日本三角渦蟲無性繁殖系Dugesia ZB-1的建立

徐振彪，韓亞紅，宋林霞

(山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

研究報(bào)告

日本三角渦蟲無性繁殖系DugesiaZB-1的建立

徐振彪，韓亞紅，宋林霞*

(山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

目的 建立來源于我國(guó)的日本三角渦蟲無性繁殖純品系。方法 野外采集日本三角渦蟲，之后在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行切割損傷再生，通過不斷地切割培養(yǎng)，建立日本三角渦蟲無性繁殖純品系。結(jié)果 經(jīng)過10年上萬次實(shí)驗(yàn)，將來源于山東淄博地區(qū)的日本三角渦蟲培養(yǎng)成為一個(gè)實(shí)驗(yàn)室可控條件下穩(wěn)定生長(zhǎng)的單切無性繁殖純品系DugesiaZB-1。結(jié)論DugesiaZB-1的建立，為開展后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，推動(dòng)我國(guó)渦蟲研究的進(jìn)程及參與國(guó)際渦蟲研究的競(jìng)爭(zhēng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

日本三角渦蟲；無性系；DugesiaZB-1；模式生物

三角渦蟲是扁形動(dòng)物門渦蟲綱的代表動(dòng)物，身體柔軟，扁平葉狀，背面稍凸，多褐色，腹面色淺，前端頭部呈三角形，出現(xiàn)了三胚層，體型兩側(cè)對(duì)稱。消化道分為三支，原腎管排泄系統(tǒng)；具有網(wǎng)狀神經(jīng)系統(tǒng)；雌雄同體，既可有性生殖，也可無性生殖。生活在水流平緩、清澈、無污染的小溪中。

三角渦蟲具有極強(qiáng)的再生能力，因此被當(dāng)作模式生物用于再生、衰老、神經(jīng)系統(tǒng)等領(lǐng)域的研究[1-4]。無論如何切割損傷，只要包含干細(xì)胞，渦蟲的組織塊都可以再生為一個(gè)完整個(gè)體，甚至當(dāng)移植一個(gè)干細(xì)胞到射線殺死的渦蟲體內(nèi)，都可以讓渦蟲重新活過來[4,5]。渦蟲的再生是由一類稱為neoblasts的成體干細(xì)胞調(diào)控，研究其干細(xì)胞行為及功能可以在完全的生理?xiàng)l件下進(jìn)行，即不用分離其干細(xì)胞，在在體(in vivo)情況下即可進(jìn)行，因?yàn)闇u蟲的再生是肉眼可見的生物學(xué)現(xiàn)象[4,6]。因此，渦蟲可以作為篩選有關(guān)生長(zhǎng)及抑制生長(zhǎng)、甚至衰老和腫瘤等藥物的模型[6-8]。又因?yàn)榭梢栽谕耆募?xì)胞生理環(huán)境下進(jìn)行篩選，所以比離體細(xì)胞篩選更具有準(zhǔn)確可靠的優(yōu)勢(shì)[9]。

我國(guó)渦蟲資源豐富，分布廣泛，對(duì)渦蟲的分類、野外資源、生理生化方面的研究也早已開展。渦蟲作為模式生物研究材料，在我國(guó)乃至世界上，目前都還屬于小眾領(lǐng)域。在已報(bào)道的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，從美國(guó)和日本引進(jìn)的渦蟲S.mediterranea品系和GI品系[8,10-11]，我國(guó)科學(xué)家都有使用，但這兩個(gè)品系主要是在歐美和日本的實(shí)驗(yàn)室常用。除此之外還有我國(guó)吳畏博士建立的Pek-1品系[12]。可以看出，將渦蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定養(yǎng)殖及系統(tǒng)化，成為可利用的純品系的研究相對(duì)不足。目前，本課題組經(jīng)過近十年上萬次實(shí)驗(yàn)的探索，已經(jīng)養(yǎng)殖成功一個(gè)來源于我國(guó)山東淄博地區(qū)的三角渦蟲無性繁殖品系，命名為DugesiaZB-1[9,13]，實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)連續(xù)繁殖60多代，生長(zhǎng)條件已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化，其生長(zhǎng)狀態(tài)非常穩(wěn)定，相關(guān)的基因組結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)以及其它與渦蟲再生相關(guān)的關(guān)鍵特征都在研究中。該無性繁殖品系的建立，為推動(dòng)我國(guó)渦蟲研究的標(biāo)準(zhǔn)化及參與國(guó)際研究競(jìng)爭(zhēng)打下了基礎(chǔ)，具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

