犀角地黃湯合銀翹散通過PKC-SSeCKS通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加*

任睿芳， 張 舒， 李曉瑞， 游雷鳴， 吳 珺， 郝 鈺

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 北京 100029)

犀角地黃湯合銀翹散通過PKC-SSeCKS通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加*

任睿芳， 張 舒， 李曉瑞， 游雷鳴， 吳 珺， 郝 鈺△

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 北京 100029)

目的： 觀察犀角地黃湯合銀翹散(XDY)對TNF-α誘導(dǎo)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVEC)通透性的影響及其與PKC-SSeCKS信號通路的關(guān)系，以探究該方治療病毒性肺炎的作用環(huán)節(jié)和分子機(jī)制。方法: 原代培養(yǎng)大鼠PMVEC，在Transwell小室上用電導(dǎo)法于不同時點監(jiān)測TNF-α誘導(dǎo)的PMVEC跨內(nèi)皮細(xì)胞單層電阻(TER)測定其通透性。不同的干預(yù)因素作用24 h后，檢測PMVEC的TER、PKC活性、SSeCKS mRNA水平和磷酸化SSeCKS蛋白水平，激光共聚焦顯微鏡觀察PMVEC中SSeCKS的定位和F-actin的結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果: TNF-α作用24 h后PMVEC通透性達(dá)高峰；與對照組比較，TNF-α組TER降低，PKC活性增強(qiáng)；與TNF-α組比較，TNF-α加PKC抑制劑組和TNF-α加XDY含藥血清組PKC活性降低，而TER升高且與對照組無差別。與對照組比較，TNF-α組SSeCKS的mRNA和蛋白表達(dá)升高；與TNF-α組比較，TNF-α加XDY含藥血清組SSeCKS的mRNA水平和磷酸化SSeCKS蛋白水平降低。對照組PMVEC中F-actin主要分布在細(xì)胞周邊和核周，形成致密周圍束，SSeCKS均勻散在分布于細(xì)胞中；TNF-α組細(xì)胞周邊的F-actin致密束基本消失，SSeCKS集中分布于核周；TNF-α加含XDY含藥血清組F-actin結(jié)構(gòu)及SSeCKS的分布趨于正常。結(jié)論: 犀角地黃湯合銀翹散可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的PMVEC PKC信號通路的激活，降低PKC結(jié)合底物SSeCKS的表達(dá)，最終影響肌動蛋白的變構(gòu)、阻止內(nèi)皮細(xì)胞變形而降低PMVEC的通透性。

肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞； PKC-SSeCKS信號通路； TNF-α； 犀角地黃湯合銀翹散

犀角地黃湯合銀翹散(Xijiao Dihuang decoction combined with Yinqiao powder，XDY)是源于《溫病條辨》的經(jīng)典合方，具有解毒、化瘀、通絡(luò)之功效，臨床可用于治療重癥病毒性肺炎。前期研究表明：犀角地黃湯合銀翹散可有效降低病毒性肺炎小鼠肺微血管的通透性，降低肺含水量與肺指數(shù)，明顯減少肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)，減輕病毒性肺炎小鼠肺組織炎性改變[1-2]。但其降低肺微血管通透性的機(jī)制尚未闡明。

肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVEC)是構(gòu)成血?dú)馄琳系闹匾Y(jié)構(gòu)之一，其通透性的增加是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的重要病理生理基礎(chǔ)。在病毒性肺炎病變過程中，在各種致炎因子的共同作用下，PMVEC通透性增加而使其屏障功能障礙，導(dǎo)致肺微血管滲漏，蛋白和細(xì)胞滲出，最終引起肺間質(zhì)水腫。TNF-α作為致炎物質(zhì)能破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接,從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高[3]。已發(fā)現(xiàn)參與血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的信號通路有多種[4]，蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)-Src抑制的蛋白激酶C底物(Src-suppressed C kinase substrate，SSeCKS)信號通路為其中之一。

因此，本實驗研究犀角地黃湯合銀翹散對TNF-α誘導(dǎo)的PMVEC通透性改變及對PKC-SSeCKS通路的影響，以探討該方降低肺微血管通透性的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞 根據(jù)陳瑞華等[5]的方法進(jìn)行大鼠PMVEC的原代培養(yǎng)和鑒定。

