軟脂酸對INS-1胰島細(xì)胞TXNIP表達(dá)的影響*

張 倩， 梁男男， 吳向征， 王 瑾， 趙嘉惠， 焦向英△

(山西醫(yī)科大學(xué) 1生理學(xué)教研室， 2轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心， 山西 太原 030001)

軟脂酸對INS-1胰島細(xì)胞TXNIP表達(dá)的影響*

張 倩1， 梁男男1， 吳向征1， 王 瑾1， 趙嘉惠2， 焦向英1△

(山西醫(yī)科大學(xué)1生理學(xué)教研室，2轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心， 山西 太原 030001)

目的： 2型糖尿病患者體內(nèi)持續(xù)高水平的游離脂肪酸會損傷胰島β細(xì)胞。硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP)是內(nèi)源性的硫氧還蛋白(Trx)抑制蛋白。已知高糖刺激可引起TXNIP表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡，而游離脂肪酸對TXNIP的影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在研究軟脂酸對TXNIP表達(dá)的影響及機(jī)制。方法: 在使用不同濃度和不同作用時間的軟脂酸充分預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定使用添加0.5 mmol/L軟脂酸的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)INS-1胰島細(xì)胞24 h，測定細(xì)胞TXNIP的表達(dá)變化、細(xì)胞凋亡情況及可能的調(diào)控因子變化。結(jié)果: 與對照組相比，軟脂酸組TXNIP的mRNA水平和蛋白表達(dá)量均明顯增高(P<0.01)，軟脂酸組凋亡明顯高于對照組(P<0.01)。軟脂酸組的核因子κB (NF-κB)蛋白磷酸化水平升高(P<0.01)，使用不同的NF-κB抑制劑PDTC和SN50均可阻斷軟脂酸誘導(dǎo)的TXNIP表達(dá)上調(diào)。結(jié)論: 飽和脂肪酸軟脂酸可通過增加NF-κB磷酸化而上調(diào)TXNIP的表達(dá)，從而誘導(dǎo)INS-1胰島細(xì)胞凋亡。

軟脂酸； INS-1細(xì)胞； 硫氧還蛋白相互作用蛋白； 核因子κB

糖尿病作為威脅人類健康的重要疾病，其主要發(fā)病機(jī)制在于胰島β細(xì)胞凋亡和功能異常[1-2]。在誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的眾多因素中，除高血糖引起的糖毒性以外，游離脂肪酸的脂毒性也扮演了重要的角色。研究表明，2型糖尿病患者體內(nèi)長期高水平的游離脂肪酸，特別是飽和脂肪酸可以引起胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能紊亂及β細(xì)胞凋亡的增加，進(jìn)而加重糖尿病[3-5]。

硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)又名VDUP1或TBP2，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一內(nèi)源性的硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)結(jié)合抑制蛋白[6]，在糖尿病各組織中其表達(dá)均顯著升高，已有大量研究證明高糖可引起TXNIP表達(dá)明顯升高，并介導(dǎo)β細(xì)胞凋亡[7-8]。而糖尿病時同時出現(xiàn)的游離脂肪酸升高對TXNIP表達(dá)的影響尚不明確。因此本課題旨在研究飽和脂肪酸軟脂酸(palmitate，PA)對INS-1胰島細(xì)胞TXNIP表達(dá)的影響以及其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要材料

INS-1細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所-協(xié)和細(xì)胞庫)；RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；0.25%含EDTA胰酶、100×青霉素-鏈霉素溶液和無脂肪酸牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自北京索萊寶科技有限公司；軟脂酸和NF-κB抑制劑PDTC(Sigma)；NF-κB抑制劑SN50(Santa Cruz)；總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；凝膠試劑盒和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司)；抗TXNIP和p-NF-κB抗體(Abcam)；抗caspase-3、cleaved caspase-3和 β-actin抗體(CST)；AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

