Sevag法脫鹿藥多糖蛋白工藝條件優(yōu)化

趙淑杰鄭麗寧路飄飄洪波楊利民韓忠明

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春130118）

Sevag法脫鹿藥多糖蛋白工藝條件優(yōu)化

趙淑杰1，鄭麗寧1，路飄飄1，洪波1，楊利民2，韓忠明2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春130118）

為了優(yōu)化Sevag法脫鹿藥粗多糖蛋白工藝條件，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測定蛋白質(zhì)含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品測定多糖含量，以蛋白質(zhì)脫除率、多糖保留率及綜合評分為指標(biāo)，通過正交試驗考察氯仿與正丁醇的比例、多糖液與Sevag液的比例、振蕩時間、洗脫次數(shù)四因素對脫蛋白效果的影響，確定鹿藥多糖脫蛋白的最佳工藝條件。結(jié)果表明Sevag法脫鹿藥多糖蛋白的最佳條件為氯仿∶正丁醇＝4∶1，多糖溶液（2 mg/mL）∶Sevag試劑＝2∶1，振蕩時間15 min，洗脫6次，從綜合評分來看，主要的影響因素是脫蛋白次數(shù)和振蕩時間。Sevag法脫鹿藥多糖蛋白的方法簡便，工藝穩(wěn)定且可有效提高多糖的純度。

鹿藥；多糖；Sevag法；脫蛋白；工藝優(yōu)化

多糖為人體必需的生物大分子之一，在細(xì)胞識別、生物體受精、生長發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)衡態(tài)的維持等方面都起著重要作用［1］。由于特殊的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生物活性，使得多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，如疫苗、免疫調(diào)節(jié)劑、抗腫瘤、抗病毒藥物，以及制備藥物緩釋劑、醫(yī)用透析膜、人工血液等［2－4］。多糖的研究已成為生命科學(xué)研究中最活躍的領(lǐng)域之一。目前，植物多糖在畜禽業(yè)中的應(yīng)用與理論研究也日益增多［5－6］。

鹿藥（Smilacina japonica A.Gray）為百合科鹿藥屬多年生草本植物，據(jù)記載，鹿藥為鹿常食九草之一而得名。鹿藥為藥食同源植物，幼嫩莖葉從出苗到開花前均可食用，而根莖及根為民間常用中藥“鹿藥”，性味“甘、苦、溫，無毒”，具有補氣益腎、祛風(fēng)除濕、活血調(diào)經(jīng)功能［7］。近年來，也有從事雞、豬等養(yǎng)殖業(yè)的農(nóng)民將鹿藥的根莖粉碎后摻入到飼料中，以提高飼養(yǎng)動物的肉質(zhì)質(zhì)量和增強免疫力［8］?，F(xiàn)代研究顯示鹿藥根莖中含有黃酮、皂苷、多糖等活性成分［9－11］，前期研究發(fā)現(xiàn)鹿藥中多糖含量較高，約占干燥生藥的20%［12］，且具有抗氧化和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。我國野生鹿藥資源分布十分廣泛，儲量巨大，具有較大的開發(fā)利用潛力。為確切了解鹿藥多糖結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，首先要得到較純的多糖。因此本研究開展鹿藥多糖的分級沉淀及脫蛋白研究，確定了Sevag法（即氯仿－正丁醇脫蛋白的方法）脫鹿藥多糖蛋白的最佳工藝，將為鹿藥多糖的分離純化及開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料 鹿藥樣品采自吉林省輝南縣境內(nèi)，將根莖及根洗凈陰干，粉碎備用。

1.2 儀器與試劑 DL－1000E智能超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司；ME203E電子天平，MET?TLER TOLEDO公司；DJ－10A粉碎機，上海隆拓儀器有限公司；高速冷凍離心機，Thermo Fisher Scientific；冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；T6－紫外分光光度計，北京普析通用有限責(zé)任公司。葡萄糖、苯酚、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250、無水乙醇、濃硫酸等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹿藥粗多糖的提取及分級沉淀 采用超聲波法提取鹿藥粗多糖，按照正交試驗確定的最佳工藝［12］，提取3次，合并提取液，將提取液減壓濃縮至原體積的1/10，加無水乙醇進(jìn)行分級沉淀，首先加入無水乙醇至醇含量為70%，有沉淀析出，低溫放置24 h后，7000 r/min離心10 min，沉淀用無水乙醇和丙酮反復(fù)洗滌至洗液無色，沉淀冷凍干燥得70%乙醇沉淀鹿藥多糖（標(biāo)記為SJP1），按照以上沉淀方法，向離心后的上清液繼續(xù)加入無水乙醇至醇含量分別達(dá)到80%、90%，分別得到80%乙醇沉淀鹿藥多糖（標(biāo)記為SJP2）和90%乙醇沉淀鹿藥多糖（標(biāo)記為SJP3）。

2.2 鹿藥多糖的蛋白質(zhì)含量測定 蛋白質(zhì)含量測定參照文獻(xiàn)［13］，采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為對照品，于波長595 nm處測吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y＝1.1383x＋0.0162，r＝0.9967。

