辛二酰苯胺異羥肟酸誘導(dǎo)大鼠原代肝星狀細(xì)胞凋亡*

劉 幸， 田 甜， 余 蕾， 詹 瑋， 韓 冰， 謝汝佳， 楊 婷， 羅新華， 楊 勤

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550000)

辛二酰苯胺異羥肟酸誘導(dǎo)大鼠原代肝星狀細(xì)胞凋亡*

劉 幸， 田 甜， 余 蕾， 詹 瑋， 韓 冰， 謝汝佳， 楊 婷， 羅新華， 楊 勤△

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550000)

目的： 通過研究辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)對大鼠原代肝星狀細(xì)胞(HSCs)凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討SAHA誘導(dǎo)HSCs凋亡的作用機(jī)制。方法: 采用OptiPrep梯度離心法分離大鼠原代HSCs；通過實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)檢測SAHA對HSCs增殖的影響；倒置顯微鏡觀察不同濃度SAHA處理HSCs后的形態(tài)變化；熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡率；Western blotting法檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原、金屬蛋白酶組織抑制物1(TIMP1)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和組蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的蛋白表達(dá)；免疫共沉淀法檢測GRP78蛋白與HDAC6蛋白是否形成復(fù)合物。結(jié)果: 成功分離的HSCs連續(xù)培養(yǎng)14 d，HSCs逐漸由靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。 SAHA可顯著抑制HSCs增殖，且呈劑量時(shí)間依賴性(P<0.05)； SAHA對HSCs的促凋亡作用具有時(shí)間依賴性(P<0.05)。SAHA處理HSCs后， α-SMA、Ⅰ型膠原、HDAC6和TIMP1的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，GRP78的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與激活型的HSCs相比，SAHA處理后的HSCs中免疫共沉淀下的蛋白復(fù)合物中GRP78與總的乙?；嚢彼岬鞍罪@著增多，而HDAC6蛋白顯著降低，同時(shí)證明GRP78與HDAC6形成復(fù)合物。結(jié)論: SAHA抗肝纖維化的機(jī)制可能是，SAHA下調(diào)HDAC6蛋白表達(dá)水平，上調(diào)乙?；疓RP78蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)HSCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡，從而起到抗肝纖維化的作用。

肝星狀細(xì)胞； 辛二酰苯胺異羥肟酸； 肝纖維化； 細(xì)胞凋亡

各種慢性肝損傷因素如病毒、酒精、脂肪以及免疫因子導(dǎo)致肝細(xì)胞受損，壞死而產(chǎn)生并釋放大量炎性物質(zhì)，直接或間接地?fù)p害臨近的肝臟細(xì)胞，并引起肝Kupffer細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等合成分泌更多細(xì)胞因子及炎性物質(zhì)，作用于靜息狀態(tài)下的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)，使其活化增殖向肌成纖維樣細(xì)胞方向分化轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚虷SCs。激活型HSCs合成并分泌以Ⅰ型和Ⅲ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，同時(shí)分泌大量的金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)，抑制組織基質(zhì)金屬蛋白酶(tissue metalloproteinases，TMPs)對ECM的降解，使得過多的ECM在肝內(nèi)沉積[1-2]，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

近來的研究表明，辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)對血液系統(tǒng)疾病、骨髓瘤及肺纖維化有良好的治療作用，SAHA主要通過抑制組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)活性，干擾HDAC的募集功能，調(diào)控凋亡相關(guān)基因，抑制癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期阻滯、分化和凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤目的[3-4]。有研究報(bào)道，SAHA可通過調(diào)節(jié)p53和bax基因影響人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖和凋亡[5]。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察SAHA對HSCs增殖及凋亡的影響，探討SAHA有無促肝星狀細(xì)胞凋亡的作用及其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性Wistar大鼠，體重350～500 g，由貴州省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證編號為(黔)2003-01。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購自HyClone；胎牛血清購自Gibco；蛋白Marker購自Solarbio；二甲基亞砜購自北京鼎國公司；細(xì)胞裂解液、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和噻唑藍(lán)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀(jì)有限公司；山羊抗兔IgG以及抗β-actin、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、TIMP1、I型膠原和HDAC6抗體均購自武漢博士德有限公司；兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)購自Abcam；免疫共沉淀試劑盒購自Thermo Scientific；SAHA購自上海瀚香生物科技公司。

3 主要方法

3.1 大鼠原代肝星狀細(xì)胞分離與培養(yǎng) 參考戴春蕾等[6]的實(shí)驗(yàn)方法，分離大鼠HSCs，用1 mL含20%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率。用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～2)×1010/L，接種于10 cm無包被塑料培養(yǎng)皿中，倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化情況，并置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后換液，以后根據(jù)細(xì)胞生長狀況，2～3 d換液1次。

