C5aR在慢性移植物抗宿主病中的表達及其作用機制*

王玉連， 翁建宇△， 賴沛龍， 曾令基， 陳曉梅， 黃 欣， 耿素霞， 凌 偉， 羅成偉， 吳穗晶， 杜 欣

(1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510515； 2廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液科，廣東 廣州 510080)

·短篇論著·

C5aR在慢性移植物抗宿主病中的表達及其作用機制*

王玉連1,2， 翁建宇1,2△， 賴沛龍2， 曾令基2， 陳曉梅2， 黃 欣2， 耿素霞2， 凌 偉2， 羅成偉2， 吳穗晶2， 杜 欣2

(1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510515；2廣東省人民醫(yī)院/廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液科，廣東 廣州 510080)

目的： 探討補體5a(C5a)及其受體(C5aR)在慢性移植物抗宿主病(cGVHD)中的表達及其作用機制。方法: 用流式細胞術(shù)檢測20例cGVHD患者及9例健康供者外周血淋巴細胞中C5aR的表達及CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)在CD4+T細胞中的比例，并分析兩者的相關(guān)性；將體外分離培養(yǎng)小鼠脾細胞分為對照組及重組小鼠C5a蛋白(rmC5a)刺激組，用流式細胞術(shù)檢測2組Tregs在CD4+T細胞中的表達比例；另外，提取患者外周血單個核細胞進行體外培養(yǎng)，分為空白對照組及C5aR拮抗劑(C5aRA)組，用流式細胞術(shù)檢測2組Tregs在CD4+T細胞中的表達比例。結(jié)果: cGVHD患者外周血淋巴細胞表面C5aR的表達明顯增多，而Tregs在CD4+T細胞中的比例明顯減少，兩者呈顯著負性相關(guān)(P<0.05)；體外培養(yǎng)小鼠脾細胞結(jié)果顯示C5a下調(diào)Tregs在CD4+T細胞中的比例；而體外培養(yǎng)患者外周血單個核細胞顯示阻斷C5aR可上調(diào)Tregs在CD4+T細胞中的比例。結(jié)論: C5a/C5aR可能通過抑制Tregs的分化來介導(dǎo)cGVHD的發(fā)生發(fā)展。

補體5a； 補體5a受體； 慢性移植物抗宿主??； 調(diào)節(jié)性T細胞

慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease， cGVHD)是異基因造血干細胞移植(alloge-neic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)后非復(fù)發(fā)死亡的主要原因，主要表現(xiàn)為累及皮膚、口腔、眼睛、肺、肝臟等多器官的自身免疫樣疾病綜合癥，目前其發(fā)病機制尚不明確。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是一種重要的免疫抑制介質(zhì)，對控制allo-HSCT術(shù)后發(fā)生的cGVHD具有重要作用[1-2]。補體5a(complement 5a,C5a)作為補體系統(tǒng)活化產(chǎn)物中一種作用最強的過敏毒素，在固有免疫中發(fā)揮了重要作用，近年來有研究指出，C5a/C5a受體(C5a receptor,C5aR)系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用，能抑制Tregs的分化[3]，參與了自身免疫性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性球結(jié)膜炎及IgA腎病等自身免疫性疾病的病理生理過程[4-6]。那么，C5a/C5aR對慢性移植物抗宿主病的作用及其機制如何，迄今鮮少報道。本文主要研究C5a/C5aR在cGVHD中的表達及其意義。

材 料 和 方 法

1 標(biāo)本采集

20例cGVHD患者外周血標(biāo)本為2016年3月～12月期間就診于廣東省人民醫(yī)院血液科門診的病人，平均年齡29 歲(16～47歲)，女性5例；所有cGVHD患者均符合2014年NIH cGVHD診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；9例正常對照外周血標(biāo)本取自健康志愿者，平均年齡 27 歲(24～35歲)，女性3例，本實驗所有納入的人員均簽署知情同意書。

2 材料

6～8周雌性BALB/c小鼠(20～24 g)購自北京維通利華實驗動物中心，為SPF級動物?？剐∈驝D4-FITC、CD25-APC和Foxp3-PE抗體，抗人CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE和C5aR-APC抗體，CD3和CD28單抗，IL-2，F(xiàn)oxp3固定破膜劑均購自eBiscience；重組小鼠C5a(recombinant mouse C5a， rmC5a)蛋白購自R&D；C5aR拮抗劑(C5aR antagonist,C5aRA)購自Millipore；RPMI-1640及胎牛血清購自Gibco。本實驗所用動物均符合動物倫理管理委員會審查標(biāo)準(zhǔn)。

