人輪狀病毒G1P[8]型感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞模型的建立

李道群，彭杰，甸子芩,，王文廣，張阿梅，馮悅，牛華，代解杰*，夏雪山*

(1. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500；2. 昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院(云南省第一人民醫(yī)院)，昆明 650032；3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化研究與疾病動(dòng)物模型創(chuàng)建省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，昆明 650118)

研究報(bào)告

人輪狀病毒G1P[8]型感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞模型的建立

李道群1，彭杰1，甸子芩1,2，王文廣3，張阿梅1，馮悅1，牛華2，代解杰3*，夏雪山1*

(1. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500；2. 昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院(云南省第一人民醫(yī)院)，昆明 650032；3. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化研究與疾病動(dòng)物模型創(chuàng)建省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，昆明 650118)

目的 探究樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的增殖特性，建立人輪狀G1P[8]型病毒體外感染樹鼩原代小腸上皮的細(xì)胞模型。方法 采用膠原酶XI和中性蛋白酶I聯(lián)合消化法獲取樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞，經(jīng)純化和鑒定，用人輪狀G1P[8]型病毒感染細(xì)胞，測(cè)定培養(yǎng)上清的病毒滴度和載量，并用Western blot和間接免疫熒光檢測(cè)法檢測(cè)人輪狀病毒G1P[8]型VP6蛋白的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)人輪狀G1P[8]型病毒體外對(duì)樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的感染性。結(jié)果 分離的樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得純度達(dá)90%樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞。對(duì)樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞、原代腎細(xì)胞、HCT116細(xì)胞和MA104細(xì)胞進(jìn)行輪狀病毒易感性比較，確定樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞可以被人輪狀病毒G1P[8]感染，培養(yǎng)72 h時(shí)病毒滴度可達(dá)到2.0×105TCID50/mL。經(jīng)Western blot和間接免疫熒光發(fā)現(xiàn)在人輪狀G1P[8]型病毒感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞1～5 d均能檢測(cè)到人輪狀病毒VP6蛋白的表達(dá)和分布。結(jié)論 確立了樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的分離、純化與培養(yǎng)方法，并建立了人輪狀G1P[8]型病毒感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的體外模型。

樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞；輪狀病毒；病毒增殖特性；VP6蛋白

輪狀病毒(rotavirus, RV)感染是導(dǎo)致全球范圍內(nèi)五歲以下嬰幼兒急性腸胃炎脫水腹瀉的主要原因，每年會(huì)導(dǎo)致44萬嬰幼兒死亡，對(duì)全世界嬰幼兒的公共健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1]。中國(guó)是RV感染的多發(fā)區(qū)和高發(fā)區(qū)，嬰幼兒感染率高達(dá)65%，以人輪狀G1P[8]型病毒株感染群體為主[2]。雖然對(duì)RV的研究已經(jīng)有幾十年的歷史，但是目前仍沒有治療RV的特效藥物和理想的疫苗[3]。RV感染的動(dòng)物模型可分為感染模型與疾病模型，成年豬、猴、牛、羊和鼠等可被病毒感染，但不出現(xiàn)腹瀉等顯著臨床癥狀，成為感染模型；幼齡乳鼠和無菌豬可被病毒感染并出現(xiàn)腹瀉等典型疾病癥狀，稱為疾病模型。RV感染大型哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)成本高、技術(shù)操作難度較大，而小型動(dòng)物繁殖能力強(qiáng)、易于操作和成本低等優(yōu)勢(shì)，使得RV感染小型哺乳動(dòng)物越來越得到人們的重視。由于動(dòng)物屬性、病毒與動(dòng)物對(duì)應(yīng)性等因素的影響，RV感染模型、尤其人源RV感染模型與疾病模型較難建立，導(dǎo)致RV感染與致病的機(jī)制研究受到較大限制[4-6]。

樹鼩(Tupaiabelangeri, tree shrew)是一種攀鼩目的小型哺乳類動(dòng)物，易飼養(yǎng)、管理和經(jīng)濟(jì)低廉，進(jìn)化程度較高，在新陳代謝和解剖學(xué)特性等方面與人接近，是一種在生物醫(yī)學(xué)研究中很有應(yīng)用價(jià)值的新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。已有研究證實(shí)，多數(shù)對(duì)多種人類病毒易感，包括人甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)等[7-10]。萬新邦等[11]用含有RV的嬰兒糞便懸液對(duì)樹鼩進(jìn)行灌胃，首次證實(shí)樹鼩對(duì)人RV易感。龐其方[12]和朱婉萍等[13]分別用中草藥和牛乳鐵蛋白對(duì)感染人RV的樹鼩模型進(jìn)行治療，樹鼩排毒滴度、腹瀉和死亡率均得到改善。RV對(duì)樹鼩感染及致病性的初步確認(rèn)，對(duì)在細(xì)胞層次探究RV的感染與致病性提出新的要求。