3.2 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)檢測SAHA對HSCs細(xì)胞增殖的影響 取E-plate16細(xì)胞增殖檢測板，每孔加入培養(yǎng)液50 μL，放入RTCA DP設(shè)備中檢測背景值，然后將細(xì)胞消化懸浮于含有血清的培養(yǎng)液中，吹打均勻調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L，接種E-plate 16細(xì)胞增殖檢測板，置于37 ℃、5 % CO2及飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中穩(wěn)定30 min后，對照組為不含SAHA的全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組SAHA終濃度為分別為1、5和10 μmol/L進(jìn)行動態(tài)檢測72 h，觀察細(xì)胞增殖曲線。

3.3 倒置顯微鏡觀察HSCs細(xì)胞形態(tài)變化 靜止型的HSCs連續(xù)培養(yǎng)12 d以上，HSCs由靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榧せ钚偷腍SCs，待細(xì)胞融合成片，分為對照組(DMEM培養(yǎng)基)和實(shí)驗(yàn)組(5 μmol/L SAHA)。觀察SAHA處理HSCs 48 h后的形態(tài)變化。

3.4 凋亡原位熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)5 μmol/L SAHA處理后HSCs 細(xì)胞的凋亡 HSCs由靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榧せ钚偷腍SCs，待細(xì)胞融合成片進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)分對照組以及5 μmol/L SAHA處理HSCs 24 h、48 h和72 h組；培養(yǎng)結(jié)束后，按Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

3.5 Western blotting法檢測α-SMA、TIMP1、I型膠原、GRP78和HDAC6蛋白的表達(dá) 收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，提取蛋白。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加入對應(yīng)抗體，4 ℃過夜。次日，TBST洗膜后加入對應(yīng) II 抗，室溫孵育90 min，ECL發(fā)光成像，用ImageLab圖像分析軟件對每個(gè)條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

3.6 免疫共沉淀法檢測GRP78與HDAC6是否形成復(fù)合物 免疫共沉淀試劑盒說明書操作，單個(gè)IP，取10 μL GRP78單克隆抗體與50 μL AminoLink偶聯(lián)樹脂進(jìn)行交聯(lián)固定，陰性對照組為正常兔IgG，按照10 μL兔IgG與50 μL AminoLink偶聯(lián)樹脂進(jìn)行交聯(lián)固定，將固定好的AminoLink-GRP78和AminoLink-IgG復(fù)合物置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＝酉聛韺㈩A(yù)冷的IP裂解液按照試劑盒要求每10 cm培養(yǎng)皿中加入500 μL IP裂解液，冰上孵育5 min，收集細(xì)胞裂解液于離心管中，13 000×g離心10 min，棄沉淀，收集上清于新的離心管中，然后用對照瓊脂糖樹脂預(yù)處理各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞裂解液，以去除免疫共沉淀過程中非特異性結(jié)合的蛋白，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組取10 μL上清液留作input。接下來進(jìn)行免疫共沉淀，向交聯(lián)好的單個(gè)IP的抗體復(fù)合物AminoLink-GRP78和AminoLink-IgG 中分別加入對應(yīng)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞裂解液200 μL，4 ℃搖床過夜。洗脫與AminoLink-GRP78和AminoLink-IgG結(jié)合的目的蛋白復(fù)合物，收集洗脫液于新的離心管中，制備蛋白樣品，向樣品中加入試劑盒配備的上樣緩沖液，置于金屬水浴鍋中100 ℃、5 min，冷卻至室溫，進(jìn)行電泳。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)；兩組樣本均數(shù)比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠原代HSCs提取及培養(yǎng)

普通光學(xué)顯微鏡下觀察分離出的HSCs，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，細(xì)胞得率為每只4×107個(gè)。0.4%臺盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活率為97%。光學(xué)顯微鏡下觀察分離的HSCs為折光性強(qiáng)的圓球形小體，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞逐漸貼壁，形態(tài)發(fā)生明顯改變，由圓球形變?yōu)闄E圓型、梭型、T型、不規(guī)則三角形，連續(xù)培養(yǎng)14 d，HSCs 融合成片，完全活化，見圖1。

Figure 1.The morphological changes during the culture of hepa-tic stellate cells isolated from the rats (×200). A: the ratinsituperfusion; B: the gradient centrifugation; C: 0 h after isolation; D: 14 d after isolation.