3 方法

3.1 流式細胞術(shù)檢測cGVHD患者及健康供者淋巴細胞中C5aR及Tregs的比例 C5aR流式細胞術(shù)的檢測：取肝素鈉抗凝外周血100 μL于流式管內(nèi)，加入C5aR-APC渦旋混勻，室溫避光孵育25 min，加入2 mL紅細胞裂解液，室溫避光10 min，300×g離心5 min，加入1 mL PBS清洗1次，加400 μL PBS重懸，應(yīng)用FACSCanto II流式細胞儀檢測；Tregs流式細胞術(shù)的檢測：取外周血100 μL于流式管內(nèi)，加入抗人CD4-FITC和CD25-APC渦旋混勻，室溫避光孵育25 min，加入固定破膜劑1 mL，稍混勻，30 min后加入破膜緩沖液2 mL，300×g離心5 min，去上層液體，稍混勻，加入胞內(nèi)抗體Foxp3-PE，避光孵育25 min，加入1 mL PBS清洗1次，加PBS 400 μL重懸上機檢測。

3.2 小鼠脾細胞體外培養(yǎng)及實驗分組 頸椎脫臼法處死BALB/c小鼠，75%乙醇浸泡3～5 min入超凈臺，無菌取出脾臟，去除脾臟周圍系膜組織，移入平皿內(nèi)用RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌、碾磨，收集細胞沖洗液制成單細胞懸液，過濾后用紅細胞裂解液破除紅細胞，RPMI-1640洗滌，用含10%胎牛血清的RPMI-1640重懸細胞至1×109/L，鋪板培養(yǎng)(每孔2×106細胞)，分為2組：空白對照組及rmC5a刺激組，分別加入抗小鼠CD3抗體(5 mg/L)、抗小鼠CD28抗體(2 mg/L)和IL-2(40 μg/L)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后收集細胞。

3.3 流式細胞術(shù)檢測體外培養(yǎng)細胞中Tregs的比例 收集體外培養(yǎng)細胞，500×g離心5 min，去上清；下層細胞加入1 mL PBS清洗2次，計數(shù)，重懸于PBS (密度1×1010/L)，取100 μL于流式管內(nèi)進行流式細胞術(shù)檢測，具體方法同3.1中Tregs檢測。

3.4 患者外周血單個核細胞的分離、培養(yǎng)及Tregs的流式檢測 取患者外周血約10 mL，加等量PBS稀釋全血，將稀釋血液等量緩慢鋪于Ficoll液上，室溫800×g離心20 min，將上層血漿層吸棄，吸取單個核細胞層于另一個新的無菌15 mL離心管中，加入適量PBS清洗1次，棄去上層清液，2 mL全培重懸，吸取10 μL于90 μL PBS中計數(shù)，即10倍稀釋計數(shù)；調(diào)整細胞濃度至1×109/L，鋪板培養(yǎng)(每孔1×106細胞)，分為2組：空白對照組及C5aRA組，加入抗人CD3抗體(5 mg/L)、抗人CD28抗體(2 mg/L)、IL-2(40 μg/L)和TGF-β(5 μg/L)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后收集細胞進行流式細胞術(shù)檢測，具體方法同3.1中Tregs檢測。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗所獲得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 cGVHD患者外周血淋巴細胞表面C5aR的表達增多

為確定C5a/C5aR信號通路與cGVHD發(fā)生機理的關(guān)系，我們首先通過流式細胞術(shù)比較了C5aR在cGVHD患者及健康供者外周血淋巴細胞表面的表達。如圖1所示，cGVHD患者外周血淋巴細胞表面C5aR的表達為(3.09±1.20)%，顯著高于健康供者(P<0.01)。

Figure 1.The expression of C5aR on lymphocytes in the peripheral blood detected by flow cytometry. The percentage of C5aR on lymphocytes was significantly increased in the cGVHD patients. Mean±SD.**P<0.01vshealth donor.

