control group, negative group, and High Five groups. Histopathological examinations also showed no abnormality in these groups. Otherwise, squamous cell carcinoma was developed in the positive group at 3 weeks after injection. Conclusions High Five cells of basic cell bank and highest limited passages are not tumorigenic, and can be used in vaccine production safely.

Tumorigenicity; Nude mice； High Five cell line

HE Kong-wang, E-mail: kwh2003@263.net

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303046-10-3)；江蘇省自主創(chuàng)新基金 [CX(14)2045、ZX(15)1003)]。

汪偉(1988-)，男，助理研究員，碩士，主要從事獸用生物制品研究。E-mail： weiwang054@126.com

何孔旺，E-mail: kwh2003@263.net

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0186-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.013

2016-06-21