圖1 大鼠原代HSCs提取及體外培養(yǎng)過程中大鼠原代HSCs的形態(tài)學(xué)變化

2 RTCA 檢測SAHA對HSCs增殖的影響

與對照組相比，SAHA能夠顯著抑制HSCs增殖，并呈現(xiàn)時(shí)間劑量依賴性。1、5和10 μmol/L的SAHA培養(yǎng)HSCs 24 h、48 h和72 h后均能顯著抑制HSCs增殖(P<0.05)，見圖2、表1。

Figure 2.The time-effect curves of HSCs treated with SAHA.n=5.

圖2 SAHA對HSCs增殖的時(shí)-效曲線

3 不同濃度的SAHA對HSCs細(xì)胞形態(tài)的影響

不同濃度SAHA處理HSCs 48 h后，形態(tài)發(fā)生顯著改變；1 μmol/LSAHA處理HSCs 48 h后，少數(shù)細(xì)胞體積縮小，上清液中可見少許漂浮細(xì)胞；以5及10 μmol/L的SAHA處理HSCs后，細(xì)胞增殖明顯被抑制，活細(xì)胞數(shù)目減少、發(fā)生貼壁不良、折光率差等形態(tài)變化，見圖3。

表1 SAHA對HSCs增殖的影響

Table 1.The effects of SAHA on the proliferation of HSCs (Mean±SD.n=3)

Group24h48h72hControl4.353±0.2016.251±0.0095.154±0.0371μmol/LSAHA4.294±0.242*4.743±0.007*3.150±0.034*5μmol/LSAHA6.133±0.008*4.307±0.042*1.722±0.033*10μmol/LSAHA5.524±0.226*3.958±0.019*1.307±0.024*

*P<0.05vscontrol group.

Figure 3.The effect of SAHA on the morphological changes of HSCs observed under inverted microscope (×200).

圖3 SAHA處理HSCs 48 h對細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響

4 5 μmol/L SAHA對HSCs凋亡的影響

5 μmol/L SAHA處理HSCs 24 h可見少許早期凋亡細(xì)胞，細(xì)胞膜被染成綠色，細(xì)胞核被染成紅色；48 h可見較多細(xì)胞膜被染色，72 h，大部分細(xì)胞膜不完整，細(xì)胞核被PI染成紅色。隨著SAHA處理時(shí)間延長，HSCs的早期凋亡率和晚期凋亡率逐漸上升，24 h、48 h和72 h早期凋亡率為分別為(7.99±0.03)%、(9.59±0.23)%和(16.31±0.83)%，均高于對照組(P<0.05)，見圖4、5和表2。

Figure 4.The apoptosis of HSCs treated with 5 μmol/L SAHA at different time points (×200).

圖4 5 μmol/L SAHA處理HSCs不同時(shí)間對細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5.The apoptosis of HSCs cells treated with 5 μmol/L SAHA at different time points.

圖5 SAHA 對HSCs凋亡的影響

表2 5 μmol/L SAHA對 HSCs凋亡率的影響

Table 2.The effects of SAHA at 5 μmol/L on the apoptotic rate of HSCs cells (%. Mean±SD.n=3)

GroupEarlystageLaterperiodControl0.33±0.031.33±0.06SAHA/24h7.99±0.53*2.52±0.04*SAHA/48h9.59±0.23*7.66±0.22*SAHA/72h16.31±0.83*12.09±0.28*

*P<0.05vscontrol group.

5 5 μmol/L SAHA處理HSCs 48 h 對α-SMA、TIMP1、I型膠原、GRP78和HDAC6表達(dá)的影響

5 μmol/L SAHA處理HSCs細(xì)胞48 h后，HSCs細(xì)胞中α-SMA、TIMP1、HDAC6及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；而GRP78蛋白表達(dá)水平較對照組顯著升高(P<0.05)，見圖6、7。

6 GRP78和HDAC6在HSCs中形成復(fù)合物

在激活型HSCs中和經(jīng)SAHA處理后的HSCs中均檢測到GRP78與HDAC6形成復(fù)合物，見圖8。

討 論

HSCs的凋亡與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，HSCs由靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，激活型的HSCs合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，

Figure 6.The protein expression of α-SMA, TIMP1 and collagen I in active HSCs treated with or without SAHA. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖6 經(jīng)SAHA處理后的激活型HSCs中α-SMA、 I型膠原和TIMP1蛋白表達(dá)的變化

Figure 7.The protein expression of HDAC6 and GRP78 in active HSCs treated with or without SAHA. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖7 經(jīng)SAHA處理后的激活型HSCs中HDAC6和GRP78蛋白表達(dá)

Figure 8.Identification of GRP78, HDAC6 and ac-lysine by Co-IP and Western blotting.