圖1 cGVHD患者外周血淋巴細胞表面C5aR表達明顯增多

2 cGVHD患者外周血CD4+T細胞中Tregs的比例降低

流式細胞術(shù)檢測cGVHD患者及健康供者外周血CD4+T細胞中Tregs的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cGVHD患者及健康供者CD4+T細胞中Tregs的比例分別為(1.83±0.99)%和(3.28±1.24)%,兩者有顯著差異(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The percentage of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells (Tregs) in CD4+T cells. Compared with healthy donors, the percentage of Tregs was significantly decreased in the cGVHD patients. Mean±SD.**P<0.01vshealth donor.

圖2 cGVHD患者外周血CD4+T細胞中Tregs比例降低

3 外周血淋巴細胞中C5aR表達與Tregs比例的聯(lián)系

對外周血淋巴細胞表面C5aR的表達與CD4+T細胞中Tregs的比例進行關(guān)聯(lián)性分析，我們發(fā)現(xiàn)兩者之間呈顯著負性相關(guān)，Pearson積矩相關(guān)系數(shù)為-0.418 (P<0.05)，見圖3。

4 重組小鼠C5a蛋白抑制CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的分化

為進一步確定C5aR對cGVHD的作用機制，我們通過重組小鼠C5a蛋白刺激小鼠脾細胞體外培養(yǎng)3 d，發(fā)現(xiàn)重組小鼠C5a 蛋白刺激組Tregs與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，重組小鼠C5a蛋白抑制Tregs的分化，見圖4。

Figure 3.Pearson correlation between the expression of C5aR on lymphocytes and the percentage of regulatory T cells (Tregs) in CD4+T cells, showing a significantly ne-gative correlation.

圖3 外周血淋巴細胞中C5aR表達與調(diào)節(jié)性T細胞比例的關(guān)聯(lián)性分析

5 C5aRA促進CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的分化

我們通過體外應(yīng)用C5aRA下調(diào)患者外周血單個核細胞中C5aR的表達，發(fā)現(xiàn)C5aRA組Tregs在CD4+T細胞中的比例顯著高于對照組(P<0.01)，C5aRA促進Tregs的分化，見圖5。

討 論

cGVHD仍是allo-HSCT后長期存活患者的主要并發(fā)癥，不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也是導(dǎo)致患者非復(fù)發(fā)死亡的主要原因。近年來，對于cGVHD的研究甚多，但其發(fā)病機制仍不明確。目前針對其發(fā)病機制的研究主要包括以下幾個方面：胸腺功能的損傷，調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量減少及功能缺陷，B細胞失調(diào)等[1]，且70%的cGVHD患者具有血清自身抗體的產(chǎn)生[8]。盡管基于這些發(fā)病機制涌現(xiàn)出大量新型免疫抑制劑，但除皮質(zhì)激素能在一定程度上緩解cGVHD癥狀外，其它治療方式療效欠佳，且現(xiàn)有的免疫抑制治療可導(dǎo)致惡性疾病復(fù)發(fā)、反復(fù)嚴(yán)重感染、繼發(fā)第二腫瘤以及cGVHD病情反復(fù)，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量[9-10]。因此，繼續(xù)探索cGVHD的發(fā)病機制，尋求更多有效的治療方式，在移植免疫研究領(lǐng)域中具有重要的意義。

Figure 4.rmC5a decreased the percentage of regulatory T-cells (Tregs) in the CD4+T-cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖4 重組小鼠C5a蛋白抑制調(diào)節(jié)性T細胞的分化

Figure 5.C5aRA increased the percentage of regulatory T cells (Tregs) in the CD4+T cells from PBMCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖5 C5aRA促進調(diào)節(jié)性T細胞的分化

C5a作為補體活化后產(chǎn)生的主要的致炎物質(zhì)，與其特異性受體結(jié)合后，參與了過敏、感染及自身免疫性疾病等多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。近年研究顯示C5aR在T細胞上表達缺陷能使異基因造血干細胞移植受者自身免疫性反應(yīng)減弱，并減弱T細胞介導(dǎo)急性GVHD的能力；藥物阻斷C5aR能降低急性GVHD的發(fā)生率[11]。在實體器官移植排斥中，各種原因?qū)е录毙云诜磻?yīng)蛋白的釋放、氧自由基等的產(chǎn)生，導(dǎo)致補體系統(tǒng)激活形成補體活化產(chǎn)物，從而損傷各系統(tǒng)組織或介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)。盡管補體系統(tǒng)在實體組織移植后的移植排斥中的作用已有報道，但C5a及其受體在異基因造血干細胞移植術(shù)后發(fā)生的cGVHD中的作用機制仍未可知，據(jù)此，我們圍繞C5a/C5aR在慢性移植物抗宿主病患者外周血淋巴細胞中的表達及其作用機制展開了系統(tǒng)的檢測。在本研究中，我們檢測了cGVHD患者及健康供者外周血淋巴細胞中C5aR的表達，發(fā)現(xiàn)cGVHD患者外周血淋巴細胞中C5aR的表達顯著高于健康供者，提示C5aR與cGVHD密切相關(guān)。