2 軟脂酸的配制

將256.42 mg 軟脂酸溶于5 mL的無水乙醇中，60 ℃水浴以致完全溶解，再加入50 mmol/L NaOH 配制成50 mmol/L的儲存液(-20 ℃保存)。臨用時，使用含0.55% 無脂肪酸BSA的RPMI-1640培養(yǎng)基將軟脂酸儲存液稀釋為0.5 mmol/L作為工作濃度。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 INS-1細(xì)胞培養(yǎng) 用含15%胎牛血清、1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)INS-1細(xì)胞，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞長至80%時進(jìn)行傳代和實(shí)驗(yàn)處理。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將處于對數(shù)生長期的INS-1細(xì)胞分為對照組(含0.55% 無脂肪酸BSA的RPMI-1640培養(yǎng)基)和軟脂酸組(0.5 mmol/L軟脂酸及含0.55% 無脂肪酸BSA的RPMI-1640培養(yǎng)基)，均培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行指標(biāo)測定。

3.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)測定軟脂酸的量效曲線和時間曲線 將細(xì)胞接種至96孔板，待細(xì)胞貼壁處于對數(shù)生長期時，分別使用0、0.05、0.10、0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L濃度的軟脂酸孵育INS-1細(xì)胞24 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，孵箱孵育2 h后在450 nm測定吸光度值。使用0.5 mmol/L的軟脂酸分別孵育INS-1細(xì)胞2 h、12 h、24 h和48 h，后續(xù)采用CCK-8法測定吸光度值 。

3.4 Real-time PCR測定INS-1細(xì)胞TXNIP的mRNA表達(dá) INS-1細(xì)胞總RNA提取使用離心柱型總RNA提取試劑盒，cDNA合成用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix。擴(kuò)增使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，結(jié)果用2-ΔΔCt法計算。所使用的TXNIP 上游引物序列為5’-AGTGATTGGCAGCAGGTC-3’，下游引物序列為5’-GGTGTCTGGGATGTTTAGG-3’；GAPDH上游引物序列為5’-ATGGTGAAGGTCGGTGTG-3’，下游引物序列為5’-AACTTGCCGTGGGTAGAG-3’。

3.5 Western blot法測定TXNIP、cleaved caspase-3、caspase-3和p-NF-κB的蛋白水平 將INS-1細(xì)胞與0.5 mmol/L軟脂酸孵育24 h后收集，加入裂解液50 μL(PMSF 2 μL和廣譜磷酸酶抑制劑 2 μL)，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)破碎細(xì)胞，于4 ℃裂解3 h，13 000×g、4 ℃離心15 min，收集上清。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取定量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜置于5% BSA封閉液中室溫封閉2 h。I 抗4 ℃孵育過夜。次日收集 I 抗，TBST洗膜5 min、3次。加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的II 抗，4 ℃孵育2 h。洗膜3次，加入超敏ECL發(fā)光液，使用Kodak Image Station 400系統(tǒng)曝光獲取蛋白條帶。以β-actin為內(nèi)參照，分析各組蛋白表達(dá)量。

3.6 流式細(xì)胞術(shù)測INS-1細(xì)胞凋亡 將INS-1細(xì)胞接種到6孔板，待細(xì)胞貼壁長至80%時，加入2 mL軟脂酸(0.5 mmol/L)孵育24 h，使用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細(xì)胞2次(1 000 r/min離心5 min)收集細(xì)胞加入200 μL binging buffer 懸浮細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)，混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察檢測。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。統(tǒng)計方法采用t檢驗(yàn)和雙因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 軟脂酸具有細(xì)胞毒性，并呈濃度和時間依賴性

使用0、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75和1 mmol/L濃度逐漸增加的脂肪酸孵育INS-1細(xì)胞24 h，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著軟脂酸濃度的增加細(xì)胞存活率逐漸降低，具有濃度依賴性。同時，以不同軟脂酸處理時間0、2、12、24和48 h觀察，表明軟脂酸的損傷作用也具有時間依賴性，見圖1。

Figure 1.The effects of palmitate on the viability of the INS-1 cells. A: INS-1 cells were treated with increasing concentration of palmitate for 24 h; B: INS-1 cells were incubated with 0.5 mmol/L palmitate for different time. Mean±SEM.n=6.

