百里香酚對山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的體外毒活性研究

閆寶琪張世棟?董書偉王東升那立冬桑夢琪楊洪早嚴(yán)作廷?

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070）

百里香酚對山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的體外毒活性研究

閆寶琪1，張世棟1?，董書偉1，王東升1，那立冬1，2，桑夢琪1，楊洪早1，2，嚴(yán)作廷1?

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州730070）

為了探究百里香酚對山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（goat endometrial epithelial cells，gEECs）的毒性作用，采用不同濃度的百里香酚作用于gEECs后，觀測其對細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性的影響。結(jié)果表明，百里香酚對EECs的毒性作用與其濃度呈劑量依賴效應(yīng)（y＝－0.008x＋1.2202，R2＝0.9767），即隨著藥物濃度的增加細(xì)胞的增殖抑制率增大，藥物對細(xì)胞的半數(shù)增殖抑制率（IC50）為100μg/mL。當(dāng)50、100μg/mL的百里香酚作用于EECs時，gEECs的細(xì)胞核、細(xì)胞漿的形態(tài)均未產(chǎn)生明顯變化，但當(dāng)150μg/mL的百里香酚作用于gEECs時，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞死亡；而且藥物濃度≥100μg/mL時細(xì)胞LDH的釋放量顯著高于正常細(xì)胞組，gEECs細(xì)胞膜的完整性受到破壞。百里香酚作用于山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后呈現(xiàn)一定的毒性作用，且毒性作用和藥物的濃度有關(guān)。百里香酚作用于gEECs的安全范圍在0～100μg/m L，研究結(jié)果為百里香酚治療奶牛等經(jīng)濟(jì)動物的炎癥性疾病的臨床用藥濃度提供理論依據(jù)。

百里香酚；子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；細(xì)胞毒性；膜通透性

子宮內(nèi)膜炎（Endometritis）是奶牛的常見病之一，多發(fā)生于產(chǎn)后，是病原菌感染子宮內(nèi)膜引起的炎癥，常導(dǎo)致奶牛屢配不孕［1－2］。該病可造成奶牛生理功能紊亂、產(chǎn)奶量下降，甚至終生不孕而被淘汰，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重危害，經(jīng)濟(jì)損失巨大。據(jù)中國奶牛協(xié)會統(tǒng)計，奶牛的繁殖障礙發(fā)生率高于其他牛，而且在不孕的病因中以子宮內(nèi)膜炎引起的不孕牛所占比例最高［3，4］。臨床上，大量抗生素和激素應(yīng)用于治療子宮內(nèi)膜炎，導(dǎo)致耐藥菌株的不斷產(chǎn)生，抗生素殘留，治療效率明顯降低。中草藥具有明顯的抗菌消炎，毒副作用小，增強免疫力，改善血液循環(huán)和增加子宮收縮的作用，所以近十幾年來關(guān)于應(yīng)用中草藥治療子宮內(nèi)膜炎的研究成為熱點［5－6］。

百里香酚是一種單萜酚類物質(zhì)，最初從百里草中分離而得名，即5－甲基－2－異丙基苯酚（5－methyl－2－iso－propylpheno1）［7］。研究發(fā)現(xiàn)百里香酚具有廣譜抗菌活性，對多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌等均具有抑制作用［8］。Ara?ntxa Aznar等［9］研究發(fā)現(xiàn)將百里香酚、香芹酚和甲基混合后在25℃下能夠有效抑制酵母菌繁殖生長，抑制時間長達(dá)21 d。Omran等的研究也發(fā)現(xiàn)，百里香精油對外陰道念珠菌有較強的抗真菌活性，其效果優(yōu)于氟康唑，與1μg/mL的兩性霉素B的抗真菌效果相當(dāng)［10］。體外實驗表明，百里香酚可以顯著抑制低密度氧化脂蛋白誘導(dǎo)的人THP－1單核細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子TNF－α、 IL－1β、IL－6并促進(jìn)IL－10的基因和蛋白表達(dá)水平，對一些炎癥類疾病如皮炎、胸膜炎、腹膜炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等均具有抗炎促愈合功能［11－12］。

綜上所述，百里香酚有較好的抑菌抗炎效果，對于一些炎癥性疾病具有較好的應(yīng)用前景，但應(yīng)用百里香酚治療奶牛等經(jīng)濟(jì)動物的子宮內(nèi)膜炎的研究還未見報道。近年來，利用子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)檢測子宮生理功能的研究不斷呈現(xiàn)新的進(jìn)展，同時利用LPS刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞建立的炎癥模型檢測炎癥信號通路以及中草藥抗炎機(jī)制的報道也在不斷增加［13－14］。實驗中，篩選出中草藥作用于細(xì)胞無毒性作用的濃度是在分子細(xì)胞水平上檢測中草藥抗炎作用的前提條件。因此，試驗采用山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（gEECS）作為材料，研究百里香酚對其的毒性作用，以期為百里香酚治療奶牛子宮內(nèi)膜炎的臨床用藥研究提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1.1 細(xì)胞 山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系（EECs），由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院靳亞平教授惠贈。