日本三角渦蟲Dugesiajaponica，采自山東省淄博市博山區(qū)源泉鎮(zhèn)泉河村(東經(jīng)118.05度，北緯36.41度，海拔279 m)的小溪中。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

生化培養(yǎng)箱(SPX-150BSH-II，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，直徑100 mm的玻璃平皿，50 mL燒杯，手術(shù)刀，毛筆，市售桶裝礦泉水或Mont溶液(1.6 mmol/L NaCl，1.0 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，0.1 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L KCl，1.2 mmol/L NaHCO3)，市售線蟲、新鮮牛肝、雞肝、煮熟的雞蛋黃等作為渦蟲的食物，投喂之前不需要滅菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

從小溪中采集渦蟲，在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行清洗，去除泥土等雜物，將干凈的渦蟲轉(zhuǎn)入市售礦泉水或Mont溶液中，在22～24℃的生化培養(yǎng)箱中避光適應(yīng)性培養(yǎng)，每周平均喂食渦蟲3次，食量以渦蟲能夠吃完，剩余殘?jiān)^少為宜。經(jīng)過3～4周的適應(yīng)后，挑取相對(duì)健壯的渦蟲置于玻璃平皿中進(jìn)行切割，根據(jù)渦蟲大小可以在咽部的一端或兩端用手術(shù)刀將其切割為2～3段，然后將一條渦蟲切割所得的身體片段轉(zhuǎn)入小燒杯中，于生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，切割一星期后開始每周喂食3次，等渦蟲再生完全并長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)，再次進(jìn)行切割，所得身體片段仍放在同樣的燒杯中培養(yǎng)，如此循環(huán)，并根據(jù)渦蟲數(shù)量更換合適的培養(yǎng)器皿，直到建立穩(wěn)定的渦蟲單切無性繁殖系。

2 結(jié)果

經(jīng)我國(guó)渦蟲分類及資源調(diào)查研究的學(xué)者研究確定，山東淄博博山區(qū)的小溪中所產(chǎn)渦蟲為日本三角渦蟲(Dugesiajaponica)，屬于扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes)渦蟲綱(Turbellaria)，三腸目(Tricladida)，淡水亞目(Paludicola)，三角渦蟲科(Dugesiidae)，三角渦蟲屬(Dugesia)[14-16]。將渦蟲從野外的小溪中采集回實(shí)驗(yàn)室后，經(jīng)過清洗和適應(yīng)性培養(yǎng)，然后利用切割損傷再生的方式建立渦蟲的無性繁殖品系。經(jīng)過十年上萬次切割培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，養(yǎng)殖成功一個(gè)來源于中國(guó)山東省淄博市博山區(qū)源泉鎮(zhèn)并且可以在實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定繁殖的日本三角渦蟲無性品系，目前實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)穩(wěn)定繁殖60多代，命名為DugesiaZB-1。

DugesiaZB-1為雌雄同體，是由一條渦蟲切割所得的無性繁殖品系(圖1，圖2)，主要通過人為切割方式進(jìn)行繁殖，染色體核型為2n=16(圖3)。

圖1 Dugesia ZB-1的整體形態(tài)Fig.1 Gross appearance of a Dugesia ZB-1

圖2 塑料盆中養(yǎng)殖的Dugesia ZB-1群體Fig.2 The asexual strain of Dugesia ZB-1 in a plastic container