本研究成功建立了一種樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的分離方法，并進(jìn)行了純化和鑒定，初步建立了人RV G1P[8]型病毒體外感染樹鼩原代樹鼩小腸上皮細(xì)胞模型。人RV感染樹鼩動(dòng)物小腸上皮細(xì)胞模型的建立，可以為RV感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞致病性研究提供新的證據(jù)，并佐證樹鼩疾病動(dòng)物模型建立的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、病毒株和細(xì)胞

選用清潔級(jí)的3～4月齡子一代雄性健康中緬樹鼩5只，體重130～145 g，購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心【SCXK(滇)2013-0001】，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均在昆明理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。

RV標(biāo)準(zhǔn)株(菌株編號(hào)：GDV085)，來自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，以MA104細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，經(jīng)測(cè)定其滴度為2.0×106TCID50/mL。

1.2 樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

按體重比例對(duì)樹鼩腹腔注射苯巴比妥進(jìn)行麻醉。解剖取出小腸，延縱軸切開，用鑷子剔除腸道內(nèi)容物和腸膜粘液，用含雙倍青鏈霉素的D-Hanks’洗滌5遍，將其剪成1 mm3左右的肉糜狀物，然后轉(zhuǎn)移至100 U/mL膠原酶XI和0.04 mg/mL的中性蛋白酶I的混合消化酶液中，37℃水浴30 min，每隔10 min漩渦振蕩30 s。待30 min消化完全后取出500 r/min離心5 min，棄去上清酶液，加入完全培養(yǎng)基洗滌1遍，然后加入含有2%山梨醇的組織分散液，500 r/min離心3 min(該步驟重復(fù)5次)。收集上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，500 r/min離心15 min，棄去上清液，重懸細(xì)胞，接入T-25培養(yǎng)瓶中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液，至傳代。

為了獲取較為純的樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)采用了相差消化法和相差貼壁法。經(jīng)2～3代次培養(yǎng)即可獲得較純的小腸上皮細(xì)胞。鑒定使用角蛋白18(CK18)抗體(購自Abcam，使用根據(jù)說明書)進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)上皮樣細(xì)胞的比例和純度。1.3 RV病毒感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞和病毒增殖特性

按感染復(fù)數(shù)為0.1(MOI=0.1)的RV病毒感染MA104細(xì)胞，維持培養(yǎng)至72 h時(shí)收取培養(yǎng)上清，為用于感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的病毒液。以感染復(fù)數(shù)為3(MOI=3)的RV病毒接種原代樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞，同時(shí)設(shè)MA104細(xì)胞作為陽性對(duì)照，在培養(yǎng)箱中孵育2 h后棄除上清，使用PBS洗5遍，以最后1次洗液作為0 d對(duì)照，加入含1μg/mL胰酶的無血清DMEM維持培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)每隔12 h后收集感染上清，然后提取上清中的核酸，一步法RT-PCR檢測(cè)病毒核酸，上游引物VP6-F：TGTATGTATGGATGAAATGGC，下游引物VP6-R：TAATGGAAGCTACCGTGAAA，擴(kuò)增片段為893 bp；TaqMan探針法熒光定量PCR檢測(cè)上清中的病毒載量，定量上游引物：RV-F1(891-914 bp)-TTATTATTTCAGTTGATGCGTCCA，下游引物RV-R1(1034-1055 bp)-TGCTAACAGAGTTTCATTTGCG，探針序列為：Probe(947-972 bp)：TCCACAAGCACAACCTTTTCAGCACC，擴(kuò)增片段為165 bp，具體操作步驟參閱[14]。

1.4 RV病毒滴度檢測(cè)

采用組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染劑量(50% tissue culture infective dose, TCID50)法測(cè)定，在96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液將其按照1∶10稀釋成10-1～10-6等系列濃度，將培養(yǎng)成單層MA104細(xì)胞的96孔板用PBS洗滌2遍，再將不同稀釋度的病毒加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔100 μL，每個(gè)濃度重復(fù)6次。設(shè)置正常對(duì)照細(xì)胞，37℃孵育2 h后吸棄病毒液，加入無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL/孔(含1 μL/mL胰酶)。37℃ 5%CO2培養(yǎng)，連續(xù)觀察。當(dāng)能夠出現(xiàn)細(xì)胞病變CPE的最低稀釋度的病毒孔中，不再繼續(xù)出現(xiàn)CPE時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)稀釋度出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔數(shù)，按照Reed-Muench方法計(jì)算病毒的TCID50。