1.1.2 主要儀器及設(shè)備 Memmert CO2培養(yǎng)箱；HeaL ForceB2型生物安全柜；SW－CJ－1CU型超凈工作臺；倒置顯微鏡，Leica DMI6000B；MDC M2e型多功能酶標(biāo)儀；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板為美國eppendorf產(chǎn)品。

1.1.3 藥品及試劑 百里香酚（Thymol，B21153，100 mg），上海源葉生物科技有限公司（HPLC≥98%），用含0.05%的DMSO將其稀釋到所需要的濃度；DMEM/F12培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）為杭州四季青公司產(chǎn)品；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2～7.4）；MTT為Sigma公司產(chǎn)品以0.01 mol/L PBS溶解至5 mg/mL；瑞氏、姬姆薩染料為Solarbio公司產(chǎn)品；LDH檢測試劑盒（貨號A020－2）為南京建成生物工程研究所有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出永生化山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞（EECs），37℃快速復(fù)蘇，低速離心后添加含10%FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組與處理 取100μL濃度為5× 104個/mL的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同濃度的百里香酚的完全培養(yǎng)液100μL，百里香酚的終濃度分別為：0、10、20、40、60、80、100、120、150μg/m L，每個濃度設(shè)置8個復(fù)孔。

1.2.3 MTT檢測百里香酚對細(xì)胞的增殖作用 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，觀察細(xì)胞增殖情況。棄去舊培養(yǎng)基，加入5 mg/mL的MTT 20μL，孵育4 h。棄去多余的MTT，每孔加入200μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解后在酶標(biāo)儀上以570 nm檢測各孔OD值，并以不含細(xì)胞的孔調(diào)零，記錄各孔OD值，計算細(xì)胞的半數(shù)增殖抑制率（IC50）［15－16］。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞相對存活率為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

A0：藥物處理前OD值；A1：對照組OD值；A2：藥物處理48 h后OD值。

1.2.4 百里香酚對EECS的形態(tài)的影響 取1 mL濃度為5×104個/mL的細(xì)胞懸液接種于12孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)基，加入含百里香酚終濃度為0、100、150μg/mL的完全培養(yǎng)液1 m L，每個濃度設(shè)置4個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞（1200 r/min，5 min），加入500μL的無菌PBS重懸細(xì)胞，涂片，晾干，放入預(yù)冷的甲醇溶液中固定15～30 min。接著滴加2～3滴瑞氏染液，染色2～3 min后滴加等量的吉姆薩染液，染色10 min。每張涂片計數(shù)100個細(xì)胞，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)［17－19］。

1.2.5 EECs細(xì)胞膜完整性的檢測 取0.5 mL濃度約為5×104個/mL的細(xì)胞懸液接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)基。分別加入含百里香酚終濃度為0、10、20、40、60、80、100、120、150μg/mL的完全培養(yǎng)液0.5 mL，每組設(shè)三個重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清液，6600 r/min，離心10 min，嚴(yán)格按照LDH檢測試劑盒說明書操作，檢測各組上清液中LDH的含量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SAS 9.30軟件分析數(shù)據(jù)，Excel繪圖軟件進(jìn)行繪圖。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實驗結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 百里香酚對EECs增殖的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)百里香酚的濃度處在10～150μg/mL時，對EECs有增殖抑制作用。隨著藥物濃度的升高對細(xì)胞的抑制作用越明顯，且細(xì)胞的增殖抑殖率與藥物的濃度呈一定的線性關(guān)系（y＝－0.008x＋1.2202，R2＝0.9767，如圖1）。由此可計算，當(dāng)細(xì)胞的增殖抑制率為0.5時（IC50），百里香酚的作用濃度為100μg/mL。

2.2 百里香酚對EECs的細(xì)胞形態(tài)影響 正常的山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞多數(shù)為梭形，少數(shù)呈三角形，核圓居中，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞交織成網(wǎng)狀。細(xì)胞貼壁良好，體積較大、折光性好，形態(tài)大小均勻一致（如圖3A，大圖為100×，小圖為400×）；經(jīng)100μg/mL百里香酚處理48 h后，EECs的密度增大，且在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好（如圖3B，大圖為100×，小圖為400×）；由圖C可以看出當(dāng)百里香酚濃度達(dá)到150μg/mL時，作用相同的時間細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞核暴露，視野內(nèi)有大量的細(xì)胞碎片存在（如圖3C，大圖為100×，小圖為400×）。

