bcl-3基因通過(guò)cyclin D1及Bax蛋白影響人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的凋亡*

王少敏， 葉 孟， 倪曙民， 葉小磊

(1 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，2寧波市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，浙江 寧波 315020)

bcl-3基因通過(guò)cyclin D1及Bax蛋白影響人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的凋亡*

王少敏1， 葉 孟1， 倪曙民1， 葉小磊2△

(1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，2寧波市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，浙江 寧波 315020)

目的： 研究bcl-3基因?qū)θ私Y(jié)腸癌RKO細(xì)胞遷移及凋亡的影響及機(jī)制。方法: 采用人bcl-3基因的RNA干擾慢病毒載體沉默人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞bcl-3基因的表達(dá)后，劃痕實(shí)驗(yàn)觀察bcl-3基因沉默前后RKO細(xì)胞遷移能力的變化，Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)bcl-3基因沉默前后RKO細(xì)胞凋亡率的變化，Western blot法檢測(cè)bcl-3基因沉默前后細(xì)胞周期蛋白cyclin D1及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的變化。結(jié)果: 劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，劃痕后36 h，bcl-3基因沉默前后RKO細(xì)胞劃痕愈合率分別為84.00%及40.00%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Annexin V/PI雙染色法流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，bcl-3基因沉默前后的RKO細(xì)胞均經(jīng)5 μmol/L順鉑處理24 h后，沉默前后的RKO細(xì)胞凋亡率分別為12.89%及59.67%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot法檢測(cè)顯示bcl-3基因沉默后cyclin D1蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，但Bcl-2表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)論: 沉默bcl-3基因后，RKO細(xì)胞遷移能力下降，凋亡率增加，并伴細(xì)胞周期蛋白cyclin D1及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)的變化。bcl-3基因可能通過(guò)改變cyclin D1及Bax蛋白的表達(dá)而影響RKO細(xì)胞的凋亡。

bcl-3 基因； 結(jié)直腸腫瘤； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞遷移

bcl-3基因定位于19q13。Bcl-3蛋白屬于IκB家族蛋白，具有調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的亞細(xì)胞轉(zhuǎn)位及其DNA結(jié)合活性。Bcl-3蛋白表達(dá)于多種實(shí)體腫瘤及血液腫瘤，在腫瘤的形成及發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，并與腫瘤的耐藥有一定的相關(guān)性[1-5]。同樣結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中均可見(jiàn)Bcl-3的高表達(dá)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中Bcl-3/NF-κB復(fù)合物可通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)而激活A(yù)KT生長(zhǎng)途徑[6]。Bcl-3在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)與預(yù)后也存在一定相關(guān)性[7]。另有研究顯示Bcl-3對(duì)炎癥相關(guān)的結(jié)直腸癌形成有著抑制作用[3]，因此Bcl-3蛋白對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響可能視細(xì)胞類型及環(huán)境而改變。本研究小組前期研究發(fā)現(xiàn)bcl-3基因高表達(dá)于大腸癌RKO細(xì)胞并可影響RKO細(xì)胞的增殖能力及藥物敏感性[8]。在前期沉默RKO細(xì)胞中bcl-3基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步研究Bcl-3對(duì)RKO細(xì)胞侵襲凋亡的影響及其機(jī)理。

材 料 和 方 法

1 材料

DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株RKO(中科院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù))；兔抗人cyclin D1多抗、Bax多抗、Bcl-2多抗及β-actin多抗(Santa Cruz)；HRP標(biāo)記的羊抗兔II抗(武漢博士德生物科技有限公司)；Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒(BD)；流式細(xì)胞儀(BD)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RKO細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中。3～4 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按規(guī)定的濃度接種培養(yǎng)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 pLKO.1-TRC-shRNA重組質(zhì)粒載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 構(gòu)建含有bcl-3 shRNA的慢病毒質(zhì)粒載體，進(jìn)行重組慢病毒顆粒包裝，慢病毒轉(zhuǎn)染RKO細(xì)胞后鑒定轉(zhuǎn)染效果，篩選成功沉默bcl-3基因表達(dá)的RKO細(xì)胞。同時(shí)將含空載體質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染的RKO細(xì)胞設(shè)為對(duì)照。將RKO細(xì)胞分設(shè)空載體組(vector組)及bcl-3 shRNA穩(wěn)定干擾組(bcl-3 shRNA組)。具體實(shí)驗(yàn)步驟及方法參見(jiàn)本研究小組前期發(fā)表的論文[8]。

