G-CSF對(duì)豚鼠單個(gè)缺血心房肌細(xì)胞鈣、鈉、鉀電流的影響

羅 濤， 郭 梅， 史成龍， 周 敏， 賈忠偉， 浦 奎

(中國(guó)人民解放軍第254醫(yī)院 1心血管內(nèi)科, 2檢驗(yàn)科， 天津 300142)

G-CSF對(duì)豚鼠單個(gè)缺血心房肌細(xì)胞鈣、鈉、鉀電流的影響

羅 濤1△， 郭 梅2， 史成龍1， 周 敏1， 賈忠偉1， 浦 奎1

(中國(guó)人民解放軍第254醫(yī)院1心血管內(nèi)科,2檢驗(yàn)科， 天津 300142)

目的： 采用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法，觀察粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)急性干預(yù)對(duì)分離的豚鼠單個(gè)缺血心房肌細(xì)胞鈣、鈉、鉀電流的影響。方法: 使用酶解方法獲得豚鼠單個(gè)心房肌細(xì)胞，在缺血缺氧條件下，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察記錄不同濃度G-CSF急性干預(yù)對(duì)鈣通道電流-電壓曲線、激活曲線、失活曲線，鈉通道電流-電壓曲線、激活曲線、失活曲線、靜態(tài)失活曲線，延遲整流鉀通道及其快成分、慢成分電流-電壓曲線的影響。結(jié)果: 隨G-CSF濃度的增加，缺血心房肌細(xì)胞膜L型鈣通道電流較缺血對(duì)照組有明顯增大。當(dāng)G-CSF濃度超過(guò)100 μg/kg后,L型鈣通道電流的增強(qiáng)維持于同一水平。當(dāng)給予G-CSF濃度為300 μg/kg時(shí)最大激活電壓發(fā)生改變，較前有所增加。激活曲線與失活曲線未見明顯改變。不同濃度G-CSF對(duì)缺血心房肌細(xì)胞膜鈉離子通道電流無(wú)明顯影響。G-CSF干預(yù)缺血心房肌細(xì)胞膜延遲整流鉀電流未見明顯改變，但延遲整流鉀電流快成分在G-CSF 100 μg/kg干預(yù)后明顯增加，而延遲整流鉀電流慢成分未見明顯改變。結(jié)論: G-CSF對(duì)于缺血心房肌細(xì)胞部分通道的作用影響基本為非電壓依賴性，但具有濃度依賴性，可能減少缺血心房心律失常的發(fā)生率。

粒細(xì)胞集落刺激因子； 鈉通道； L型鈣通道； 延遲整流鉀通道； 心房肌細(xì)胞

心肌缺血后房性心律失常的發(fā)生很常見，可能的原因?yàn)槿毖男姆考〗M織不能通過(guò)細(xì)胞再生修復(fù)，只能由無(wú)收縮功能的瘢痕組織替代，形成促心律失常發(fā)生基質(zhì)，并通過(guò)改變心肌離子通道功能，促進(jìn)房性心律失常的發(fā)生，即“致心律失常性重構(gòu)”。

粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)作為一種能動(dòng)員骨髓中多種干細(xì)胞的細(xì)胞因子，在心肌梗死后的修復(fù)治療中具有良好的應(yīng)用前景。研究者們做了大量的工作以驗(yàn)證G-CSF治療心肌梗死的療效，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了積極探索，發(fā)現(xiàn)了G-CSF除動(dòng)員骨髓干細(xì)胞以外的許多機(jī)制，特別是G-CSF對(duì)靶細(xì)胞的直接保護(hù)作用機(jī)制。從現(xiàn)有資料可以看出，G-CSF的作用機(jī)制主要分為骨髓動(dòng)員效應(yīng)及其與靶細(xì)胞受體的直接作用效應(yīng)，可以歸結(jié)為“CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor-4，CXCR4)途徑效應(yīng)”和“非CXCR4途徑效應(yīng)”。這兩個(gè)途徑最主要區(qū)別在于是否有CXCR4的參與。CXCR4是干細(xì)胞表面的一種趨化因子受體，與其特異性配體——基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1；又稱CXCL12)結(jié)合，使干細(xì)胞錨定在骨髓中。G-CSF通過(guò)多種機(jī)制作用于CXCR4/SDF-1復(fù)合體[1]，使骨髓干細(xì)胞釋放入外周血，隨后外周血中CXCR4+干細(xì)胞在缺氧組織高表達(dá)的SDF-1的趨化作用下，遷移到組織局部。而G-CSF的直接作用效應(yīng)中并無(wú)CXCR4參與，G-CSF直接與細(xì)胞表面的G-CSF受體結(jié)合而發(fā)揮作用。