1.2 藥物 犀角地黃湯合銀翹散(水牛角 30 g, 生地 30 g, 芍藥 12 g, 丹皮 9 g, 連翹 9 g, 銀花 9 g, 苦桔梗 6 g, 薄荷 6 g, 竹葉 4 g, 生甘草 5 g, 荊芥穗 5 g, 淡豆豉 5 g, 牛蒡子 9 g)制成水煎劑，藥材購自北京同仁堂藥店。根據(jù)張晨月等[2]的方法和劑量制備含藥血清。

1.3 主要試劑和儀器 M199培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；雙抗(Solarbio)；ECGS(BD)；PKC活性檢測試劑盒(Promega)；PKC抑制劑(Midostaurin)；4%多聚甲醛(Solarbio)；Triton X-100(Amresco)；綿羊抗大鼠SSeCKS抗體(Sigma)；TRITC標(biāo)記的免抗綿羊 IgG(Jackson)；FITC-鬼筆環(huán)肽(Molecular Probes)。

Real-time PCR儀(ABI)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus)；跨膜電阻儀(Millipore)；Transwell小室(Costar)。

2 方法

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞通透性的檢測 將大鼠PMVEC(2×105cells)接種于0.5%明膠包被的Transwell小室內(nèi)，上、下室分別加入0.5 mL和1.5 mL M199完全培養(yǎng)液，細(xì)胞達(dá)單層融合后，設(shè)置對照組、TNF-α (100 μg/L)組、TNF-α加PKC抑制劑(10 μmol/L)組和TNF-α加含藥血清(15%)組。將跨膜電阻儀調(diào)至歐姆檔，將2個STX-2電極分別于固定位置置于Transwell小室表面和下室內(nèi)，于不同時點測量各組阻抗值，并測未接種細(xì)胞的小室阻抗值，每室重復(fù)3 次。TER=(測得阻抗值-空白阻抗值)×Transwell小室的底面積，單位為：Ω·cm2。TER反映溶質(zhì)離子傳遞電流的強(qiáng)弱，與通透性呈反比，反映細(xì)胞單層通透性的變化。

2.2 PMVEC PKC活性的檢測 設(shè)對照組、TNF-α組、TNF-α加PKC抑制劑組和TNF-α加含藥血清組。干預(yù)因素作用24 h，將各組細(xì)胞收集并勻漿，離心(4 ℃，14 000 r/min，5 min)取上清，按PKC試劑盒操作說明測定上清液的PKC活性(試劑盒自帶了PKC激酶的短肽底物，正電的短肽底物在被PKC激酶磷酸化修飾后帶負(fù)電，負(fù)電短肽底物越多表示PKC激酶活性越強(qiáng))。當(dāng)上清液PKC活性越強(qiáng)，被磷酸化修飾的短肽底物越多(帶負(fù)電短肽電泳時向陽極移動越多越亮)，反之未被磷酸化修飾的短肽底物越多(帶正電短肽電泳時向陰極移動越多越亮)。因此，短肽物的電泳檢測時，同一泳道的陽極條帶和陰極條帶比值(用條帶的灰度比值來表示)反映了上清液中PKC激酶活性。

2.3 PMVEC中SSeCKS的mRNA和蛋白表達(dá)檢測 設(shè)置對照組、TNF-α組和TNF-α加含藥血清組，干預(yù)因素作用24 h，收集細(xì)胞，按RNeasy Mini 試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用TE10倍稀釋。根據(jù)GenBank 提供的SSeCKS基因已知序列(AY695056)，用Primer Premier 5．0 軟件設(shè)計CDS 區(qū)的上游引物序列為5’-AATCCATCCCAATCATAGTAAC-3’，下游引物序列為5’-TCTCAAGGTCCCAACAGC-3’；內(nèi)參照GAPDH的上游引物序列為5’-ATGACCCCTTCATTGACC-3’，下游引物序列為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR擴(kuò)增按One-Step SYBR PrimeScript PT-PCR KitⅡ試劑盒說明書進(jìn)行，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