2.3 Western blot實(shí)驗(yàn) 分別取vector組細(xì)胞及bcl-3 shRNA組細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞予以消化，接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照每樣品取60 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉過(guò)夜，加入 I 抗孵育2 h，TBST洗滌 10 min×3次，加入 II 抗室溫孵育1 h，TBST洗滌 10 min×3次，加顯色發(fā)光液，暗室內(nèi)顯影定影。每組3個(gè)復(fù)孔細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。掃描膠片后用Quantity One軟件分析各條帶的灰度值, 所得灰度值與對(duì)應(yīng)β-actin蛋白灰度值之比為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4 劃痕試驗(yàn) 分別取vector組細(xì)胞及bcl-3 sh-RNA組細(xì)胞加入6孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)，每孔加入約5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜后取單層融合的RKO細(xì)胞，用1 mL槍頭在細(xì)胞層上垂直劃痕，以PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在培養(yǎng)0 h、12 h、24 h及36 h后取樣拍照，用圖像分析軟件ImageJ 1.40G計(jì)算劃痕區(qū)的面積，根據(jù)細(xì)胞遷移面積分析細(xì)胞的遷移速度。劃痕愈合率=(實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的劃痕面積-觀察時(shí)點(diǎn)的劃痕面積)/實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的劃痕面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組3個(gè)復(fù)孔。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取適量vector組細(xì)胞及bcl-3 shRNA組細(xì)胞加入6孔培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜后，2組細(xì)胞均經(jīng)5 μmol/L終濃度順鉑處理24 h，收集經(jīng)過(guò)處理的RKO細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，用結(jié)合液按照約1×109/L密度進(jìn)行重懸細(xì)胞，取100 μL含細(xì)胞的重懸液(約1×105個(gè)細(xì)胞)。加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫(20～25 ℃)避光孵育15 min；加入5 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。加入400 μL結(jié)合液。1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組每次3個(gè)樣本。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 沉默bcl-3基因抑制RKO細(xì)胞的遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)表明，vector組細(xì)胞劃痕后12 h、24 h及36 h的劃痕愈合率分別為32.11%±7.01%、53.56%±14.06%及84.00%±13.01%。bcl-3 shRNA組細(xì)胞劃痕后12 h、24 h及36 h的劃痕愈合率分別為19.11%±3.33%、26.00%±3.61%及40.00%±7.73%。2組細(xì)胞在3個(gè)時(shí)點(diǎn)的劃痕愈合率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Migration ability of RKO cells was detected by wound healing assay. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsvector group.

圖1 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)RKO細(xì)胞遷移能力

2 沉默bcl-3基因促進(jìn)RKO細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡

細(xì)胞經(jīng)Annexin V/PI染色后行流式細(xì)胞術(shù)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，vector組及bcl-3 shRNA組的細(xì)胞在5 μmol/L終濃度順鉑處理24 h后細(xì)胞凋亡率為59.67%±8.92%，而vector組的細(xì)胞凋亡率為12.89%±5.88%，2組凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明沉默bcl-3基因后RKO細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡明顯增加，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Apoptotic rate was analyzed by flow cytometry with Annexin V/PI staining after using cisplatin to induce the apoptosis of RKO cells. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsvector group.

圖2 順鉑誘導(dǎo)RKO細(xì)胞凋亡后Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

3 沉默bcl-3基因?qū)yclin D1及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Vector組細(xì)胞及bcl-3 shRNA組細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的相對(duì)表達(dá)量分別為1.48±0.72及0.74±0.47 (P<0.05)，促凋亡蛋白Bax的相對(duì)表達(dá)量分別為0.87±0.28及1.46±0.44 (P<0.05)，抑凋亡蛋白Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量分別為1.03±0.37及0.81±0.32 (P>0.05)。因此沉默bcl-3基因后cyclin D1表達(dá)顯著下降，Bax表達(dá)顯著升高，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The relative expression levels of the proteins in the RKO cells were detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsvector group.