本研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察了不同濃度G-CSF急性干預(yù)對(duì)分離的豚鼠缺血缺氧心房肌離子通道的影響，以初步探討是否G-CSF能夠通過(guò)“非CXCR4途徑效應(yīng)”影響缺血心房肌電生理特性，進(jìn)而降低房性心律失常發(fā)生率。

材 料 和 方 法

1 溶液與試劑

HEPES-Tyrode’s液成分(mmol/L)：NaCl 137， KCl 5.4， MgCl21， NaH2PO4(2H2O) 0.33， CaCl21.8， HEPES 5， D-glucose 10 (使用NaOH調(diào)pH至7.3～7.4)。無(wú)鈣HEPES-Tyrode’s液或低鈣HEPES-Tyrode’s液分別為HEPES-Tyrode’s液中不加CaCl2或加入0.15 mmol/L CaCl2。

Kraft-Brühe (KB)液成分(mmol/L)：L-谷氨酸鉀 50， KCl 25， ?；撬?10， MgCl23， KH2PO410， EGTA 0.5， KHPO410、D-glucose 10， HEPES 10 (使用KOH調(diào)pH至7.3～7.4)。

記錄L型鈣離子通道電流(ICa，L)的電極內(nèi)液成分(mmol/L)：CsCl 100， TEA-Cl 20， HEPES 5， MgATP 3， EGTA 10， MgCl23 (使用CsOH調(diào)pH至7.2～7.3)。細(xì)胞外液成分(mmol/L)：NaCl 137， CsCl 5.4， MgCl20.5， CaCl21.8， HEPES 10， D-glucose 5 (使用NaOH調(diào)pH至7.3～7.4)。

記錄電壓依賴性鈉離子通道電流(INa)的電極內(nèi)液成分(mmol/L)：NaCl 5， CsCl 20， CsF 110， MgCl21， HEPES 5， EGTA 5， MgATP 5 (使用CsOH調(diào)pH至7.2～7.3)。細(xì)胞外液成分(mmol/L)：NaCl 5， CsCl 135， MgCl21， D-glucose 10， CaCl20.5， HEPES 10， CoCl2·6H2O 0.5 (使用CsOH調(diào)pH至7.2～7.3)。

記錄電壓依賴性延遲整流外向性鉀離子通道電流(IK)的電極內(nèi)液成分(mmol/L)：天門冬氨酸鉀 120， KCl 30， EGTA 10， HEPES 5， MgATP 4， MgCl21 (使用KOH調(diào)pH至7.2～7.3)。細(xì)胞外液成分為HEPES-Tyrode’s液+5 μmol/L nitredipine。

模擬缺血缺氧液[2-3](mmol/L)：NaCl 134， KCl 5.4， CaCl21.8， MgCl20.5， NaHCO33.8， NaH2PO40.9， 乳酸20 (維持pH值為6.8)。

2 離體低氧心肌細(xì)胞模型的建立

給模擬缺血缺氧液持續(xù)通氮?dú)?5 min，以恒定的灌流速度保持灌流液的低氧狀態(tài)。上述電極內(nèi)液配制后均使用0.24 μm濾器過(guò)濾，置于EP管中-40 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。進(jìn)行G-CSF干預(yù)時(shí)，于相應(yīng)缺血缺氧細(xì)胞外液中加入一定濃度(0、50、100和300 μg/kg)G-CSF，其余液體成分不變。上述試劑中L-谷氨酸鉀、TEA-Cl和MgATP為Sigma生產(chǎn)，所使用Ⅱ型膠原酶為Introgen生產(chǎn)，其余為國(guó)產(chǎn)分析純。