收集細(xì)胞，用蛋白裂解液提取蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。用Western blot 方法檢測SSeCKS蛋白表達(dá)量，用ImageJ 凝膠分析軟件分析電泳圖像，以目標(biāo)條帶的灰度值同GAPDH灰度值的比值表示待檢測蛋白相對水平。

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察SSeCKS和F-actin在細(xì)胞內(nèi)的定位和結(jié)構(gòu)的改變 將5×108cells/L的細(xì)胞100 μL種于激光共聚焦專用96孔板內(nèi)，分組如上，干預(yù)因素作用24 h后，置于4%多聚甲醛中4 ℃固定1 h，以1% Triton X-100進(jìn)行膜通透10 min，PBS清洗后，加正常兔血清室溫封閉1 h，傾去。SSeCKS用抗SSeCKS抗體4 ℃孵育過夜，洗滌后避光，以TRITC熒光 II 抗4 ℃孵育1 h，F(xiàn)-actin用FITC-鬼筆環(huán)肽染色，洗滌，封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，進(jìn)行3次獨(dú)立實驗。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩組間比較用LSD法(方差齊時)或Games-Howell法(方差不齊時)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 XDY對TNF-α刺激大鼠PMVEC后TER變化的影響

TNF-α作用于PMVEC 12 h后 TER開始下降，24 h TER達(dá)低點(圖1)。24 h時，與對照組相比，TNF-α組TER顯著降低(P<0.01)；與TNF-α組相比，TNF-α加PKC抑制劑組和TNF-α加XDY含藥血清組TER明顯增高(P<0.01)，且與對照組的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性(圖2)。

Figure 1.The change of TER of rat PMVEC induced by TNF-α. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖1 TNF-α誘導(dǎo)大鼠PMVEC TER的變化

Figure 2.The effect of XDY on TER of rat PMVEC induced by TNF-α at 24 h. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α group.

圖2 XDY對TNF-α誘導(dǎo)大鼠PMVEC 24 h TER的影響

2 XDY對TNF-α刺激大鼠PMVEC 24 h后 PKC活性的影響

干預(yù)因素作用24 h，與對照組相比，TNF-α組PKC活性增強(qiáng)(P<0.01)；與TNF-α組相比，TNF-α加PKC抑制劑組和TNF-α加XDY含藥血清組PKC活性顯著降低(P<0.01)。各組PKC活性變化趨勢同TER變化趨勢呈負(fù)相關(guān)(r=0.8)，TER同細(xì)胞通透性呈反比，因此各組PKC活性變化趨勢同PMVEC通透性變化趨勢呈正相關(guān)，見圖3。

3 XDY 對TNF-α刺激大鼠PMVEC 24 h后SSeCKS mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，TNF-α組SSeCKS mRNA與磷酸化SSeCKS蛋白表達(dá)明顯增多，且差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與TNF-α組相比，TNF-α加XDY含藥血清組SSeCKS的mRNA及磷酸化SSeCKS蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.The effect of XDY on activity of PKC in rat PMVEC induced by TNF-α at 24 h. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α group.

圖3 XDY對TNF-α 刺激大鼠PMVEC 24 h PKC活性的影響

Figure 4.The SSeCKS mRNA (A) and the phospho-SSeCKS protein (B) levels in rat PMVEC. Mean±SD.n=3.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsTNF-α group.

圖4 SSeCKS mRNA和磷酸化SSeCKS蛋白的變化

4 激光共聚焦顯微鏡觀察XDY對TNF-α刺激大鼠PMVEC 24 h后 SSeCKS和F-actin在細(xì)胞內(nèi)的定位和結(jié)構(gòu)改變的影響

對照組PMVEC中F-actin主要分布在細(xì)胞周邊和核周，微絲微管分布均勻、排列整齊，胞周可見F-actin形成的致密周圍束，SSeCKS均勻散在分布在細(xì)胞中；與對照組相比，TNF-α組細(xì)胞周邊的F-actin致密束基本消失，SSeCKS集中分布于核周；與TNF-α組相比， TNF-α加XDY含藥血清組的PMVEC中可見F-actin分布于細(xì)胞周邊的致密周圍束，SSeCKS均勻散在分布于細(xì)胞中，見圖5。