圖3 Dugesia ZB-1細(xì)胞的中期染色體Fig.3 Metaphase chromosomes of a Dugesia ZB-1 cell

3 討論

在建立渦蟲無性系的過程中，我們摸索了適宜渦蟲生長(zhǎng)的各種條件及切割渦蟲的方法。首先，DugesiaZB-1對(duì)水質(zhì)非常敏感，水質(zhì)的好壞直接決定渦蟲命運(yùn)。自然界中的渦蟲生活在水流平緩，清澈無污染的小溪中。所以，DugesiaZB-1養(yǎng)殖用水為購(gòu)買的桶裝礦泉水，水質(zhì)要求干凈無污染。同時(shí)在養(yǎng)殖過程中要根據(jù)水質(zhì)的清潔程度及時(shí)進(jìn)行清洗和更換，尤其水質(zhì)已經(jīng)變臟后一定要及時(shí)更換。

與自然界中的渦蟲生長(zhǎng)環(huán)境相似，DugesiaZB-1可以在4～30℃的水溫條件下生活，所以實(shí)驗(yàn)室選擇養(yǎng)殖溫度為22～24℃，這也是DugesiaZB-1的最適無性繁殖溫度。經(jīng)過多年觀察，在22～24℃的最適養(yǎng)殖溫度下，DugesiaZB-1不進(jìn)行有性生殖，只進(jìn)行無性繁殖。DugesiaZB-1每年可以發(fā)生自然斷裂方式的無性繁殖2～6次。自然界中的渦蟲繁殖方式與溫度、染色體的倍性、種群密度等都有關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)室22～24℃恒溫養(yǎng)殖環(huán)境中，其無性繁殖的高峰主要發(fā)生在4～7月份，由此我們推測(cè)，渦蟲的繁殖方式也許還與季節(jié)或者其體內(nèi)感知生物鐘的調(diào)控有關(guān)系，這是一個(gè)需要深入研究的課題。

DugesiaZB-1與自然生活狀態(tài)下的渦蟲所需食物無異。實(shí)驗(yàn)室可以喂食線蟲、牛肝、蛋黃、雞血、雞肝、魚肝等食物。無論何種食物，都要盡量保持新鮮、無污染、未變質(zhì)。對(duì)渦蟲進(jìn)行清洗時(shí)可以使用軟毛筆擦抹養(yǎng)殖容器。如果有條件可以使用適宜的玻璃器皿，一段時(shí)間后，將養(yǎng)殖容器完全清洗并高壓滅菌后再次循環(huán)使用。

再生是渦蟲的一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象，由干細(xì)胞調(diào)控，這也是渦蟲作為模式生物的主要優(yōu)勢(shì)。一般一條DugesiaZB-1自然斷裂成兩段，再生形成兩個(gè)成體渦蟲，但這種自然的無性繁殖方式對(duì)擴(kuò)大種群數(shù)量來說比較緩慢，所以實(shí)驗(yàn)中使用的渦蟲一般采用切割損傷進(jìn)行再生的無性繁殖方式擴(kuò)大種群。22～24℃養(yǎng)殖條件下，體長(zhǎng)1 cm左右的DugesiaZB-1，可以非常容易地切割為3～6段，7 d左右損傷的渦蟲可以基本再生完全，并且可以正常進(jìn)食。切割DugesiaZB-1時(shí)，盡量保持其咽部不被破壞，這對(duì)中間段的再生有利。通過對(duì)上述條件的控制，可使DugesiaZB-1在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境穩(wěn)定地生長(zhǎng)起來。該無性繁殖品系的建立，為加速我國(guó)利用渦蟲作為模式生物進(jìn)行相關(guān)科學(xué)研究的步伐提供了基礎(chǔ)和保證，具有非常重要的意義。

[1] Hagstrom D, Cochet-Escartin O, Collins EM. Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology [J]. Regeneration (Oxf), 2016, 3(2): 65-77.

[2] Hagstrom D, Cochet-Escartin O, Zhang S, et al. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology [J]. Toxicol Sci, 2015, 147(1): 270-285.