Tregs是一種具有抑制自身反應(yīng)性的淋巴細胞，控制自然免疫反應(yīng)自然發(fā)生的T細胞，在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟[12-13]。異基因造血干細胞移植后影響了胸腺功能及Tregs的重建，導(dǎo)致了自身免疫反應(yīng)的發(fā)生，從而介導(dǎo)cGVHD的發(fā)生發(fā)展。我們通過檢測cGVHD患者及健康供者Tregs的比例發(fā)現(xiàn)cGVHD患者外周血CD4+T細胞中的Tregs的比例顯著低于健康供者，且Tregs的比例與C5aR的表達呈負性相關(guān)。為了進一步明確C5a/C5aR補體系統(tǒng)與Tregs分化的關(guān)系，我們體外培養(yǎng)了小鼠脾細胞，用重組小鼠C5a蛋白刺激3 d，結(jié)果提示C5a抑制Tregs的分化，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[14-15]；此外，我們體外培養(yǎng)了患者外周血單個核細胞，用C5aRA抑制C5aR的表達，發(fā)現(xiàn)C5aRA促進了Tregs的分化。因此，C5a/C5aR補體系統(tǒng)對cGVHD發(fā)生發(fā)展的作用機制可能是通過其對Tregs分化的抑制作用實現(xiàn)的。

目前，對于補體系統(tǒng)作用于各種自身免疫性疾病的機制研究日益增多，C5aR也已作為多種免疫性疾病動物模型甚至臨床上治療的靶點：抗C5aR抗體成功治療了抗磷脂抗體介導(dǎo)的不孕、流產(chǎn)及血栓形成，并在臨床少量抗磷脂抗體陽性的患者中得到證實[16]；另外，C5a/C5aR系統(tǒng)通過抑制Tregs的分化及其功能在過敏性哮喘，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及自身免疫性結(jié)腸炎的病理生理過程中起了重要作用，抗C5aR抗體在這些免疫性疾病的動物模型的治療上取得了較好的療效[17]。

綜上所述，我們認為C5a/C5aR系統(tǒng)可能通過抑制Tregs分化而介導(dǎo)cGVHD的發(fā)生發(fā)展。C5a/C5aR可能作為動物模型體內(nèi)及臨床上治療cGVHD的治療靶點，但仍需進一步研究。

[1] Min CK.The pathophysiology of chronic graft-versus-host disease: the unveiling of an enigma[J]. Korean J Hematol, 2011, 46(2):80-87.

[2] Leclerc M, Naserian S, Pilon C, et al. Control of GVHD by regulatory T cells depends on TNF produced by T cells and TNFR2 expressed by regulatory T cells [J]. Blood, 2016, 128(12):1651-1659.

[3] van der Touw W, Cravedi P, Kwan WH, et al. Cutting edge: receptors for C3a and C5a modulate stability of alloantigen-reactive induced regulatory T cells [J]. J Immunol, 2013, 190(12):5921-5925.

[4] Hashimoto M, Hirota K, Yoshitomi H, et al.Complement drives Th17 cell differentiation and triggers autoimmune arthritis [J]. J Exp Med, 2010, 207(6):1135-1143.

[5] Zhang L, Bell BA, Yu M, et al. Complement anaphylato-xin receptors C3aR and C5aR are required in the pathoge-nesis of experimental autoimmune uveitis[J]. J Leukoc Biol, 2016, 99(3):447-454.

[6] 宴現(xiàn)麗， 張 穎， 鄭立運， 等. C3a、C5a受體缺失減輕IgA腎病腎損傷[J]. 中國免疫學(xué)雜志, 2013, 31(9):1169-1172.