2.3 百里香酚對EECs的細(xì)胞核形態(tài)影響

瑞氏－姬姆薩染色使細(xì)胞核呈深淺不同的紫紅色，胞漿呈淺藍(lán)色。染色結(jié)果顯示正常組和經(jīng)100μg/m L的百里香酚作用48 h的細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核界限清晰，胞核完整，胞漿均勻，細(xì)胞邊緣完整，視野內(nèi)未出現(xiàn)死亡細(xì)胞以及形態(tài)異常的細(xì)胞。（如圖4a，4b，大圖為100×，小圖為400×）。當(dāng)百里香酚的濃度達(dá)到150μg/m L時，染色結(jié)果顯示大部分細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性遭到破壞。與正常細(xì)胞組相比，視野內(nèi)少數(shù)細(xì)胞其細(xì)胞膜著色變淺，且細(xì)胞核多位于細(xì)胞膜邊緣；大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜完全消失，視野內(nèi)只有紫紅色的細(xì)胞核存在，但大多數(shù)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整，只有少量的細(xì)胞核發(fā)生破碎裂解。

圖1 0～150μg/m L對EECs的促增殖作用

2.4 百里香酚對EECs細(xì)胞膜完整性的影響

測定結(jié)果顯示：隨著百里香酚濃度的升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的含量有升高的趨勢，但不存在規(guī)律性增長。且與對照組相比，當(dāng)百里香酚的濃度大于100μg/mL時細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的含量顯著升高（P＜0.01）；與對照組相比10、20、40、60、80、100μg/mL的百里香酚作用細(xì)胞后培養(yǎng)液中LDH的含量雖然升高，但不存在顯著性差異（P＞0.05），如圖4所示。

3 討 論

研究報道，通過陰道給藥治療婦科炎癥具有可避免口服給藥的首關(guān)效應(yīng)和血藥濃度的谷峰現(xiàn)象，避免藥物對于胃腸道的刺激，避免注射給藥的疼痛與心理恐懼，通過“First uterine－pass effect”能夠?qū)⑺幬锇邢騻鬟f到子宮內(nèi)膜組織，因此，生物利用度高、藥效顯著［20］。百里香酚具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、抗癌等多種生物活性，在臨床治療中具有較好的應(yīng)用前景，在將來的研究中百里香酚可以被開發(fā)成一種新型的子宮灌注劑，采用陰道給藥治療奶牛等經(jīng)濟(jì)動物的子宮內(nèi)膜炎。那么，探明百里香酚對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的刺激作用以及毒性作用是闡明其臨床用藥安全性的必要前提條件。所以試驗開展百里香酚對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞體外的毒活性研究，為百里香酚治療奶牛等經(jīng)濟(jì)動物子宮內(nèi)膜炎的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。甲臜被溶解后所測得的光密度值越小，說明細(xì)胞存活率越低［21－22］。本研究中MTT的結(jié)果表明，百里香酚對EECs的增殖抑制作用與其濃度成一定的關(guān)系，當(dāng)濃度為100μg/mL時達(dá)到EECs的半數(shù)增值抑制率，因此可選用0～100μg/mL的百里香酚作用于EECs進(jìn)行抗炎效果的研究。而在梁德潔［23］用百里香酚對LPS誘發(fā)的乳腺炎小鼠的保護(hù)作用及作用機(jī)制研究中選取百里香酚對小鼠乳腺上皮細(xì)胞無毒性影響的最大濃度為40μg/mL。這可能與百里香酚作用的細(xì)胞種類不同，細(xì)胞接種數(shù)量不同，實驗操作不同等因素有關(guān)。

乳酸脫氫酶（LDH）是活細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)廣泛存在的酶之一，正常情況下LDH不能透過細(xì)胞膜，但當(dāng)細(xì)胞膜受損或細(xì)胞死亡導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變時，則會釋放到培養(yǎng)液中，釋放的LDH與細(xì)胞膜的損傷程度或細(xì)胞死亡數(shù)成正比［24］。檢測培養(yǎng)液中LDH的含量可判斷細(xì)胞膜的受損程度。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)百里香酚的濃度≥100μg/mL時細(xì)胞釋放的LDH含量顯著升高，說明該濃度的百里香酚可顯著引起細(xì)胞膜通透性增大。此外，細(xì)胞生長狀態(tài)和瑞氏－姬姆薩染色結(jié)果顯示，150μg/mL的百里香酚對EECs的細(xì)胞膜能造成嚴(yán)重?fù)p傷，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞死亡。這一實驗結(jié)果和之前的研究報道類似，Nostro等［25］研究也報道百里香酚可以抑制金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生物膜形成。百里香酚可以通過影響細(xì)菌胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)和無機(jī)離子平衡，從而破壞生物膜完整性對白色念珠菌產(chǎn)生抑制作用。進(jìn)一步的研究表明，百里香酚可以增加小鼠平滑肌細(xì)胞胞膜去極化，導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋離子釋放，影響細(xì)胞膜的通透性［26－28］。由此可見，百里香酚能夠破壞細(xì)胞膜的完整性，而且這可能與藥物被細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運吸收有關(guān)。