蛋白質(zhì)脫除率（%）＝100×（m1－m2）÷m1，m1為脫蛋白前溶液中蛋白質(zhì)的含量，m2為脫蛋白后溶液中蛋白質(zhì)的含量。

2.3 鹿藥多糖的多糖含量測定 鹿藥多糖含量測定采用苯酚－硫酸法：精密量取脫蛋白后的上層清液0.1 mL加水定容至5 mL，取2 mL置具塞試管中，加入4%苯酚溶液1.5 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸6.0 mL，搖勻，于40℃水浴中保溫30 min，取出，置冰水浴中5 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，測定490 nm的吸光度，代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y＝13.049x＋0.0037（x：葡萄糖濃度，mg/mL；y為吸光度；r＝0.9998），計算多糖的含量。

多糖損失率（%）＝100×（M1－M2）÷M1，M1為脫蛋白質(zhì)前溶液中多糖的含量；M2為脫蛋白質(zhì)后溶液中多糖的含量。

2.4 鹿藥粗多糖脫蛋白工藝正交試驗 Sevag法脫蛋白的效果和氯仿與正丁醇的比例、多糖液與Sevag液的比例、振蕩時間、洗脫次數(shù)等因素有關(guān)。前期研究中將SJP2配成2 mg/mL的多糖溶液，單因素試驗結(jié)果表明：氯仿與正丁醇比例為2∶1，多糖液與Sevag試劑比例為4∶1，振蕩30 min，洗脫5次分別為單因素試驗設(shè)計中蛋白脫除率達(dá)到最高。基于單因素試驗結(jié)果，本研究對四個因素通過正交試驗進(jìn)一步優(yōu)化，以確定Sevag法脫鹿藥多糖蛋白的工藝，因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平表

選用L9（34）正交設(shè)計，以蛋白質(zhì)脫除率、多糖保留率，及綜合評分（綜合評分＝蛋白質(zhì)脫除率× 50%＋多糖保留率×50%）為考察指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

由蛋白質(zhì)脫除率來看，各因素的影響大小順序為C＞A＞D＞B，即脫蛋白次數(shù)影響最大，其次是多糖溶液與Sevag試劑比例，再次是振蕩時間，這三個因素對蛋白脫除率的影響均達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01）；最后是氯仿與正丁醇比例，在試驗所選的比例對脫除率的影響差異不顯著（P＞0.05）。按照極差分析各水平間的最佳效果是C3A1D1B2。

由多糖保留率來看，各因素的影響順序為A＞D＞B＞C，總體趨勢是脫蛋白率高，多糖保留率低，也即多糖損失的多。所以要從蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率綜合來分析更為合理些。

從總體評分來看，各因素的影響順序為C＞D＞A＞B，即脫蛋白次數(shù)＞振蕩時間＞多糖溶液與Sevag試劑比例＞氯仿與正丁醇比例。極差分析各因素水平間的最佳效果是C3D1A1B2，與蛋白質(zhì)脫除率的影響基本一致，由此確定鹿藥多糖脫蛋白的最佳工藝為多糖溶液（2 mg/mL）與Sevag試劑的體積比為2∶1，氯仿與正丁醇體積比為4∶1，脫蛋白6次，每次振蕩15 min。

2.5 樣品測定 按照脫蛋白最佳工藝條件對鹿藥分級沉淀所得的70%、80%、90%乙醇沉淀多糖進(jìn)行脫蛋白處理，測定脫蛋白前、后多糖的蛋白質(zhì)含量和多糖含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品脫蛋白測定

可見，Sevag法脫蛋白后SJP1和SJP2的多糖保留率大于95%，SJP3的接近90%；蛋白質(zhì)脫除率都在72%以上，說明本實驗確定的Sevag法脫蛋白工藝適合于鹿藥粗多糖的純化。

3 討 論

水的溶解范圍廣泛，水提多糖，溶液中除多糖外，還含有蛋白質(zhì)、無機鹽等多種成分。水提后采用醇沉法可去除一些小分子量的物質(zhì)而得到較純的多糖，本實驗中采用乙醇分級沉淀鹿藥多糖，所得70%、80%和90%乙醇沉淀多糖的多糖含量分別為91.12%、97.37%、66.64%，三者有明顯差別，也說明三者的不同，所以采用水提，乙醇分級沉淀法，不僅可富集得到鹿藥多糖，并且也實現(xiàn)了鹿藥粗多糖的初步分離。

目前植物多糖除蛋白質(zhì)的常用方法有：Sevag法、三氯乙酸法、天然澄清劑法、蛋白酶法、透析法、樹脂法、反復(fù)凍融法等［14－15］，以及幾種方法聯(lián)用。其中Sevag法是實驗室中普遍采用的方法。本研究通過單因素及多因素正交試驗確立了Sevag法去除鹿藥粗多糖蛋白質(zhì)的優(yōu)化工藝為：多糖溶液（2 mg/mL）與Sevage試劑的體積比為2∶1，三氯甲烷與正丁醇體積比為4∶1，脫蛋白6次，每次振蕩15 min，其中脫蛋白次數(shù)和振蕩時間是主要影響因素。本研究所確定的最佳工藝與文獻(xiàn)確定的最佳工藝基本一致［16］，由此可見，采用Sevag法脫除植物多糖中的蛋白質(zhì)不僅簡便易行，且從方法學(xué)角度來看是穩(wěn)定性、重復(fù)性、再現(xiàn)性都比較好的方法，不失為多糖脫蛋白的常用方法。

