G-CSF對豚鼠單個缺血心房肌細胞鈣、鈉、鉀電流的影響

羅 濤， 郭 梅， 史成龍， 周 敏， 賈忠偉， 浦 奎

(中國人民解放軍第254醫(yī)院 1心血管內(nèi)科, 2檢驗科， 天津 300142)

G-CSF對豚鼠單個缺血心房肌細胞鈣、鈉、鉀電流的影響

羅 濤1△， 郭 梅2， 史成龍1， 周 敏1， 賈忠偉1， 浦 奎1

(中國人民解放軍第254醫(yī)院1心血管內(nèi)科,2檢驗科， 天津 300142)

目的： 采用膜片鉗全細胞記錄方法，觀察粒細胞集落刺激因子(G-CSF)急性干預對分離的豚鼠單個缺血心房肌細胞鈣、鈉、鉀電流的影響。方法: 使用酶解方法獲得豚鼠單個心房肌細胞，在缺血缺氧條件下，采用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察記錄不同濃度G-CSF急性干預對鈣通道電流-電壓曲線、激活曲線、失活曲線，鈉通道電流-電壓曲線、激活曲線、失活曲線、靜態(tài)失活曲線，延遲整流鉀通道及其快成分、慢成分電流-電壓曲線的影響。結(jié)果: 隨G-CSF濃度的增加，缺血心房肌細胞膜L型鈣通道電流較缺血對照組有明顯增大。當G-CSF濃度超過100 μg/kg后,L型鈣通道電流的增強維持于同一水平。當給予G-CSF濃度為300 μg/kg時最大激活電壓發(fā)生改變，較前有所增加。激活曲線與失活曲線未見明顯改變。不同濃度G-CSF對缺血心房肌細胞膜鈉離子通道電流無明顯影響。G-CSF干預缺血心房肌細胞膜延遲整流鉀電流未見明顯改變，但延遲整流鉀電流快成分在G-CSF 100 μg/kg干預后明顯增加，而延遲整流鉀電流慢成分未見明顯改變。結(jié)論: G-CSF對于缺血心房肌細胞部分通道的作用影響基本為非電壓依賴性，但具有濃度依賴性，可能減少缺血心房心律失常的發(fā)生率。

粒細胞集落刺激因子； 鈉通道； L型鈣通道； 延遲整流鉀通道； 心房肌細胞

心肌缺血后房性心律失常的發(fā)生很常見，可能的原因為缺血的心房肌組織不能通過細胞再生修復，只能由無收縮功能的瘢痕組織替代，形成促心律失常發(fā)生基質(zhì)，并通過改變心肌離子通道功能，促進房性心律失常的發(fā)生，即“致心律失常性重構(gòu)”。

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)作為一種能動員骨髓中多種干細胞的細胞因子，在心肌梗死后的修復治療中具有良好的應(yīng)用前景。研究者們做了大量的工作以驗證G-CSF治療心肌梗死的療效，對其作用機制進行了積極探索，發(fā)現(xiàn)了G-CSF除動員骨髓干細胞以外的許多機制，特別是G-CSF對靶細胞的直接保護作用機制。從現(xiàn)有資料可以看出，G-CSF的作用機制主要分為骨髓動員效應(yīng)及其與靶細胞受體的直接作用效應(yīng)，可以歸結(jié)為“CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor-4，CXCR4)途徑效應(yīng)”和“非CXCR4途徑效應(yīng)”。這兩個途徑最主要區(qū)別在于是否有CXCR4的參與。CXCR4是干細胞表面的一種趨化因子受體，與其特異性配體——基質(zhì)細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1；又稱CXCL12)結(jié)合，使干細胞錨定在骨髓中。G-CSF通過多種機制作用于CXCR4/SDF-1復合體[1]，使骨髓干細胞釋放入外周血，隨后外周血中CXCR4+干細胞在缺氧組織高表達的SDF-1的趨化作用下，遷移到組織局部。而G-CSF的直接作用效應(yīng)中并無CXCR4參與，G-CSF直接與細胞表面的G-CSF受體結(jié)合而發(fā)揮作用。

本研究采用全細胞膜片鉗技術(shù)，觀察了不同濃度G-CSF急性干預對分離的豚鼠缺血缺氧心房肌離子通道的影響，以初步探討是否G-CSF能夠通過“非CXCR4途徑效應(yīng)”影響缺血心房肌電生理特性，進而降低房性心律失常發(fā)生率。

材 料 和 方 法

1 溶液與試劑

HEPES-Tyrode’s液成分(mmol/L)：NaCl 137， KCl 5.4， MgCl21， NaH2PO4(2H2O) 0.33， CaCl21.8， HEPES 5， D-glucose 10 (使用NaOH調(diào)pH至7.3～7.4)。無鈣HEPES-Tyrode’s液或低鈣HEPES-Tyrode’s液分別為HEPES-Tyrode’s液中不加CaCl2或加入0.15 mmol/L CaCl2。

Kraft-Brühe (KB)液成分(mmol/L)：L-谷氨酸鉀 50， KCl 25， ?；撬?10， MgCl23， KH2PO410， EGTA 0.5， KHPO410、D-glucose 10， HEPES 10 (使用KOH調(diào)pH至7.3～7.4)。

記錄L型鈣離子通道電流(ICa，L)的電極內(nèi)液成分(mmol/L)：CsCl 100， TEA-Cl 20， HEPES 5， MgATP 3， EGTA 10， MgCl23 (使用CsOH調(diào)pH至7.2～7.3)。細胞外液成分(mmol/L)：NaCl 137， CsCl 5.4， MgCl20.5， CaCl21.8， HEPES 10， D-glucose 5 (使用NaOH調(diào)pH至7.3～7.4)。