3 心房肌細(xì)胞的分離

參考Eto等[4]的方法，使用Langendorff灌流系統(tǒng)逆向灌流冠狀動(dòng)脈，以膠原酶消化分解得到單個(gè)豚鼠心房肌細(xì)胞。健康成年豚鼠(250～350 g)，雌雄不拘，擊昏后迅速開胸取出心臟并放置于4 ℃ HEPES-Tyrode’s液中，經(jīng)初步修剪游離出主動(dòng)脈根部后，于Langendorff心臟灌流裝置上行主動(dòng)脈逆行灌流，灌流速度8～10 mL/min，灌流頭端溫度維持在37 ℃，灌流過(guò)程中始終予以100%純氧飽和，氧流量0.3 L～0.5 L/min。先使用無(wú)鈣HEPES-Tyrode’s液以恒定壓力(50 cmH2O)灌流5 min以沖洗殘留血液并松解心肌結(jié)締組織，再使用含有0.01%Ⅱ型膠原酶和0.1%牛血清白蛋白的低鈣(含50 μmol/L)HEPES-Tyrode’s液灌流消化心房肌細(xì)胞。灌流過(guò)程中密切觀察心房顏色、質(zhì)地等變化，約經(jīng)5～7 min后，用2把眼科鑷每隔1～2 min相向輕輕壓迫心臟1次，如感到心臟變軟，顏色漸白，流出液體出現(xiàn)“拉絲”現(xiàn)象，此時(shí)停止灌流。為促進(jìn)分離的心房肌細(xì)胞耐鈣，我們繼續(xù)用200 μmol/L低鈣臺(tái)式液灌流心臟5 min，灌流速度10 mL/min。剪下兩側(cè)心房，室溫下先于適量KB液沖洗2～3次洗凈酶液，再放置于5～10 mL KB液中剪碎組織成1 mm×1 mm×1 mm大小，并使用滴管小心吹打5～10 min。最后細(xì)胞懸濁液經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾后,放置于4 ℃環(huán)境穩(wěn)定1 h后使用，于10 h內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)。KB液為高鉀低鈉無(wú)鈣成分，可保護(hù)心肌細(xì)胞，并提高其耐鈣水平。

4 通道電流的記錄和刺激模式

4.1 通道電流的記錄 吸取適量細(xì)胞懸液滴加于灌流槽中，放置15～20 min使細(xì)胞牢固貼壁后，使用相應(yīng)缺血缺氧細(xì)胞外液以約5 mL/min勻速灌流并持續(xù)通氮?dú)?5 min，使細(xì)胞逐漸復(fù)鈣并建立缺血缺氧細(xì)胞模型，10～20 min后，于倒置顯微鏡下選擇貼壁牢固、無(wú)跳動(dòng)、橫紋清晰、折光性好且立體感強(qiáng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用Hamill等[5]確立的標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)，在電壓鉗模式下記錄細(xì)胞膜電位和全細(xì)胞電流。使用Multiclamp 700A信號(hào)放大器(Axon Instrument Inc.)采集數(shù)據(jù)，并經(jīng)DIGIDATA 1320A數(shù)/模轉(zhuǎn)換器(Axon Instrument Inc.)將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，最后采用pCLAMP軟件包(Version 8.2.0.235， Axon Instrument Inc.)記錄至電腦硬盤并加以分析。數(shù)據(jù)采集經(jīng)2 kHz低通濾波器濾波，并以10 kHz記錄數(shù)據(jù)。微電極采用P-97水平微電極拉制儀(Sutter Instrument Company)，使用二步拉制法拉制玻璃微電極，控制電極電阻在2 MΩ～5 MΩ。

4.2 心房肌細(xì)胞ICa，L的刺激模式 細(xì)胞外液及電極內(nèi)液中K+以等摩爾Cs+代替，同時(shí)使用TEA-Cl阻斷IK，所以鉀離子通道電流可完全去除。測(cè)量時(shí)將保持電位設(shè)為-40 mV，此時(shí)Na+通道已經(jīng)失活，故可排除Na+通道電流。

電流-電壓曲線(I-V曲線)：保持電位為-40 mV，以起始于-30 mV、終止于50 mV，以10 mV步進(jìn)、時(shí)長(zhǎng)為200 ms的電壓刺激細(xì)胞，刺激頻率0.2 Hz。獲得在不同電壓下細(xì)胞總鈣離子通道的膜電流。

失活曲線：采用雙脈沖刺激方法，保持電位為-40 mV，先以起始于-40 mV、終止于10 mV，以5 mV步進(jìn)、時(shí)長(zhǎng)為1 000 ms的電壓刺激細(xì)胞后，即刻給予10 mV、時(shí)長(zhǎng)為200 ms的電壓刺激，刺激頻率0.2 Hz，觀察該刺激條件下電流的大小。

4.3 心房肌細(xì)胞INa的刺激模式 細(xì)胞外液及電極內(nèi)液中K+以等摩爾Cs+代替，所以鉀離子通道電流可完全去除。細(xì)胞外液中的Co2+可阻斷鈣離子通道。細(xì)胞外液中的NaCl使用CsCl部分代替使之減小，可減少鈉離子通道激活時(shí)Na+進(jìn)入細(xì)胞的量，從而減少靜止期鈉-鉀交換的量，減少細(xì)胞能量消耗，可明顯增加細(xì)胞的穩(wěn)定性。

I-V曲線：保持電位為-120 mV，以起始于-80 mV、終止于5 mV，以5 mV步進(jìn)、時(shí)長(zhǎng)為30 ms、刺激頻率為0.2 Hz的電壓刺激細(xì)胞，獲得在不同電壓下細(xì)胞總鈉離子通道的膜電流。