[7] Jagasia MH, Greinix HT, Arora M, et al. National Institutes of Health Consensus Development Project on Criteria for Clinical Trials in Chronic Graft-versus-Host Disease: I. The 2014 Diagnosis and Staging Working Group report [J]. Biol Blood Marrow Transplant, 2015, 21(3):389-401.

[8] 羅 浩， 柯 丹. 移植物抗宿主病和移植物抗白血病效應(yīng)的發(fā)生機制及分離策略的研究進展 [J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(12):2423-2428.

[6] Fraser CJ, Bhatia S, Ness K, et al. Impact of chronic graft-versus-host disease on the health status of hematopoietic cell transplantation survivors: a report from the Bone Marrow Transplant Survivor Study[J]. Blood, 2006, 108(8):2867-2873.

[10]Arai S, Sahaf B, Narasimhan B, et al. Prophylactic rituximab after allogeneic transplantation decreases B-cell alloimmunity with low chronic GVHD incidence[J]. Blood, 2012, 119(25):6145-6154.

[11]Kwan WH, Hashimoto D, Paz-Artal E, et al. Antigen-presenting cell-derived complement modulates graft-versus-host disease[J]. J Clin Invest, 2012, 122(6):2234-2238.

[12]Piccirillo CA, Shevach EM. Naturally-occurring CD4+CD25+immuno-regulatory T cells: central players in the arena of peripheral tolerance[J]. Semin Immunol, 2004,16(2):81-88.

[13]Zorn E, Kim HT, Lee SJ, et al. Reduced frequency of FOXP3+CD4+CD25+regulatory T cells in patients with chronic graft-versus-host disease[J]. Blood, 2005, 106(8):2903-2911

[14]Gunn L, Ding C, Liu M, et al. Opposing roles for complement component C5a in tumor progression and the tumor microenvironment[J]. J Immunol, 2012, 189(6):2985-2994.

[15]Weaver DJ Jr, Reis ES, Pandey MK, et al. C5a receptor-deficient dendritic cells promote induction of Treg and Th17 cells[J]. Eur J Immunol, 2010, 40(3):710-721.

[16]Erkan D, Salmon JE. The role of complement inhibition in thrombotic angiopathies and antiphospholipid syndrome[J]. Turk J Haematol, 2016, 33(1):1-7.

[17]Clarke EV, Tenner AJ. Complement modulation of T cell immune responses during homeostasis and disease[J]. J Leukoc Biol, 2014, 96(5):745-756.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Increased expression of C5aR is associated with reduced Tregs in chronic graft-versus-host disease

WANG Yu-lian1, 2, WENG Jian-yu1, 2, LAI Pei-long2, ZENG Ling-ji2, CHEN Xiao-mei2, HUANG Xin2, GENG Su-xia2, LING Wei2, LUO Cheng-wei2, WU Sui-jing2, DU Xin2

(1SecondClinicalCollege,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofHematology,GuangdongGeneralHospital/GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:wengjianyu1969@163.com)

AIM: To investigate the expression and potential role of complement 5a receptor (C5aR) in chro-nic graft-versus-host disease (cGVHD).METHODS: The expression of C5aR on lymphocytes and the frequency of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells (Tregs) in 20 cGVHD patients and 9 healthy donors was detected by flow cytometry. The correlation between the expression of C5aR and the percentage of Tregs in the cGVHD patients was analyzed. In addition, the splenocytes from the mice were culturedinvitro, and stimulated these splenocytes with recombinant mouse C5a protein (rmC5a). The peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from cGVHD patients were culturedinvitro, which was inhibited by C5aR antagonist (C5aRA). The frequency of Tregs in these splenocytes and the PBMCs were evaluated by flow cytometry.RESULTS: The expression of C5aR on the lymphocytes was significantly increased in the cGVHD patients compared with the healthy donors, while the percentage of Tregs was markedly lower in the cGVHD patients. The expression of C5aR was negatively correlated with the percentage of Tregs. Furthermore, the development of Tregs was suppressed by rmC5a stimulation， but was promoted by C5aRAinvitro.CONCLUSION: C5aR elevation is associated with Treg reduction in cGVHD, indicating that C5aR may play a potential role in suppressing Tregs, resulting in the incidence of cGVHD.

Complement 5a; Complement 5a receptor; Chronic graft-versus-host disease; Regulatory T cells

1000- 4718(2017)05- 0925- 06

2016- 10- 14

2017- 01- 24

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81270648; No. 81300446)

R392.32

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.026

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