討 論

由于PMVEC是氣血屏障的主要組成部分，所以急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征的主要發(fā)病環(huán)節(jié)就是其通透性的改變[6]。在流感病毒性肺炎中，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，肺微血管通透性增加，從而導(dǎo)致肺間質(zhì)炎性滲出增多。TNF-α作為炎性介質(zhì)，可觸發(fā)并加重肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的改變[7]。它可使骨架蛋白活動和內(nèi)皮細(xì)胞回縮,引起連接蛋白結(jié)構(gòu)和功能失調(diào), 細(xì)胞間裂隙形成，內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加[8]。PKC活化是內(nèi)皮細(xì)胞的骨架蛋白活動的重要途徑之一[9]。TNF-α、IL-1β和LPS均可通過激活PKC信號通路來參與內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的調(diào)控[10]。PKC信號通路被激活后，位于其下游的PKC結(jié)合底物SSeCKS的激活在內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變中發(fā)揮著重要作用。SSeCKS是一種相對分子質(zhì)量為280～290 kD的細(xì)胞支架蛋白，它是PKC的結(jié)合蛋白，也是PKC的底物，同時也是絲狀肌動蛋白相關(guān)蛋白，被PKC磷酸化后，參與細(xì)胞的多種功能調(diào)控，如信息傳遞、F-actin重構(gòu)[11]。SSeCKS蛋白存在3種亞型，分別是280 kD、290 kD(構(gòu)成雙聯(lián)體)以及 240 kD，只有280/290 kD雙聯(lián)體蛋白的磷酸化顯著，而240 kD的SSeCKS 蛋白為可溶性蛋白，不被PKC和其它絲/蘇氨酸激酶磷酸化。磷酸化的SSeCKS蛋白與F-actin關(guān)聯(lián)，參與細(xì)胞骨架重構(gòu)[12]。TNF-α、LPS等炎癥因子刺激后，SSeCKS由散在分布于變?yōu)榫奂诩?xì)胞核周和細(xì)胞皺折處，球狀肌動蛋白聚集成F-actin，與各種F-actin相關(guān)蛋白連接增加，引起致密周圍束消失，形成應(yīng)力纖維；將信號傳遞給黏附連接、緊密連接、縫隙連接和整合素-細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物，最終導(dǎo)致細(xì)胞間和細(xì)胞-基質(zhì)間的連接物解聚，細(xì)胞收縮、細(xì)胞間縫隙增寬,通透性增加[13]。但經(jīng)PKC抑制劑預(yù)處理的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)TNF-α、LPS刺激后，骨架蛋白重構(gòu)和SSeCKS的再分布明顯受到抑制[10]。

Figure 5.The effect of XDY on distribution and structure of F-actin and SSeCKS in rat PMVEC induced by TNF-α at 24 h observed under laser confocal microscope.

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察XDY對SSeCKS分布及F-actin結(jié)構(gòu)的影響

我們的前期動物實驗研究已證實：犀角地黃湯合銀翹散可以有效降低流感病毒性肺炎小鼠血管的通透性，降低肺含水量與肺指數(shù)，減輕肺水腫[1]。本研究結(jié)果顯示TNF-α作用后12 h，PMVEC通透性開始增高，約24 h左右達(dá)高峰，因此本研究選取24 h作為進(jìn)一步觀察TNF-α引起PMVEC通透性變化具體機(jī)制及含藥血清干預(yù)的時點。本研究證實TNF-α可激活PKC信號通路，并使PMVEC通透性增高，而特異性PKC抑制劑可抑制TNF-α的作用，說明TNF-α誘導(dǎo)的PMVEC通透性增高依賴PKC信號通路的激活。本研究結(jié)果顯示TNF-α刺激可引起SSeCKS mRNA表達(dá)和蛋白磷酸化水平的增加，同時可以使F-actin致密周圍束降解，微絲微管排列紊亂甚至消失；而犀角地黃湯合銀翹散可以減輕降低TNF-α刺激后PMVEC通透性增高，抑制PKC的活化，并減少SSeCKS mRNA表達(dá)和蛋白磷酸化水平，還可減輕細(xì)胞骨架蛋白的變構(gòu)，這提示該方可能是通過抑制PKC的活化，進(jìn)而減少PKC底物SSeCKS的表達(dá)，抑制SSeCKS相關(guān)的F-actin變構(gòu)，降低PMVEC的通透性，減輕肺組織的炎癥反應(yīng)。前期研究表明XDY還明顯抑制流感病毒感染后肺組織內(nèi)炎癥因子TNF-α的表達(dá)，體外抑制大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌[14]，所以XDY也可通過抑制TNF-α的產(chǎn)生而降低肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。由于病毒性肺炎過程中，引起肺微血管通透性升高的因素較多，如病毒、IL-1等就可誘導(dǎo)肺微血管通透性增加，且均可通過PKC-SSeCKS通路(另文發(fā)表)，所以XDY除減少TNF-α產(chǎn)生外，對PKC-SSeCKS通路的抑制在降低肺微血管通透性作用中有重要意義。