失活曲線：采用雙脈沖刺激方法，保持電位為-140 mV，先以起始于-140 mV、終止于-60 mV、5 mV步進(jìn)、時(shí)長(zhǎng)為1 000 ms的電壓刺激細(xì)胞后，即刻給予-40 mV、時(shí)長(zhǎng)為30 ms的電壓刺激，觀察該刺激條件下電流的大小。

靜態(tài)失活曲線：采用雙脈沖刺激方法，保持電位為-120 mV，先給予-75 mV、時(shí)長(zhǎng)逐漸增加(0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、350、400和500 ms)的刺激，間以保持電位3 ms后，給予-40 mV、時(shí)長(zhǎng)為30 ms的電壓刺激，觀察該刺激條件下電流的大小。

4.4 心房肌細(xì)胞IK的刺激模式 在記錄IK時(shí)，保持電位設(shè)置在-40 mV，此時(shí)鈉離子通道皆已失活。同時(shí)在細(xì)胞外液中加入了nifedipine，該物質(zhì)為選擇性鈣離子通道阻滯劑，可排除刺激中的鈣通道電流。

IK的I-V曲線：保持電位為-40 mV，先以起始于-40 mV、終止于60 mV，以10 mV步進(jìn)、時(shí)長(zhǎng)為2 000 ms的電壓刺激細(xì)胞，這時(shí)可獲得鉀離子通道的電壓依賴性電流(voltage-dependent current，Ivoltage)，然后電壓恢復(fù)至保持電位記錄1 500 ms，此時(shí)可獲得鉀離子通道的尾電流(tail current,Itail)。

快激活延遲整流鉀離子通道(rapid activating delayed rectifier potassium current，IKr)及慢激活延遲整流鉀離子通道(slow activating delayed rectifier pota-ssium current，IKs)的刺激模式與上述相似，只是前者刺激的時(shí)長(zhǎng)為200 ms，后者為5 000 ms。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0軟件。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)擬合采用SigmaPlot(Version 12.5， Systat Software Inc.)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 G-CSF對(duì)缺血心房肌細(xì)胞ICa，LI-V曲線、激活曲線和失活曲線的影響

1.1 對(duì)ICa，LI-V曲線的影響 圖1A顯示50 μg/kg及100 μg/kg的G-CSF對(duì)缺血心房肌細(xì)胞干預(yù)下ICa，L的變化，可見較缺血心房肌細(xì)胞ICa，L均有顯著的增加(P<0.05)。圖1B比較了經(jīng)細(xì)胞電容校正后得到的ICa，L的I-V曲線，反映了電流的電壓和電流值關(guān)系。從結(jié)果中可以看到隨著G-CSF干預(yù)濃度增加(50 μg/kg、100 μg/kg和300 μg/kg)，ICa，L密度均較缺血心房肌ICa，L密度明顯增大(P<0.05)，但G-CSF 300 μg/kg較100 μg/kgICa，L密度改善不明顯。除電流大小發(fā)生變化外，最大激活電壓在300 μg/kg時(shí)發(fā)生了變化，曲線右移。圖1C比較了G-CSF各種干預(yù)劑量下I-V曲線中電流密度的最大值與濃度之間的關(guān)系(為使對(duì)比明顯，取電流的絕對(duì)值作圖)。各干預(yù)組與缺血對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。各干預(yù)組中，100 μg/kg組和300 μg/kg組之間，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

1.2 對(duì)ICa，L激活曲線的影響 圖1D顯示的是以上各I-V曲線得到的激活曲線。利用上述I-V曲線得到各點(diǎn)對(duì)應(yīng)的通道電導(dǎo)(conductance，G)數(shù)值，再以各組中最大的電導(dǎo)數(shù)值作為固定分母，各點(diǎn)電導(dǎo)均可與之相比，即可得到各點(diǎn)的標(biāo)化電導(dǎo)值(G/Gmax)。以各點(diǎn)的刺激電壓為自變量，對(duì)應(yīng)標(biāo)化電導(dǎo)值作為因變量，即為激活曲線。激活曲線反映的是各刺激條件下離子通道的導(dǎo)電性變化情況，該曲線可以用Boltzmann方程y=1/{1+exp[(Vm-V0.5)/s]}擬合。不同濃度G-CSF干預(yù)下參數(shù)s未發(fā)生變化，V0.5在300 μg/kg濃度時(shí)明顯縮小，由缺血對(duì)照組的(-10.73±1.54) mV縮小為(-2.16±0.34) mV(P<0.01)，可見此時(shí)通道更容易被激活。