[3] Slack JM. Planarian pluripotency[J]. Science, 2011, 332(6031): 799-800.

[4] Elliott SA, Sanchez Alvarado A. The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration [J]. WIREs Dev Biol, 2013, 2(3): 301-326.

[5] Wagner DE, Wang IE, Reddien PW. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration [J]. Science, 2011, 332(6031): 811-816.

[6] Oviedo NJ, Nicolas CL, Adams DS, et al. Planarians: a versatile and powerful model system for molecular studies of regeneration, adult stem cell regulation, aging, and behavior [J]. CSH Protoc 2008, 2008: pdb emo101.

[7] Perrigue PM, Najbauer J, Jozwiak AA, et al. Planarians as a model of aging to study the interaction between stem cells and senescent cells in vivo [J]. Pathobiol Aging Age Relat Dis, 2015, 5: 30052.

[8] Scimone ML, Kravarik KM, Lapan SW, et al. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea [J]. Stem Cell Reports, 2014, 3(2): 339-352.

[9] 徐振彪, 宋林霞. 三角渦蟲: 在體篩選再生及衰老相關(guān)藥物的模型生物 [J]. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 38(6): 744-749.

[10] Nishimura O, Hosoda K, Kawaguchi E, et al. Unusually large number of mutations in asexually reproducing clonal planarian Dugesia japonica[J]. PLoS One, 2015, 10(11): e0143525.

[11] Basquin C, Orfila AM, Azimzadeh J. The planarian Schmidtea mediterranea as a model for studying motile cilia and multiciliated cells [J]. Methods Cell Biol, 2015, 127: 243-262.

[12] Ma C, Wang X, Yu S, et al. A small scale expression screen identifies tissue specific markers in the Dugesia japonica strain Pek-1[J]. J Genet Genomics, 2010, 37(9): 621-635.

[13] Xu Z, Chen M, Ren Z, et al. Deep sequencing identifies regulated small RNAs in Dugesia japonica [J]. Mol Biol Rep, 2013, 40(6): 4075-4081.

[14] 陳廣文, 陳曉虹, 呂九全. 中國(guó)淡水三角屬渦蟲研究的歷史與進(jìn)展 [J]. 動(dòng)物學(xué)雜志, 1999, 34(6): 37-41.

[15] 王衍喜, 陳艷珍, 張錄強(qiáng). 魯中山區(qū)東亞三角頭渦蟲有性生殖過程研究初報(bào)[J]. 四川動(dòng)物, 2006, 25(4): 794-795.

[16] 陳廣文, 呂九全, 馬金友, 等. 中國(guó)淡水三腸目渦蟲已知屬種及其地理分布[J]. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2001, 47(專刊): 9-12.

Establishment of a planarian asexual strainDugesiaZB-1

XU Zhen-biao, HAN Ya-hong, SONG Lin-xia*

(College of Life Science, Shandong University of Technology, Zibo 255049, China)

Objective To establish a pure planarianDugesiaasexual strain in China. Methods The planarian worms were collected from a wild stream, and then made the worm grow after amputation in the lab. To establish an asexual strain through cutting and culturing for the single worms. Results After ten years and more than ten thousand experiments, an asexual pure planarian strainDugesiaZB-1 originated from Shandong Zibo area was established. It grows stably under laboratory controlled conditions. Conclusions The establishment ofDugesiaZB-1 Priovides a solid foundation for further experiments and promoting planarian research in our country and participation in the field of the international planarian research.

Planarian; Asexual strain;DugesiaZB-1; Model animal

SONG Lin-xia, E-mail: slxch@163.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)31550005，31350004)；山東省自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)ZR2011HM065)。

徐振彪(1970-)，男，講師，研究方向：分子細(xì)胞生物學(xué)。 E-mail：xzbss@163.com

宋林霞(1972-)，女，副教授，研究方向：分子細(xì)胞生物學(xué)。E-mail：slxch@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0166-03

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.009

2016-09-13