圖3 Western blot法檢測(cè)RKO細(xì)胞中蛋白的相對(duì)表達(dá)量

討 論

bcl-3基因最初在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病亞型的t(14;19) 易位中被發(fā)現(xiàn)。此后的研究顯示，Bcl-3蛋白在多種實(shí)體腫瘤中均可見(jiàn)過(guò)度表達(dá)，并可對(duì)促進(jìn)腫瘤形成的基因進(jìn)行調(diào)控，發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤形成及生長(zhǎng)的作用[1]。Bcl-3在胞核內(nèi)通過(guò)與p50 及p52 形成異源復(fù)合物而擔(dān)任轉(zhuǎn)錄激活劑或轉(zhuǎn)錄抑制劑，激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。Bcl-3蛋白的表達(dá)及激活可發(fā)現(xiàn)于膠質(zhì)瘤、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌、大腸癌、前列腺癌、黑色素瘤及多種皮膚腫瘤[1,9-10]。我們前期的研究表明，Bcl-3蛋白高表達(dá)于結(jié)腸癌RKO細(xì)胞中[8]，沉默bcl-3基因表達(dá)后，RKO細(xì)胞增殖能力下降，并對(duì)奧沙利鉑的敏感性增強(qiáng)。細(xì)胞凋亡受抑是腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要原因，會(huì)導(dǎo)致腫瘤的過(guò)度生長(zhǎng)。本研究顯示沉默bcl-3基因的表達(dá)后，順鉑誘導(dǎo)的RKO細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率顯著增加，這表明Bcl-3可通過(guò)增加細(xì)胞凋亡而影響RKO細(xì)胞生長(zhǎng)，這和我們前期的研究結(jié)果是一致的[8]。細(xì)胞凋亡的增加也有助于提高藥物敏感性，是潛在的治療途徑之一[11]。

Bcl-3對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移影響的研究顯示，ErbB2陽(yáng)性乳腺癌的小鼠在敲除bcl-3基因表達(dá)后轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)明顯減慢，但對(duì)腫瘤原發(fā)灶的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，同樣bcl-3基因敲除后ErbB2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力下降61%[12]。針對(duì)結(jié)直腸癌的研究顯示，抑制Bcl-3表達(dá)后可阻滯大腸癌細(xì)胞周期的G1/S期轉(zhuǎn)變，并通過(guò)降低c-Myc蛋白的表達(dá)而抑制腫瘤生長(zhǎng)[13]。結(jié)腸癌細(xì)胞核內(nèi)Bcl-3的表達(dá)與患者生存顯著相關(guān)，高表達(dá)預(yù)示生存期短[7]。目前Bcl-3對(duì)結(jié)直腸癌的侵襲遷移能力未見(jiàn)相關(guān)研究，本研究的劃痕實(shí)驗(yàn)顯示RKO細(xì)胞中沉默bcl-3基因后，RKO細(xì)胞的劃痕愈合率顯著降低，因此bcl-3基因影響結(jié)腸癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力，值得進(jìn)一步探索其在體內(nèi)是否有助于結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。