圖2 不同濃度百里香酚作用48 h后對EECs生長狀態(tài)的影響（大圖為100×；小圖為400×）

圖3 不同濃度百里香酚作用48 h后對EECs形態(tài)的影響（大圖為100×；小圖為400×）

圖4 不同濃度的百里香酚對EECs乳酸脫氫酶釋放的影響

Zu等［26］人研究證實，由于百里香精油對人類癌癥細(xì)胞具有較強的細(xì)胞毒性，因此百里香精油也具有一定的抗癌作用。其對PC－3、A549和MCF－7腫瘤細(xì)胞株50%抑制濃度（IC50）分別為0.010%（V/V）、0.011%（V/V）和0.030%（V/V）。此外香芹酚和百里香酚作為目前應(yīng)用最為廣泛的重要香料之一，被廣泛應(yīng)用于飼料添加以及一些口腔衛(wèi)生品和洗滌物品［27］。

4 結(jié) 論

百里香酚對山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的安全劑量為≤100μg/mL，該劑量范圍內(nèi)藥物對細(xì)胞活力和形態(tài)結(jié)構(gòu)無顯著影響；大于該劑量的百里香酚可顯著增大子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的膜通透性，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。綜上所述，百里香酚對細(xì)胞的毒性作用的研究為其治療奶牛等經(jīng)濟(jì)動物的炎癥性疾病，癌細(xì)胞的抑制作用，以及作為食品添加劑的安全使用劑量提供一定的理論依據(jù)和參考價值。

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（編輯：陳希）

The Cytotoxic Effect of Thymol on Goat Endometrial Epithelial Cells

YAN Bao－qi1，ZHANG Shi－dong1?，DONG Shu－wei1，WANG Dong－sheng1，NA Li－dong1，2，SANG Meng－qi1，YANG Hong－zao1，2，YAN Zuo－ting1?
（1.Lanzhou Institute ofAnimal Husbandry and Pharmaceutical Sciences，Chinese Academy ofAgricultural Sciences，Lanzhou730050，China；2.College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou730070，China）

In order to explore the cytotoxicity of thymol on goat endometrial epithelial cells（gEECs），gEECs was treated by different concentrations of thymol.And the cell growth curve，the changes of cellmorphology，the integrity of the cell membrane was detected.The results showed that thymol has a role in promoting proliferation of the gEECs.There was a dose－dependent effect between thymol toxicity to gEECs and concentrations（y＝－0.008x＋1.2202，R2＝0.9767），The inhibitory rate of cell proliferation increased withthe increasing of the drug concentration；And 50%inhibitory rate of proliferation（IC50）of this drug on EECs is 100μg/mL.When the 50 and 100 g/mL of thymol stimulated gEECs，the nuclearmorphology and the cytoplasm of the gEECs cells didn＇t change significantly.Butwhen 150 g/mL thymol treated gEECs，cell membrane rupture and cellwould die；When the concentration wasmore than 100 g/m L，the integrity of cell membrane can be damaged，promoting the release of LDH significantly compared with normal cells group.In summary，there was a certain toxicity of thymol on goat endometrial epithelial cells，and the toxicity related to concentration.The safe concentration of thymol is in the range of 0～100 g/m L.Which provided a theoretical basis not only for the clinical treatment on the inflammatory diseases of cows and other economic animal but also for the relevant experiments of thymol at themolecular level.

thymol；endometrial epithelial cells；cytotoxicity；membrane permeability

2016－10－10

A

1002－1280（2017）04－0035－07

S859.79

“十二五”國家科技支撐計劃重點課題（2012BAD12B03）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（CAAS－ASTIP－2014－LIHPS－03）；甘肅省自然科學(xué)基（1506RJYA146）

閆寶琪，碩士，從事臨床獸醫(yī)方向研究。

嚴(yán)作廷，E－mail：yanzuoting＠caas.cn；張世棟，E－mail：zhangshidong＠caas.cn