本研究結(jié)果表明TNF-α可通過激活PKC-SSeCKS信號傳導(dǎo)通路而引起PMVEC通透性的增加，犀角地黃湯合銀翹散可以抑制PKC-SSeCKS信號通路的激活，降低SSeCKS的表達(dá)，減輕下游F-actin致密周圍束解聚，阻止細(xì)胞收縮導(dǎo)致的細(xì)胞間隙增大，從而降低病毒性肺炎中炎性介質(zhì)TNF-α引起的PMVEC通透性增高，緩解內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，減輕肺水腫。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲, 羅 森)

Xijiao Dihuang decoction combined with Yinqiao powder inhibits TNF-α-induced permeability increase in PMVEC via PKC-SSeCKS pathway

REN Rui-fang, ZHANG Shu, LI Xiao-rui, YOU Lei-ming, WU Jun, HAO Yu

(SchoolofBasicMedicalSciences,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China.E-mail:yuhao64@sina.com

AIM: To investigate the molecular mechanism of Xijiao Dihuang decoction combined with Yinqiao powder (XDY) in treating viral pneumonia, and the effects of XDY on TNF-α-induced permeability in pulmonary microvascular endothelial cells (PMVEC) and the role of PKC-SSeCKS pathway involved.METHODS: The electric conductivity method was used to detect transendothelial electrical resistance (TER) of primarily cultured PMVEC on Transwell chamber at different time points to determine the permeability of PMVEC. After pretreatment for 24 h, the activity of PKC, TER， and the expression of SSeCKS at mRNA and protein levels were detected. Laser scanning confocal microscopy was used to observe the location of SSeCKS and construction of F-actin in PMVEC. RESULTS: The permeability of PMVECs induced by TNF-α reached the peak at 24 h. Compared with control group, the TER in TNF-α group was decreased, and the activity of PKC was increased. Compared with TNF-α group, the activity of PKC in TNF-α with PKC inhibitor group and TNF-α with XDY group was decreased, while the TER was increased, without difference from control group. Compared with control group, the mRNA expression of SSeCKS and phospho-SSeCKS was increased in PMVEC of TNF-α group, but decreased in TNF-α with XDY group compared with TNF-α group. In control group, F-actin was mainly located around the nucleus and at cytoplasmic borders of PMVEC, forming the dense peripheral bundle, and SSeCKS was evenly scattered in the cell. In TNF-α group, the dense peripheral bundle of F-actin surrounding the cells almost disappeared, and SSeCKS was concentrated around the nucleus. Compared with TNF-α group, the distribution and the structure of F-actin and SSeCKS nearly returned to normal in TNF-α with XDY group. CONCLUSION: XDY inhibits the activation of PKC signaling pathway in PMVEC caused by TNF-α to reduce the mRNA expression of SSeCKS and the phosphorylation of SSeCKS, thus preventing the deformation of endothelial cells and reducing the permeability of PMVEC.

Pulmonary microvascular endothelial cells; PKC-SSeCKS signaling pathway; TNF-α; Xijiao Dihuang decoction combined with Yinqiao powder

1000- 4718(2017)05- 0871- 06

2016- 11- 22

2017- 03- 08

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81573723)；教育部博士點博導(dǎo)類基金資助項目(No. 20130013110010)

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.017

R285.5； R392.1； R563.1+4

A

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△通訊作者 Tel: 13671032107； E-mail: yuhao64@sina.com