Bcl-3蛋白可靶向多種基因，誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制[14]。Westerheide等[15]在人類乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Bcl-3通過(guò)促進(jìn)cyclin D1的表達(dá)而增強(qiáng)G1期轉(zhuǎn)換，且Bcl-3使得Rb磷酸化程度增高。Park等[16]研究也表明，HBx上調(diào)Bcl-3后導(dǎo)致核內(nèi)p52/Bcl-3復(fù)合物增高，進(jìn)而導(dǎo)致cyclin D1上調(diào)表達(dá)，HBx這種cyclin D1上調(diào)方式可能在HBx介導(dǎo)的肝細(xì)胞肝癌形成及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近期研究同樣顯示，肝癌細(xì)胞中Bcl-3通過(guò)影響cyclin D1的表達(dá)而影響細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期[17]。本研究在結(jié)腸癌RKO細(xì)胞中的Western blot 分析結(jié)果顯示，沉默bcl-3基因可通過(guò)上調(diào)凋亡促進(jìn)蛋白Bax的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但沉默bcl-3基因后凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)下降不明顯，因此Bcl-2蛋白可能對(duì)Bcl-3促進(jìn)腫瘤形成的影響甚微。同樣我們觀察到沉默bcl-3基因表達(dá)后cyclin D1表達(dá)下降，cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白而具有促進(jìn)細(xì)胞由G期進(jìn)入S期，在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)并在其形成發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。因此，這些研究表明Bcl-3在多種腫瘤中通過(guò)調(diào)控cyclin D1的表達(dá)而影響腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展。

綜上所述，結(jié)合前期研究及本課題組的研究表明bcl-3基因在結(jié)直腸癌中可能通過(guò)抑制凋亡、影響細(xì)胞周期而促進(jìn)腫瘤的形成發(fā)展，機(jī)理上主要通過(guò)調(diào)控PI3K和mTOR信號(hào)途徑及影響c-Myc、AKT、Bax及cyclin D1等蛋白的表達(dá)。同樣bcl-3基因也影響著結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力。盡管bcl-3基因在結(jié)直腸癌中得到較多的闡明，但由于腫瘤本身是個(gè)分子生物學(xué)基礎(chǔ)復(fù)雜的疾病并涉及多種信號(hào)途徑，Bcl-3在結(jié)直腸癌中與其它信號(hào)蛋白調(diào)控關(guān)系及在侵襲轉(zhuǎn)移中作用機(jī)理等仍有待于進(jìn)一步研究，Bcl-3在結(jié)直腸癌中的臨床意義更值得進(jìn)一步探索。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of bcl-3 gene silencing on apoptosis of human colon cancer cell line RKO

WANG Shao-min1, YE Meng1, NI Shu-min1, YE Xiao-lei2

(1DepartmentofMedicalOncology,AffiliatedHospitalofMedicalCollege,NingboUniversity,2NingboInstituteofMedicalSciences,Ningbo315020,China.E-mail: 13780009482@163.com)

AIM: To investigate the effects ofbcl-3 gene on the migration and apoptosis of human colon cancer cell line RKO, and the changes of cyclin D1 and apoptosis-related proteins. METHODS: After silencing ofbcl-3 gene expression in human colon cancer cell line RKO by lentiviral vector with RNA interference, the changes of RKO cell migration ability were investigated by wound healing assay. The changes of RKO cell apoptotic rate afterbcl-3 gene silencing were detected by flow cytometry with Annexin V/PI staining. The protein expression of cyclin D1 and apoptosis-related proteins in the RKO cells afterbcl-3 gene silencing was determined by Western blot.RESULTS: The wound healing rates of the RKO cells were 84.00% and 40.00% before and afterbcl-3 gene silencing, respectively， with statistically significant difference (P<0.05). Annexin V/PI staining showed that the cell apoptotic rates were 12.89% and 59.67% before and afterbcl-3 gene silencing， respectively， when RKO cells were treated with 5 μmol/L cisplatin for 24 h, with statistically significant difference (P<0.05). The expression of cyclin D1 decreased, while the expression of Bax increased afterbcl-3 gene silencing (P<0.05). CONCLUSION: Afterbcl-3 gene silencing, the migration ability of RKO cells decreases, and the apoptotic rate increases， accompanying with the changes of cyclin D1 and Bax.bcl-3 gene can affect the apoptosis of RKO cells by changing the expression of cyclin D1 and Bax.

bcl-3; Colorectal neoplasms; Apoptosis； Cell migration

1000- 4718(2017)05- 0939- 05

2016- 07- 18

2017- 03- 17

寧波市社會(huì)發(fā)展科研項(xiàng)目(No. 2011C50010)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.029

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