1.5 RV VP6蛋白在樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot 檢測(cè)RV VP6蛋白表達(dá)。以感染復(fù)數(shù)為3(MOI=3)將RV接種到鋪有樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的6孔板中，分別收取1、3 d和5 d被感染細(xì)胞，提取總蛋白，蛋白定量后，上樣量均為20 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用一抗和二抗進(jìn)行細(xì)胞中RV VP6蛋白檢測(cè)(anti-mouse VP6 一抗和HRP二抗均購自Abcam，具體使用根據(jù)說明書)。

間接免疫熒光法檢測(cè)RV VP6蛋白在樹鼩小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)分布情況。細(xì)胞感染48 h后甲醇固定，經(jīng)一抗和二抗標(biāo)記，熒光顯微鏡下檢測(cè)被感染細(xì)胞中VP6蛋白的分布情況(anti-mouse VP6一抗和 goat anti-mouse FITC二抗均購自Abcam，具體使用參照說明書)。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的分離及鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)條件：DMEM(88%)+ FBS(10%)+青鏈霉素(1%)+EGF(10 ng/mL)+DMSO(1%)+肝素鈉(100 μg/mL)+胰島素(2.5 μg/mL)，將樹鼩的原代小腸上皮細(xì)胞分離后進(jìn)行培養(yǎng)至第5天，可見細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出不規(guī)則多邊形的上皮樣，細(xì)胞之間輪廓清晰(圖1a)，生長(zhǎng)旺盛。經(jīng)過2代次純化，紅圈部分中的成纖維細(xì)胞逐漸減少(圖1b、c)，通過角蛋白CK18抗體進(jìn)行免疫熒光鑒定，可見幾乎所有的細(xì)胞都呈現(xiàn)出綠色熒光，樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的純度達(dá)90%(圖1d)。

注：a：樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞(100×)；b：經(jīng)過第1代純化的原代小腸上皮細(xì)胞形態(tài)(100×)；c：經(jīng)過第2代純化的原代小腸上皮細(xì)胞形態(tài)(100×)；d：原代小腸上皮細(xì)胞免疫組化染色(100×)。紅圈部分為夾雜著成纖維細(xì)胞的樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞。圖1 樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)、純化和鑒定Note. a: Primary small intestinal epithelial cells from tree shrew (100×); b: Morphology of the first generation primary intestinal epithelial cells after of purification (100×); c: Morphology of the second generation primary intestinal epithelial cells after purification (100×); d: Immunohistochemical staining of primary small intestinal epithelial cells (100×).Fig.1 Culture, purification and identification of the primary small intestinal epithelial cells from tree shrew

2.2 樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖

通過MTT法測(cè)定樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞細(xì)胞活力(維持培養(yǎng)至16 d)，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線(圖2)。結(jié)果表明樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞在培養(yǎng)至10 d時(shí)，細(xì)胞的增殖一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)比MA104達(dá)到增殖平臺(tái)期慢些(10 d左右達(dá)到增殖平臺(tái)期)。而10～12 d的平臺(tái)期中，樹鼩的原代小腸上皮細(xì)胞增殖能力較MA104細(xì)胞呈下降趨勢(shì)，同時(shí)12 d以后細(xì)胞增殖均開始下降，表明原代小腸上皮細(xì)胞和MA104細(xì)胞開始發(fā)生凋亡。

圖2 樹鼩小腸上皮細(xì)胞增殖曲線Fig.2 Growth curves of the tree shrew small intestinal epithelial cells

2.3 RV感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞與病毒的增殖

將RV病毒接種至單層MA104細(xì)胞中，添加1 μg/mL胰酶的無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后收取上清。經(jīng)測(cè)定病毒的滴度為2.0×106TCID50/mL。

收集RV感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的0 d洗滌液和未感染及感染5 d后的培養(yǎng)上清，提取病毒核酸進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3a所示，樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞、樹鼩原代腎細(xì)胞、HCT116和MA104細(xì)胞的培養(yǎng)上清中均擴(kuò)增檢測(cè)到核酸片段，大小為165 bp，而未感染陰性對(duì)照組未擴(kuò)增出目的條帶。