圖8 Western blotting檢測Co-IP 分離HSCs的GRP78、HDAC6和乙?；痩ysine蛋白水平

沉積在細(xì)胞間隙，導(dǎo)致肝纖維化[7]。因此，尋求有效誘導(dǎo)HSCs凋亡的藥物是防治肝纖維化的關(guān)鍵。

SAHA中文名伏立諾他，是美國食品藥品管理局批準(zhǔn)的第一個(gè)可以用于臨床的制劑。有體外研究表明，SAHA在納摩爾級濃度即可抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6的活性，且可特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對正常細(xì)胞毒副作用小[8]。

本實(shí)驗(yàn)用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)的檢測結(jié)果提示，不同濃度SAHA隨著作用時(shí)間的延長，與對照組相比HSCs增殖明顯下降。倒置顯微鏡下可見HSCs形態(tài)發(fā)生顯著變化，部分HSCs發(fā)生貼壁不良，折光性差等改變。正常HSCs不會被Annexin-V FITC/PI染色，在細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期，細(xì)胞膜電位和線粒體膜電位下降，膜流動性降低，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了重排，一些在細(xì)胞膜內(nèi)部的生物大分子如磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)基團(tuán)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)暴露到細(xì)胞膜外側(cè)，Annexin-V FITC可以特異性標(biāo)記磷脂酰絲氨酸基團(tuán)，進(jìn)而識別發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞；在細(xì)胞凋亡晚期，細(xì)胞膜的完整性幾乎全部遭到破壞，PI直接與DNA結(jié)合，發(fā)出紅色熒光；通過流式細(xì)胞術(shù)觀察到5 μmol/L SAHA能有效誘導(dǎo)HSCs凋亡，具有潛在的抗肝纖維化作用。

有文獻(xiàn)報(bào)道，SAHA可以明顯降低TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維化細(xì)胞ILF細(xì)胞株α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)水平，起到抗肺纖維化的作用[9]。α-SMA是HSCs由靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)的重要標(biāo)志物?；罨腍SCs合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，Ⅰ型膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一。有文獻(xiàn)報(bào)道靜止?fàn)顟B(tài)的HSCs主要表達(dá)MMP-1，不表達(dá)TIMP-1，活化的HSCs 中TIMP-1表達(dá)明顯升高，TIMP-1表達(dá)增高一定程度上反映了HSCs活化的狀態(tài)及細(xì)胞外基質(zhì)堆積情況[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SAHA明顯降低激活型HSCs中α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白及TIMP-1表達(dá)水平，提示SAHA有一定的抗肝纖維化作用。

近來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與GRP78蛋白乙?；兄芮械穆?lián)系，有文獻(xiàn)報(bào)道：去乙?；敢种苿┡帘人舅T導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡與GRP78乙酰化水平增高有關(guān)，主要是通過帕比司他抑制HDAC6蛋白的表達(dá)，激活乳腺癌細(xì)胞中未折疊蛋白反應(yīng)，發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡[11]。另外還有文獻(xiàn)報(bào)道，帕比司他在硼替佐米的協(xié)同作用下誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制了腎癌細(xì)胞增殖和蛋白泛素化堆積[12]。帕比司他是新型羥肟酸類去乙?；敢种苿瑢DAC6有較強(qiáng)的選擇性，SAHA是一種廣泛的羥肟酸類去乙酰化酶抑制劑，對HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6都有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)SAHA可降低HDAC6蛋白表達(dá)水平，升高GRP78蛋白表達(dá)水平；進(jìn)一步采用免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)GRP78與HDAC6形成復(fù)合物，由此說明GRP78與HDAC6存在相互作用。另外，SAHA處理組HSCs中GRP78蛋白復(fù)合物中乙酰化lysine水平顯著升高，更進(jìn)一步說明SAHA處理組HSCs中GRP78乙酰化水平升高。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白[13]，GRP78持續(xù)增高會誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)HSCs凋亡。綜上所述，SAHA抗肝纖維化的機(jī)制可能通過SAHA下調(diào)HDAC6蛋白表達(dá)水平，上調(diào)乙?；疓RP78蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)HSCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡，起到抗肝纖維化的作用。

[1] 戴 晴， 李 欣， 鄭 磊， 等. 丹參素對肝星狀細(xì)胞TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響[J]. 中國病理生理雜志，2009, 25(10):1988-1994.

[2] 張錦生. 蛋白質(zhì)乙?；c肝纖維化[J]. 世界華人消化雜志，2012,20(36):3621-3624.