圖1 軟脂酸對INS-1細(xì)胞活性的影響

2 軟脂酸引起TXNIP表達(dá)上調(diào)

使用0.5 mmol/L軟脂酸孵育INS-1細(xì)胞24 h，與對照組相比，軟脂酸組TXNIP 的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.Palmitate (PA; 0.5 mmol/L for 24 h) up-regulated TXNIP expression at protein (A) and mRNA (B) levels in the INS-1 cells. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖2 軟脂酸上調(diào)INS-1細(xì)胞的TXNIP mRNA和蛋白水平

3 軟脂酸可增加INS-1細(xì)胞凋亡

如圖3 所示，0.5 mmol/L軟脂酸處理INS-1細(xì)胞24 h，可導(dǎo)致cleaved caspase-3/caspase-3水平上調(diào)(P<0.05)。使用Annexin/FITC染色流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，軟脂酸組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P<0.01)。

4 軟脂酸通過增加NF-κB的磷酸化水平而誘導(dǎo)TXNIP表達(dá)

與對照組相比，軟脂酸組的p-NF-κB蛋白水平顯著升高(P<0.01)。加入NF-κB抑制劑PDTC(20 μmol/L)后，與不加抑制劑的對照相比，軟脂酸處理引起的TXNIP mRNA和蛋白水平上調(diào)均明顯被抑制(P<0.01)。使用SN50(50 mg/L；一種多肽類的NF-κB抑制劑)干預(yù)，同樣顯著抑制了軟脂酸引起的TXNIP表達(dá)(P<0.01)，見圖4。

討 論

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟公布的最新數(shù)據(jù)，2013年，全球糖尿病患病率為8.3%，中國糖尿病患病人數(shù)已高達(dá)9 840萬，居全球首位。預(yù)計到2035年，中國糖尿病患病人數(shù)將增長到1.43億[9]。這些數(shù)據(jù)提示我們，糖尿病已經(jīng)成為了我國現(xiàn)在及將來必須面對和解決的重要社會問題。因此，進(jìn)一步研究糖尿病的發(fā)病和損傷機(jī)制并探尋新的治療靶點(diǎn)就顯得極為迫切和重要。

糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制是胰島β細(xì)胞數(shù)目的減少和功能異常，引起胰島β細(xì)胞減少的主要原因?yàn)榧?xì)胞的凋亡[10]，而關(guān)于糖尿病時引起胰島β細(xì)胞凋亡的原因，則眾說紛紜。TXNIP是糖尿病時各組織和細(xì)胞顯著高表達(dá)的一種蛋白，在糖尿病動物模型和臨床糖尿病患者體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)TXNIP水平顯著升高[11]。我們課題組的前期研究表明，使用腺病毒過表達(dá)TXNIP可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、caspase-8和caspase-9等途徑引起INS-1胰島細(xì)胞凋亡[12]。已有證據(jù)表明高葡萄糖是誘導(dǎo)TXNIP表達(dá)增加的重要原因[13]，而糖尿病患者體內(nèi)除了糖代謝紊亂導(dǎo)致的高血糖外，常伴隨著游離脂肪酸的明顯升高，升高的游離脂肪酸對TXNIP表達(dá)的影響目前尚不明確。2016年Mandala等[14]的研究表明飽和脂肪酸軟脂酸可誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞的TXNIP表達(dá)。在本研究中，發(fā)現(xiàn)軟脂酸能夠上調(diào)INS-1細(xì)胞TXNIP表達(dá)，同時可誘導(dǎo)INS-1胰島細(xì)胞凋亡增加，說明TXNIP參與介導(dǎo)了軟脂酸誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡。

Figure 3.Palmitate induced INS-1 cell apoptosis. A: INS-1 cells were treated with 0.5 mmol/L palmitate for 24 h, and cleaved caspase-3 protein levels were assessed by Western blot; B: using flow cytometry, the apoptosis of INS-1 cells was analyzed. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3 軟脂酸誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞凋亡

Figure 4.Palmitate up-regulated TXNIP expression by NF-κB phosphorylation. A: p-NF-κB-p65 was measured by Western blot in the INS-1 cells treated with palmitate at 0.5 mmol/L; B～C: INS-1 cells were treated palmitate at 0.5 mmol/L with or without NF-κB inhibitor PDTC (20 μmol/L), TXNIP expression was assessed by Western blot and real-time PCR; D: TXNIP protein levels were measured in the INS-1 cells treated with palmitate with or without NF-κB inhibitor SN50 at 50 mg/L. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsPA.