1.3 對(duì)ICa，L失活曲線的影響 以雙脈沖刺激中的第1次刺激時(shí)的電壓為自變量，第2次刺激時(shí)電流的負(fù)向最大值與其中最大值的比值(I/Imax)作為因變量。失活曲線反映的是第1次刺激后未失活的通道數(shù)量。經(jīng)標(biāo)化處理后反映了通道隨電壓逐漸增大時(shí)失活的 動(dòng)態(tài)變化，著重研究通道的失活動(dòng)力學(xué)，該曲線也可以用Boltzmann方程擬合。圖1E為使用圖示刺激模式在第2次刺激時(shí)電流的變化情況?？梢婋S著第1次刺激電壓的逐漸增高，通道的失活比例也逐漸增高，在第2次刺激時(shí)電流也越來(lái)越小。將電流標(biāo)化后由I/Imax得到的失活曲線見圖1F。各條曲線均可經(jīng)Boltzmann方程擬合。各曲線擬合后的參數(shù)V0.5及s之間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。因此在G-CSF急性干預(yù)下缺血心房肌細(xì)胞ICa，L的失活動(dòng)力學(xué)未見明顯改變。

Figure 1.The effects of G-CSF onI-Vcurve (A～C), activation curve (D) and availability (E, F) ofICa,Lof ischemic atrial myocytes. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsG-CSF 0 μg/kg group；##P<0.01vsG-CSF 50 μg/kg group.

圖1 G-CSF對(duì)缺血心房肌細(xì)胞ICa.LI-V曲線、激活曲線和失活曲線的影響

2 G-CSF對(duì)缺血心房肌細(xì)胞INaI-V曲線、激活曲線、失活曲線和靜態(tài)失活曲線的影響

2.1 對(duì)INaI-V曲線的影響 圖2A顯示為缺血對(duì)照組和G-CSF 300 μg/kg急性干預(yù)組缺血心房肌細(xì)胞INa。圖2B為各G-CSF干預(yù)組及缺血對(duì)照組的INaI-V曲線。在缺血對(duì)照組和各濃度G-CSF干預(yù)組都在-40 mV左右獲得最大值，各曲線的最大電流值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2.2 對(duì)INa激活曲線的影響 圖2C為由I-V曲線計(jì)算的g得到的激活曲線。曲線均可用Boltzmann方程擬合。各濃度G-CSF 干預(yù)下激活曲線的擬合參數(shù)(s和V0.5)與缺血對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2.3 對(duì)INa失活曲線的影響 圖2D為失活曲線的刺激模式及電流形式。圖2E為將得到的電流進(jìn)行標(biāo)化處理，即將各條件下的電流除以不同電壓下的最大電流得到I/Imax，與刺激電壓作圖得到失活曲線。曲線均可用Boltzmann方程擬合。兩者擬合參數(shù)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2.4 對(duì)INa靜態(tài)失活曲線的影響 圖2F為靜態(tài)失活曲線的刺激模式及得到的電流。靜態(tài)失活曲線反映的是通道在穩(wěn)定狀態(tài)下未失活的通道數(shù)量。經(jīng)標(biāo)化處理后體現(xiàn)了通道在某一恒定電壓時(shí)失活的動(dòng)態(tài)失活變化?？梢?，隨著-75 mV刺激時(shí)程的增加，電流逐漸減小。圖 2G為用刺激得到的最大電流做分母將得到的電流標(biāo)化的I/Imax，與-75 mV刺激時(shí)程作圖即可得到如圖靜態(tài)失活曲線。曲線可用單指數(shù)方程擬合，可得到時(shí)間常數(shù)τ，各濃度G-CSF干預(yù)組與缺血對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

Figure 2.The effects of G-CSF onI-Vcurve (A, B), activation curve (C), availability (D, E) and steady-state availability (F, G) ofINaof ischemic atrial myocytes. Mean±SD.n=6.

圖2 G-CSF對(duì)缺血心房肌細(xì)胞INaI-V曲線、激活曲線、失活曲線和靜態(tài)失活曲線的影響

3 G-CSF對(duì)缺血心房肌細(xì)胞IK、IKr和IKsI-V曲線的影響

3.1 對(duì)IKI-V曲線的影響 圖3A顯示的即為由上述刺激模式誘發(fā)的IK。圖3B比較各濃度G-CSF干預(yù)下電流密度的最大值，顯示它們之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。延遲整流鉀離子通道有快激活和慢激活2種成分，在這種刺激模式下，兩者不能完全區(qū)分。因此我們通過(guò)控制刺激時(shí)間來(lái)區(qū)分這2種電流。