[3] Shi ZJ, Ouyang DY, Zhu JS, et al. Histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid exhibits anti-inflammatory activities through induction of mitochondrial damage and apoptosis in activated lymphocytes[J]. Int Immunopharmacol, 2012, 12(4):580-587.

[4] 于 濤， 張 鵬， 鹿全意， 等. 組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡[J]. 中國組織工程研究, 2012, 16(6):1062-1066.

[5] 王迎春， 邢蘭花， 楊 旭， 等. 辛二酰苯胺異羥肟酸對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J]. 實(shí)用肝臟雜志, 2013, 16(6):532-535.

[6] 戴春蕾， 陳少隆， 陳黎黎， 等. Optiprep 梯度離心法提取大鼠肝星狀細(xì)胞的研究[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志， 2013, 42(1):142-144.

[7] 田 甜， 張金娟， 羅新華， 等. 大鼠原代肝星狀細(xì)胞活化后組蛋白修飾水平觀察[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(10):871-876.

[8] 張 玥， 蘇明波， 周宇波. 組蛋白去乙?；?(HDAC6)抑制劑分子水平高通量篩選模型的建立[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2012(8):181-188.

[9] Sanders YY, Hagood JS, Liu H, et al. Histone deacetylase inhibition promotes fibroblast apoptosis and ameliorates pulmonary fibrosis in mice[J]. Eur Respir J, 2014, 43(5):1448-1458.

[10]杜 超， 程雙平. 基質(zhì)金屬蛋白-1與肝纖維化的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2015, 21(13):2321-2323.

[11]Rao R, Nalluri S, Kolhe R, et al. Treatment with panobinostat induces glucose-regulated protein 78 acetylation and endoplasmic reticulum stress in breast cancer cells[J]. Mol Cancer Ther, 2010, 9(4):942-952.

[12]Sato A, Asano T, Isono M, et al. Panobinostat synergizes with bortezomib to induce endoplasmic reticulum stress and ubiquitinated protein accumulation in renal cancer cells[J]. BMC Urol, 2014, 14:71.

[13]Zhang XQ, Xu CF, Yu CH, et al. Role of endoplasmic reticulum stress in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease[J]. World J Gastroenterol, 2014, 20(7):210-215.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Suberoylanilide hydroxamic acid induces apoptosis of rat hepatic stellate cellsinvitro

LIU Xing, TIAN Tian, YU Lei, ZHAN Wei, HAN Bing, XIE Ru-jia, YANG Ting, LUO Xin-hua, YANG Qin

(DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550000,China.E-mail: qinyang@gmc.edu.cn)

AIM: To study the effects of suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) on the apoptosis of hepatic stellate cells (HSCs) and expression of associated proteins, and to investigate the mechanisms of SAHA to induce apoptosis. METHODS: The rat HSCs were isolated by OptiPrep gradient centrifugation method. The effect of SAHA on HSC proliferation was detected by real-time cell analyzer. The morphological changes of HSCs treated with SAHA at different concentrations were observed under inverted microscope. The apoptotic rates of HSCs were analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining and fluorescence microscopy. The protein expression of α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen I, tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1), glucose-regulated protein 78 (GRP78) and histone deacetylase 6 (HDAC6) was detected by Western blotting. The interaction of GRP78 with HDAC6 in the HSCs was determined by co-immunoprecipitation.RESULTS: HSCs were successfully isolated and cultured for 14 d, during which the HSCs changed gradually from rest state to active state. SAHA significantly inhibited the proliferation of HSCs in a time- and dose- dependent manner (P<0.05). The results of Western blotting showed that the protein expression levels of α-SMA, TIMP1, collagen-I and HDAC6 were significantly decreased (P<0.05), while GRP78 was significantly increased (P<0.05). Compared with activated HSCs, GRP78 and total acetyl-lysine protein were significantly increased in the co-immunoprecipitated HSCs treated with SAHA, while HDAC6 protein was significantly decreased, indicting that GRP78 formed a complex with HDAC6. CONCLUSION: The anti-hepatic fibrosis effect of SAHA may be related to down-regulation of HDAC6 and up-regulation of acetylated GRP78, thus inducing endoplasmic reticulum stress of HSCs and promoting the apoptosis of HSCs.

Hepatic stellate cells; Suberoylanilide hydroxamic acid; Hepatic fibrosis; Apoptosis

1000- 4718(2017)05- 0913- 06

2016- 11- 30

2017- 03- 02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81160064)；省衛(wèi)計(jì)委基金資助項(xiàng)目(No. gzwjkj2015-1-037)

R575.2+9； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.024

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel： 0851-86908489； E-mail： qinyang@gmc.edu.cn