用實(shí)驗(yàn)室建立的Taqman探針法檢測(cè)感染前后上清的病毒載量，發(fā)現(xiàn)感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清的病毒載量為5.32×104copies/μL，明顯高于其0 d洗液(1.6×102copies/μL)；對(duì)照組MA104細(xì)胞感染后的培養(yǎng)上清病毒載量(7.75×106copies/μL)和樹鼩原代小腸細(xì)胞感染后差異顯著，相對(duì)0 d洗液均增殖，與樹鼩原代腎原代(1.7×104copies/μL)和HCT116(7.52×104copies/μL)差異無顯著性，如圖3-(b)所示。

注：(a)M. DL2000 marker；1. RV感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞0 d洗液； 2. RV感染樹鼩原代腎細(xì)胞培養(yǎng)5 d上清； 3. RV感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)5 d上清； 4. RV感染HCT116培養(yǎng)5 d上清； 5. RV感染MA104培養(yǎng)5 d上清； 6. 未感染樹鼩小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)5 d上清。(b)ns為差異無顯著性；*表示P<0.05差異有顯著性。圖3 RV感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的檢測(cè)Note. a: M, DL2000 marker. 1. Wash solution of the small intestinal epithelial cells after RV infection; 2. The culture supernatant of primary renal cells of tree shrew at 5 days after RV infection. 3. The culture supernatant of primary small intestinal epithelial cells of tree shrew at 5 days after infection. 4. The culture supernatant of HCT116 cells at 5 days after infection. 5. The culture supernatant of MA104 cells at 5 days after infection. b: ns represents non-significant differences; *P<0.05, significant differences.WS:wash solution;PRC:primary renal cells;IEC:Intestinal epithelial cells.Fig.3 Detection of RV-infected primary small intestinal epithelial cells of the tree shrew

將RV按最適感染復(fù)數(shù)(MOI=3)接種至單層樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞中，然后每隔12 h收取培養(yǎng)上清，連續(xù)收取5 d，測(cè)定其載量和滴度，繪制RV感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的增殖曲線(圖4)。病毒感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞后，滴度和載量呈現(xiàn)逐漸遞增，兩者變化基本一致，在輪狀病毒感染72 h后，病毒滴度和載量均出現(xiàn)最大值2.0×105TCID50/mL和約為1×106copies/mL，之后出現(xiàn)了上下波動(dòng)的狀況，通過0～120 h的RV感染滴度和載量變化趨勢(shì)，說明RV病毒能夠在樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞上復(fù)制和增殖。

圖4 RV在樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞中的增殖曲線Fig.4 Proliferation curves of RV in the primary small intestinal epithelial cells of tree shrew

2.4 Western blot 檢測(cè)RV VP6蛋白在樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)

原代小腸上皮細(xì)胞感染后的第1天就可以檢測(cè)到RV VP6蛋白的表達(dá)，同時(shí)在5 d內(nèi)均能夠檢測(cè)到RV VP6蛋白表達(dá)。其中第1天表達(dá)量低，第5天表達(dá)較高(見圖5)。未感染RV病毒5 d原代小腸上皮細(xì)胞(陰性對(duì)照)未檢測(cè)到VP6蛋白的表達(dá)，陽性對(duì)照RV感染MA104細(xì)胞5 d可檢到VP6蛋白表達(dá)。

圖5 Western blot檢測(cè)RV VP6蛋白在樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.5 Western blot results of the expression of RV VP6 protein in the primary small intestinal epithelial cells of tree shrew

免疫熒光檢測(cè)RV感染48 h的樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞，結(jié)果表明：RV VP6蛋白表達(dá)情況相對(duì)于陰性未感染輪狀病毒的樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞來說，只能見到DAPI復(fù)染的細(xì)胞核(見圖6)。而RV感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞可以觀察到VP6蛋白分布于細(xì)胞核的邊緣，主要圍繞在細(xì)胞的胞質(zhì)中，表明RVVP6蛋白主要在被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，并且在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行RV復(fù)制活動(dòng)。這一現(xiàn)象和同一時(shí)間段RV感染宿主MA104細(xì)胞后的現(xiàn)象相一致。

圖6 免疫熒光檢測(cè)RV VP6在樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.6 Expression of RV VP6 protein in the primary small intestinal epithelial cells of tree shrew detected by immunofluorescence