3.2 對(duì)IKrI-V曲線的影響 改變刺激時(shí)程，在50 ms條件下，IKs尚沒(méi)有激活，此時(shí)的電流成分以快速激活延遲整流鉀離子通道為主，見圖3C。圖3D為電流密度I-V曲線。100 μg/kg和300 μg/kg的G-CSF干預(yù)條件下，最大激活電流與缺血對(duì)照組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，而50 μg/kg濃度條件下最大激活電流與缺血對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。100 μg/kg和300 μg/kg的G-CSF和正常對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但均與50 μg/kg的G-CSF之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。這表明隨G-CSF的濃度增加可以改善缺血心房肌細(xì)胞延遲整流鉀離子通道中的快速激活成分IKr。此外， 100 μg/kg濃度的G-CSF可能為干預(yù)的足夠濃度。

3.3 對(duì)IKsI-V曲線的影響 圖3E顯示在5 s的刺激時(shí)程下刺激細(xì)胞得到的延遲整流鉀離子通道電流，此時(shí)電流成分以慢激活成分為主。圖3F為其電流密度的I-V曲線。統(tǒng)計(jì)分析顯示G-CSF各濃度下最大電流密度之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

Figure 3.The effects of G-CSF onI-Vcurves ofIK(A, B),IKr(C, D) andIKs(E, F) of ischemic atrial myocytes. Mean±SD.n=6.

圖3 G-CSF對(duì)缺血心房肌細(xì)胞IK、IKr和IKsI-V曲線的影響

討 論

INa是多數(shù)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位0期除極的主要電流(在竇房結(jié)、房室結(jié)等部位的心肌細(xì)胞動(dòng)作電位0期除極主要電流為ICa，L)，INa增強(qiáng)或減弱會(huì)使0期除極的幅度、速度發(fā)生變化。ICa，L是心肌細(xì)胞2期復(fù)極時(shí)的主要內(nèi)向電流，它與IKr的外向電流對(duì)抗，形成了心肌細(xì)胞復(fù)極的平臺(tái)期。平臺(tái)期長(zhǎng)短是決定心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的主要因素。因此，ICa，L的抑制或IKr的增強(qiáng)可使平臺(tái)期時(shí)程縮短，加快細(xì)胞復(fù)極，縮短動(dòng)作電位時(shí)程，ICa，L的增強(qiáng)或IKr的減弱可發(fā)生相反的作用。心肌細(xì)胞2期復(fù)極晚期至3期復(fù)極早期時(shí)的主要電流則為IKs，其增強(qiáng)或縮短亦可使動(dòng)作電位時(shí)程相應(yīng)縮短或延長(zhǎng)。

目前對(duì)缺血心肌離子通道電流的變化主要集中在心室肌細(xì)胞[6]，在冠脈閉塞后24～48 h，心內(nèi)膜下心室肌細(xì)胞靜息膜電位及動(dòng)作電位上升支最大速率(Vmax)均下降，而復(fù)極時(shí)程增加。可能的離子通道機(jī)制為：(1) 跨膜鈉鉀交換的增加可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度的增加及鉀離子濃度的下降，引起外向鉀電流(Ito)及內(nèi)向整流性鉀通道電流(IK1)減小，使靜息電位水平下降。靜息膜電位降低開始可促進(jìn)鈉通道開放，過(guò)度降低則抑制開放，可引起Vmax降低，易于導(dǎo)致折返；(2)正常動(dòng)作電位復(fù)極快速1相主要為Ito，平臺(tái)期由ICa，L負(fù)責(zé)，晚期由IKr和IK1介導(dǎo)。急性心肌缺血后，Ito動(dòng)力學(xué)功能減弱、電流密度顯著減少、衰減加速且恢復(fù)活性時(shí)間顯著延遲；L型鈣通道電流顯著減少，使平臺(tái)期縮短，但其電壓依賴性不變；梗死心肌邊緣區(qū)域心肌細(xì)胞IKr、IKs表達(dá)下調(diào)，而IK1及INaCa表達(dá)不變。因此，此時(shí)的心肌細(xì)胞復(fù)極初期由INaCa及IKp(雙孔鉀通道背景電流)介導(dǎo)、平臺(tái)期由減弱的L型鈣通道電流介導(dǎo)、復(fù)極晚期主要由IK1介導(dǎo)，導(dǎo)致的結(jié)果為動(dòng)作電位形狀變?yōu)椤叭切巍?。我們的研究表明在缺血缺氧狀態(tài)下，心房肌細(xì)胞的離子通道變化類似于心室肌的離子通道變化。