目前，在天然產(chǎn)物化學(xué)研究領(lǐng)域里對多糖的提取分離、藥理、藥效等方面的研究比較廣泛，如同Sevag法脫多糖蛋白已經(jīng)成型一樣，各種研究日臻成熟，但是由于多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使得多糖結(jié)構(gòu)分析、構(gòu)效關(guān)系、生物學(xué)功能及機理等方面還存在許多問題需要去解決，期待未來研究多糖可以象研究蛋白質(zhì)、核酸那樣，更好的實現(xiàn)研究的自動化。

［1］金征宇，顧正彪，童群義，等.碳水化合物化學(xué)——原理與應(yīng)用［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008.

［2］董群，方積年.多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用［J］.中國藥學(xué)雜志，2001，36（10）：649－652.

［3］Leung MY K，Liu C，Koon JCM，etal.Polysaccharide biological responsemodifiers［J］.Immunology letters，2006，105（2）：101－114.

［4］王小紅，余新民，沈祝蘋，等.香菇多糖聯(lián)合化療對晚期結(jié)腸癌患者的臨床療效［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，11（17）：65－69.

［5］張英楠，楊樹寶，單春蘭，等.刺五加多糖對雛雞脾臟中T、B淋巴細(xì)胞定位分布的影響［J］.中國獸藥雜志，2016，50（4）：35－40.

［6］石軼男，楊絨娟，扆妍妍，等.黨參多糖可溶性粉對肉仔雞血清ND抗體水平、IgG及腸道SIgA含量的影響［J］.中國獸藥雜志，2016，50（9）：47－52.

［7］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2008：2235－2236.

［8］安曉云，慈嘉，申瓊.鹿藥組織培養(yǎng)的研究［J］.中國園藝文摘，2010，26（10）：13－15.

［9］趙淑杰，韓梅，韓忠明，等.高速逆流色譜分離與鑒定鹿藥中黃酮類化合物［J］.分析化學(xué)，2009，37（9）：1354－1358.

［10］Liu X，Zhang H，Niu X F，et al.Steroidal saponinsfromSmilacina japonica［J］.Fitoterapia，2012，83（4）：812－816.

［11］趙淑杰，韓忠明，李彥穎，等.鹿藥提取物清除羥基自由基的研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.2010，31（2）：59－62

［12］ShuJie Zhao，HanYu Xu，Yang Zhan，et al.Ultrasonic extraction and determination of polysaccharide from Smilacina japonica.［J］.European Journal of BioMedical Research，2016（1）：53－56.

［13］崔喜艷主編.基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗方法和技術(shù)［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2007：62－62.

［14］侯小濤，趙超超，鄧家剛.甘蔗葉多糖除蛋白工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（20）：240－245.

［15］Yang W F，Wang Y，Li X P，et al.Purification and structural characterization ofChinese yampolysaccharide and its activities［J］.Carbohydrate Polymers，2015，117：1021－1027.

［16］趙海運，王慶奎，邢克智，等.黃芪多糖除蛋白質(zhì)方法與條件優(yōu)化［J］.天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2009，16（4）：5－8

（編輯：陳希）

Study on the Orthogonal Experiment Design of Removing Protein from Polysaccharide ofSm ilacina japonica

ZHAO Shu－jie1，ZHENG Li－ning1，LU Piao－piao1，HONG Bo1，YANG Li－min2，HAN Zhong－ming2
（1.College ofResourcesand Environment，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；2.College ofChinese Medicinal Materials，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China）

To optimize the technology of removing protein from crude polysaccharide ofSmilacina japonica.The Sevagmethod was used remove the protein，bovine serum albumin as the standard test protein content，glucose as the standard test polysaccharide content.The effectof removing protein according to the index of the removal protein rate，the polysaccharide retention rate and comprehensive score，through orthogonal experiment study the ratio of chloroform and nbutyl alcohol，the ratio of polysaccharide solution and Sevag solution，oscillation time，elution times and so on.The optimizing parameters for the removing protein ofSmilacina japonicapolysaccharide were chloroform∶butanol＝4∶1，polysaccharide solution∶Sevag reagent＝2∶1，6 times，15 min of each time.According to the comprehensive evaluation，the significant factors are the oscillation time and the frequency.This optimum technology of Sevagmethod to removing protein is stable，and the method is simple and effective.It can improve the purity of polysaccharide.

Smilacina japonica；polysaccharide；Sevagmethod；removing protein；process optimization

2016－11－28

A

1002－1280（2017）04－0025－04

R284.1

吉林省自然科學(xué)基金（20140101128JC）

趙淑杰，副教授，從事天然產(chǎn)物化學(xué)方面研究。E－mail：zhsjlong＠163.com