3 討論

RV感染動(dòng)物模型主要是以幼齡小鼠、乳鼠、無菌豬、兔以及猴作為研究對(duì)象，但是小鼠在遺傳和親緣關(guān)系上與人較遠(yuǎn)，而非人靈長(zhǎng)類的猴等大型哺乳類動(dòng)物的成本較高。樹鼩作為一種新的低等靈長(zhǎng)類動(dòng)物，因其與人類的親緣關(guān)系較近、成本低、繁育周期短等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于人類相關(guān)重大疾病的研究[7]。最近，龐其方[12]和朱婉萍等[13]在與人發(fā)病機(jī)理相似的樹鼩感染輪狀病毒模型基礎(chǔ)上，采用藥物治療人RV感染進(jìn)行了評(píng)價(jià)，但均未對(duì)人RV感染樹鼩病毒亞型、樹鼩胃腸道細(xì)胞易感性、感染特性和細(xì)胞病變等方面進(jìn)行更為詳細(xì)的研究，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用價(jià)值。本研究通過建立原代樹鼩小腸上皮細(xì)胞體外感染模型，從原代小腸上皮細(xì)胞增殖、病毒感染原代細(xì)胞特征等研究，為RV在樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制特性和樹鼩體內(nèi)模型的優(yōu)化提供了依據(jù)。采用混合酶液消化法獲取樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)條件優(yōu)化和細(xì)胞鑒定[15,16]。本文對(duì)樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖特性研究發(fā)現(xiàn)：樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞在12 d以內(nèi)完成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期至平臺(tái)期，并能在對(duì)數(shù)期維持生長(zhǎng)活力，說明樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞能夠滿足體外人RV感染實(shí)驗(yàn)的條件。

其次，對(duì)RV感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞5 d內(nèi)的蛋白和病毒載量的測(cè)定，表明RV感染樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞后，確實(shí)存在RV RNA的復(fù)制和蛋白表達(dá)量的增長(zhǎng)。同時(shí)對(duì)RV感染不同宿主細(xì)胞(MA104)的研究，病毒表達(dá)水平由高到低依次為MA104 > HCT116 >樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞>樹鼩原代腎細(xì)胞。可能是對(duì)非宿主細(xì)胞的選擇性適應(yīng)能力不同所造成感染效率存在差異所致。間接免疫熒光結(jié)果表明，陰性對(duì)照未檢測(cè)到病毒VP6蛋白表達(dá)，僅可見細(xì)胞核存在，而陽性MA104細(xì)胞可見明顯細(xì)胞核和病毒蛋白VP6的表達(dá)，樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞，同樣存在明顯的病毒蛋白VP6的表達(dá)，證明了輪狀病毒對(duì)樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的易感性。

本研究成功分離并優(yōu)化了樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞的培養(yǎng)條件，得到較純且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的原代小腸上皮細(xì)胞，成功建立了人RV G1P[8]型病毒體外感染樹鼩小腸上皮細(xì)胞模型。通過被感染小腸上皮細(xì)胞內(nèi)外病毒的核酸和蛋白水平的表達(dá)檢測(cè)，均能夠證明人RV可以感染體外樹鼩原代小腸上皮細(xì)胞。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究人RV的體外感染機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為人RV樹鼩活體感染模型與疾病模型的建立提供佐證。

[1] Shao L, Fischer D D, Kandasamy S,et al. Comparative in vitro and in vivo studies of porcine rotavirus G9P [13] and human rotavirus Wa G1P [8][J]. J Virol, 2016, 90(1): 142-151.

[2] Dian Z, Fan M, Wang B, et al. The prevalence and genotype distribution of rotavirus A infection among children with acute gastroenteritis in Kunming, China[J]. Arch Virol, 2017，162(1): 281-285.

[3] 黃敏, 黃英. 輪狀病毒腹瀉研究進(jìn)展[J]. 華西醫(yī)學(xué), 2014, 29(4): 780-782.

[4] 宋麗軍, 趙文昌, 譚曉梅, 等. Wa 株輪狀病毒感染昆明小鼠乳鼠腹瀉模型的建立及影響因素考察[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 15(4): 11-14.

[5] 陳渙. 中藥止瀉液對(duì)鼠輪狀病毒腸炎腸道水通道蛋白影響的研究[D]. 廣州醫(yī)學(xué)院, 2009.

[6] 羅軍, 孫曉梅, 宋志忠, 等. 輪狀病毒感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué) ISTIC, 2015, 32(1): 48-50, 54.

[7] 鄭永唐, 姚永剛, 徐林. 樹鼩基礎(chǔ)生物學(xué)與疾病模型[M]. 云南科技出版社，2014.