本研究中，我們利用膜片鉗技術(shù)研究了急性G-CSF干預(yù)對(duì)缺血心房肌細(xì)胞膜離子通道的影響。研究結(jié)果表明，隨G-CSF濃度增加，缺血心房細(xì)胞膜L型鈣通道電流較缺血對(duì)照組有明顯增大，可能對(duì)穩(wěn)定動(dòng)作電位平臺(tái)期有重要作用。當(dāng)G-CSF濃度超過(guò)100 μg/kg后L型鈣通道電流的增強(qiáng)維持于同一水平。當(dāng)給予G-CSF 300 μg/kg時(shí)最大激活電壓發(fā)生改變，較前有所增加，表明該濃度下激活鈣離子通道更難。激活曲線與失活曲線未見明顯改變，表明G-CSF濃度變化對(duì)總體鈣離子激活及失活動(dòng)力學(xué)無(wú)明顯影響。綜合G-CSF不同濃度對(duì)缺血心房肌細(xì)胞膜L型鈣離子通道的干預(yù)結(jié)果，100 μg/kg G-CSF為理想濃度。G-CSF不同濃度對(duì)缺血心房細(xì)胞膜鈉離子通道電流無(wú)明顯影響，提示G-CSF不影響動(dòng)作電位0相除極。此外，通過(guò)對(duì)G-CSF干預(yù)缺血心房細(xì)胞膜延遲整流鉀電流研究，發(fā)現(xiàn)總體延遲整流鉀電流未見明顯改變，但I(xiàn)Kr在G-CSF干預(yù)后明顯增加，而IKs未見明顯改變。由于動(dòng)作電位平臺(tái)期主要由ICa，L和IKr負(fù)責(zé)，平臺(tái)期時(shí)程的長(zhǎng)短主要決定于兩者之間的電流比例。

目前G-CSF應(yīng)用于心肌缺血后治療已經(jīng)進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)階段[7-8]，但效果仍充滿爭(zhēng)議。此外，陸續(xù)有研究報(bào)道了應(yīng)用G-CSF對(duì)心律失常發(fā)生的影響。2006年，Kuhlmann等[9]研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF與干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)聯(lián)合應(yīng)用可以增加梗死心肌邊緣區(qū)域心肌細(xì)胞直徑、動(dòng)脈生成及connexin43 (Cx43)蛋白表達(dá)，進(jìn)而使室性心動(dòng)過(guò)速發(fā)生率下降。2007年Kuwabara等[10]研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF可以直接作用于心肌細(xì)胞表面G-CSF受體(G-CSF receptor)進(jìn)而激活Wnt和Jak2信號(hào)通路，上調(diào)Cx43蛋白及磷酸化水平，通過(guò)募集β-catenin和cadherin蛋白保護(hù)心肌細(xì)胞之間縫隙連接功能。2011年，我們的研究結(jié)果[11]同樣發(fā)現(xiàn)G-CSF干預(yù)能夠減少室性心律失常發(fā)生率，但心功能惡化。同樣在2011年，Kanlop等[12]研究發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，即G-CSF能夠改善缺血/再灌注梗死心肌電生理參數(shù)。但也有研究發(fā)現(xiàn)G-CSF不利結(jié)果。Lee等[13]發(fā)現(xiàn)G-CSF可以通過(guò)影響心臟交感神經(jīng)再分布促心律失常發(fā)生。2012年，Baldo等[14]發(fā)現(xiàn)G-CSF對(duì)缺血心肌電生理效應(yīng)具有兩面性，一方面可以減少室性心律失常發(fā)生率，另一面不利于室顫的自主復(fù)律。綜合上述研究結(jié)果，G-CSF在對(duì)心肌缺血后心律失常的發(fā)生有利有弊，可能通過(guò)不同的機(jī)制影響心肌電生理參數(shù)。我們的研究首次對(duì)缺血心房肌細(xì)胞進(jìn)行離子通道水平的電生理研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)G-CSF干預(yù)能夠改善缺血心房肌細(xì)胞L型鈣離子通道電流，而鈉離子通道電流未受影響，說(shuō)明急性G-CSF干預(yù)能通過(guò)增加鈣離子內(nèi)流改善缺血心房肌的電生理特性。增加的鈣離子內(nèi)流可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮力，延緩缺血心臟的機(jī)械重構(gòu)；而且可以通過(guò)調(diào)節(jié)Na+/Ca2+生電交換體改善心肌細(xì)胞線粒體功能，使之產(chǎn)生足夠的能量供應(yīng)缺血條件下心肌細(xì)胞的需求，表現(xiàn)在動(dòng)作電位上為平臺(tái)期延長(zhǎng)，可以有效地減少早期后除極和晚期后除極的發(fā)生，避免因觸發(fā)機(jī)制引起的房性心律失常。同時(shí)，G-CSF干預(yù)表明，100 μg/kg為最佳干預(yù)劑量。小于100 μg/kg時(shí)，隨G-CSF劑量增加離子電流改善程度增大，而大于100 μg/kg，除最大激活電位發(fā)生改變外，電流改善程度基本維持于平臺(tái)期，這提示并不是G-CSF量越多越好，而是有一定的劑量限制。