圖4 軟脂酸通過磷酸化NF-κB上調(diào)TXNIP

游離脂肪酸增多，可產(chǎn)生大量的中間代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺，其積累可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡[15]。神經(jīng)酰胺通過激活NF-κB調(diào)節(jié)TXNIP表達(dá)[16]。同時有研究表明，在TXNIP的啟動子部位包含NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)[17]，因此NF-κB可能參與軟脂酸引起的TXNIP表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)軟脂酸能夠激活NF-κB，使其磷酸化水平增加，NF-κB磷酸化后，將獲得轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)的能力，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)[18]，可能就包括TXNIP。為了進(jìn)一步證實(shí)NF-κB是否參與了軟脂酸誘導(dǎo)的TXNIP表達(dá)，本研究也使用NF-κB 2種不同機(jī)制的抑制劑PDTC和SN50，二者均阻斷了軟脂酸誘導(dǎo)的TXNIP表達(dá)上調(diào)，表明NF-κB的確參與了軟脂酸引起的TXNIP上調(diào)。

綜上所述，本研究證實(shí)了軟脂酸可以誘導(dǎo)TXNIP表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)了INS-1胰島細(xì)胞的凋亡；軟脂酸上調(diào)TXNIP表達(dá)的機(jī)制與NF-κB的激活相關(guān)。提示TXNIP作為糖尿病時代謝紊亂引起的高糖、高脂肪酸的共同下游蛋白，在胰島β細(xì)胞凋亡的發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用，從而加重加快糖尿病的進(jìn)展，因此TXNIP可作為糖尿病針對性治療的重要靶標(biāo)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of palmitate on TXNIP expression in INS-1 islet cells

ZHANG Qian1, LIANG Nan-nan1, WU Xiang-zheng1, WANG Jin1, ZHAO Jia-hui2, JIAO Xiang-ying1

(1DepartmentofPhysiology，2CentreforTranslationalMedicine,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:jiaoxyty@163.com)

AIM: Chronic exposure to elevated levels of free fatty acids (FFAs) in type 2 diabetes patients is toxic to pancreatic β-cells. Thioredoxin (Trx)-interacting protein (TXNIP), an endogenous Trx-inhibiting protein, is up-regulated by glucose and is a critical mediator of hyperglycemia-induced β-cell apoptosis in diabetes. However, the effects of FFAs on TXNIP are unknown. In this experiment we observed the effect of palmitate on TXNIP expression in cultured INS-1 islet cells and the pathways involved were analyzed meanwhile. METHODS: After the full basis of preliminary experiment of incubating INS-1 cells with palmitate at different concentrations for different time, INS-1 islet cells were cultured with 0.5 mmol/L palmitate for 24 h. TXNIP expression, cell apoptosis, and expression of transcription factors related to TXNIP transcriptional regulation were determined. RESULTS: Compared with control group, the expression of TXNIP at mRNA and protein levels in palmitate group was significantly up-regulated (P<0.01). Cleaved caspase-3/caspase-3 ratio was increased in palmitate group (P<0.05), and the apoptosis of the INS-1 cells was also significantly increased (P<0.01). Palmitate enhanced the phosphorylation of nuclear factor-κB (NF-κB) (P<0.01), and the NF-κB inhibitors， PDTC and SN50， both blocked the palmitate-induced up-regulation of TXNIP expression. CONCLUSION: Saturated fatty acid palmitate enhances the expression of TXNIP. The mechanism of palmitate-induced TXNIP expression may be associa-ted with the increase in NF-κB phosphorylation.

Palmitate; INS-1 cells; Thioredoxin-interacting protein; Nuclear factor-κB

1000- 4718(2017)05- 0908- 05

2016- 11- 25

2016- 12- 12

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 30800399); 山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項目(No. 2014011049-12); 山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金資助項目(No. 01201406)

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.023

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