[8] 陳瑾, 代解杰, 孫曉梅. 樹鼩肝炎動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 18(2): 59-62.

[9] 崔照瓊, 楊衛(wèi), 李艷瓊, 等. 樹鼩 HSV-1 感染模型的建立[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志, 2016，11(4):325-328.

[10] 戴長(zhǎng)柏. 人單純皰疹病毒Ⅱ型 (HSV-II) 實(shí)驗(yàn)感染樹鼩的研究[J]. 動(dòng)物學(xué)研究, 1985, 6(3): 53, 71

[11] 萬新邦, 龐其方, 丘福禧, 等. 成年的中國(guó)云南樹鼩對(duì)人輪狀病毒易感性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 1985, 5(4): 304-306.

[12] 龐其方, 萬新邦, 丘福喜. 中草藥 “秋瀉靈”實(shí)驗(yàn)治療樹鼩人工感染輪狀病毒腸炎的研究[J]. 昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1983, 4(3): 7.

[13] 朱婉萍, 孔繁智. 牛乳鐵蛋白對(duì)感染輪狀病毒樹鼩的治療試驗(yàn)[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2012, 29(5): 397-400.

[14] 彭杰, 胡曉星, 馮悅, 等. 人 G1 型輪狀病毒 TaqMan 熒光定量檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2016, 32(6): 512-517.

[15] Macartney KK, Baumgart DC, Carding SR, et al. Primary murine small intestinal epithelial cells, maintained in long-term culture, are susceptible to rotavirus infection[J]. JVirol, 2000, 74(12): 5597-5603.

[16] 王靜, 張彥明, 仝鋼, 等. 新生仔豬小腸上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2010, 41(1): 92-98.

Establishment of a model of tree shrew primary small intestinal epithelial cells infected with human rotavirus G1P[8]

LI Dao-qun1，PENG Jie1，DIAN Zi-qin1,2，WANG Wen-guang3，ZHANGA A-mei1，F(xiàn)ENG Yue1，NIU Hua2，DAI Jie-jie3*，XIA Xue-shan1*

(1. Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China; 2. The Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology, Kunming 650034; 3. Yunnan Provincial Innovation Group of Tree Shrew Standard Culture and Animal Model, Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Kunming 650118)

Objective To explore the proliferation characteristics of primary small intestinal epithelial cells of tree shrews and the characteristics of human rotavirus (RV) G1P[8] infection to these cells, and establish a model of tree shrew primary small intestinal epithelial cells infected with human rotavirus G1P[8]. Methods The primary small intestinal epithelial cells were obtained by collagenase XI and dispase I digestion from tree shrew. After purification and identification, the obtained primary small intestinal epithelial cells were infected with RV. Then, culture supernatants of infected cells were collected every 12 hours after infection. Viral titer and viral load were subsequently determined. Western blot and indirect immunofluorescence observation were used to detect the expression of RV protein VP6 in the primary cells. The infectivity of RV to the tree shrew primary cells was finally evaluated.Results After purification and identification of primary epithelial cells from the tree shrew, high purity above 90% primary tree shrew small intestinal epithelial cells was obtained. These primary small intestinal epithelial cells could be infected with RV virus by comparing the virus infectivity to primary renal cells, HCT116 cells and MA104 cells. The virus titer reached to 2.0×105TCID50/mL at 72 h after infection. Using Western blot and indirect immunofluorescence observation, the specific viral protein of VP6 was determined to be expressed in the tree shrew primary small intestinal epithelial cells, and were located in the cytoplasm from days 1 to 5. Conclusions The separation, purification and cultivation methods of tree shrew primary small intestinal epithelial cells are successful, and the tree shrew model of RV-infected the tree shrew primary small intestinal epithelial cells is successfully established.

Primary intestinal epithelial cells, Tree shrews；Rotavirus；Virus proliferation；Protein VP6

XIA Xue-shan, E-mail: oliverxia2000@aliyun.com；DAI Jie-jie, E-mail: djj@imbcams.com.cn

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2014BAI01B01)。

李道群(1988-)，男，博士研究生，研究方向：病毒樹鼩模型。E-mail： lidaoqunyq@163.com

夏雪山，教授，研究方向：分子病毒學(xué)，E-mail： oliverxia2000@aliyun.com； 代解杰，研究員，主要研究方向：疾病動(dòng)物模型，E-mail： djj@imbcams.com.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0111-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.001

2016-12-06