G-CSF對(duì)離體缺血心房肌細(xì)胞的作用可能通過(guò)心房肌細(xì)胞表面G-CSF受體實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)在小鼠和大鼠心肌細(xì)胞上檢測(cè)到G-CSF受體的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)[15]。近期研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF能夠以劑量依賴性方式顯著激活Jak2、STAT1和STAT3，通過(guò)Jak2-STAT3途徑對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[15-16]。且G-CSF可以通過(guò)Akt-eNOS路徑對(duì)I/R心臟發(fā)揮急性保護(hù)作用[15]，提示G-CSF可能通過(guò)與心肌細(xì)胞表面G-CSF受體結(jié)合，激活下游路徑改善心肌細(xì)胞電生理參數(shù)。Cx43廣泛分布于心房和心室，負(fù)責(zé)心肌細(xì)胞間的低電阻信號(hào)傳導(dǎo)。2015年，饒芳等[17]研究發(fā)現(xiàn)心房肌中的Cx43可通過(guò)與L型鈣通道形成分子復(fù)合物，調(diào)控L型鈣電流，參與心房肌細(xì)胞的電重塑。心肌缺血條件下Cx43表達(dá)下降[18]，而G-CSF對(duì)缺血心肌急性干預(yù)使鈣內(nèi)流增加，有利于細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的重新恢復(fù)，避免了后期因鈣超載產(chǎn)生的Cx43內(nèi)化，有助于缺血心肌細(xì)胞表面Cx43的維持[9]，減少心律失常的發(fā)生。

綜上所述，本研究較為全面地驗(yàn)證了G-CSF干預(yù)對(duì)缺血心房肌細(xì)胞部分離子通道的保護(hù)作用。目前自主神經(jīng)系統(tǒng)與免疫炎癥系統(tǒng)相互影響在心血管疾病中的作用越來(lái)越受到重視[19]，因此G-CSF能否通過(guò)心臟自主神經(jīng)叢調(diào)控房顫的免疫炎癥反應(yīng)是將來(lái)研究的重點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of G-CSF on calcium, sodium and potassium ion channel currents of ischemic atrial myocytes in guinea pig

LUO Tao1, GUO Mei2, SHI Cheng-long1, ZHOU Min1, JIA Zhong-wei1, PU Kui1

(1DepartmentofCardiology，2DepartmentofClinicalLaboratory,ChinesePLANo. 254Hospital,Tianjin300142,China.E-mail:tluo.cardiolab@live.com)

AIM: To observe the effects of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) on calcium, sodium and potassium ion channel currents of the ischemic atrial myocytes in guinea pig by whole-cell patch clamp technique. METHODS: The guinea pig atrial myocytes were obtained by enzymolysis. Under ischemia and hypoxia condition, whole-cell patch clamp was used to observe the effects of G-CSF at various concentrations on the changes of theI-Vcurve, activation curve and availability of L-type calcium channel current (ICa，L) and voltage-dependent sodium channel current (INa), as well asI-Vcurve of delayed rectifier potassium channel current (IK). RESULTS: Under ischemic condition, theI-Vcurves ofICa,Lwere changed by acute G-CSF intervention in a dose-dependent fashion. Except for G-CSF at dose of 300 μg/kg, the other concentrations of G-CSF did not change the activation curve and availability ofICa，L, indicating that the effects of G-CSF onICa，Lwere in a voltage-independent fashion. TheI-Vcurves ofICa，Lunder ischemic condition were gradually approaching the normal levels by the higher dose of G-CSF, while the effect of 300 μg/kg G-CSF onICa，Lwas similar to 100 μg/kg G-CSF. Acute G-CSF intervention at different doses did not changeI-Vcurve, activation curve, and availability or steady-state availability ofINa. As a part ofIK, the rapid activating component (IKr) was improved by 100 μg/kg and 300 μg/kg G-CSF intervention with the similar effects, while the slowly activating component (IKs) was not changed by G-CSF. CONCLUSION: G-CSF affects ion channel electrophysiological properties of ischemic atrial myocytes in a voltage-independent but concentration-dependent manner, thus reducing the incidence of atrial arrhythmia.

Granulocyte colony-stimulating factor; Sodium ion channels; L-type calcium ion channels; Delayed rectifier potassium ion channels; Atrial myocytes

1000- 4718(2017)05- 0857- 08

2016- 09- 21

2017- 02- 22

R541.7； R329.2+4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.015

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