記錄電壓依賴性鈉離子通道電流(INa)的電極內(nèi)液成分(mmol/L)：NaCl 5， CsCl 20， CsF 110， MgCl21， HEPES 5， EGTA 5， MgATP 5 (使用CsOH調(diào)pH至7.2～7.3)。細胞外液成分(mmol/L)：NaCl 5， CsCl 135， MgCl21， D-glucose 10， CaCl20.5， HEPES 10， CoCl2·6H2O 0.5 (使用CsOH調(diào)pH至7.2～7.3)。

記錄電壓依賴性延遲整流外向性鉀離子通道電流(IK)的電極內(nèi)液成分(mmol/L)：天門冬氨酸鉀 120， KCl 30， EGTA 10， HEPES 5， MgATP 4， MgCl21 (使用KOH調(diào)pH至7.2～7.3)。細胞外液成分為HEPES-Tyrode’s液+5 μmol/L nitredipine。

模擬缺血缺氧液[2-3](mmol/L)：NaCl 134， KCl 5.4， CaCl21.8， MgCl20.5， NaHCO33.8， NaH2PO40.9， 乳酸20 (維持pH值為6.8)。

2 離體低氧心肌細胞模型的建立

給模擬缺血缺氧液持續(xù)通氮氣15 min，以恒定的灌流速度保持灌流液的低氧狀態(tài)。上述電極內(nèi)液配制后均使用0.24 μm濾器過濾，置于EP管中-40 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩＿M行G-CSF干預時，于相應(yīng)缺血缺氧細胞外液中加入一定濃度(0、50、100和300 μg/kg)G-CSF，其余液體成分不變。上述試劑中L-谷氨酸鉀、TEA-Cl和MgATP為Sigma生產(chǎn)，所使用Ⅱ型膠原酶為Introgen生產(chǎn)，其余為國產(chǎn)分析純。

3 心房肌細胞的分離

參考Eto等[4]的方法，使用Langendorff灌流系統(tǒng)逆向灌流冠狀動脈，以膠原酶消化分解得到單個豚鼠心房肌細胞。健康成年豚鼠(250～350 g)，雌雄不拘，擊昏后迅速開胸取出心臟并放置于4 ℃ HEPES-Tyrode’s液中，經(jīng)初步修剪游離出主動脈根部后，于Langendorff心臟灌流裝置上行主動脈逆行灌流，灌流速度8～10 mL/min，灌流頭端溫度維持在37 ℃，灌流過程中始終予以100%純氧飽和，氧流量0.3 L～0.5 L/min。先使用無鈣HEPES-Tyrode’s液以恒定壓力(50 cmH2O)灌流5 min以沖洗殘留血液并松解心肌結(jié)締組織，再使用含有0.01%Ⅱ型膠原酶和0.1%牛血清白蛋白的低鈣(含50 μmol/L)HEPES-Tyrode’s液灌流消化心房肌細胞。灌流過程中密切觀察心房顏色、質(zhì)地等變化，約經(jīng)5～7 min后，用2把眼科鑷每隔1～2 min相向輕輕壓迫心臟1次，如感到心臟變軟，顏色漸白，流出液體出現(xiàn)“拉絲”現(xiàn)象，此時停止灌流。為促進分離的心房肌細胞耐鈣，我們繼續(xù)用200 μmol/L低鈣臺式液灌流心臟5 min，灌流速度10 mL/min。剪下兩側(cè)心房，室溫下先于適量KB液沖洗2～3次洗凈酶液，再放置于5～10 mL KB液中剪碎組織成1 mm×1 mm×1 mm大小，并使用滴管小心吹打5～10 min。最后細胞懸濁液經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后,放置于4 ℃環(huán)境穩(wěn)定1 h后使用，于10 h內(nèi)完成實驗。KB液為高鉀低鈉無鈣成分，可保護心肌細胞，并提高其耐鈣水平。

4 通道電流的記錄和刺激模式

4.1 通道電流的記錄 吸取適量細胞懸液滴加于灌流槽中，放置15～20 min使細胞牢固貼壁后，使用相應(yīng)缺血缺氧細胞外液以約5 mL/min勻速灌流并持續(xù)通氮氣15 min，使細胞逐漸復鈣并建立缺血缺氧細胞模型，10～20 min后，于倒置顯微鏡下選擇貼壁牢固、無跳動、橫紋清晰、折光性好且立體感強的細胞進行實驗。采用Hamill等[5]確立的標準全細胞膜片鉗記錄技術(shù)，在電壓鉗模式下記錄細胞膜電位和全細胞電流。使用Multiclamp 700A信號放大器(Axon Instrument Inc.)采集數(shù)據(jù)，并經(jīng)DIGIDATA 1320A數(shù)/模轉(zhuǎn)換器(Axon Instrument Inc.)將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，最后采用pCLAMP軟件包(Version 8.2.0.235， Axon Instrument Inc.)記錄至電腦硬盤并加以分析。數(shù)據(jù)采集經(jīng)2 kHz低通濾波器濾波，并以10 kHz記錄數(shù)據(jù)。微電極采用P-97水平微電極拉制儀(Sutter Instrument Company)，使用二步拉制法拉制玻璃微電極，控制電極電阻在2 MΩ～5 MΩ。

4.2 心房肌細胞ICa，L的刺激模式 細胞外液及電極內(nèi)液中K+以等摩爾Cs+代替，同時使用TEA-Cl阻斷IK，所以鉀離子通道電流可完全去除。測量時將保持電位設(shè)為-40 mV，此時Na+通道已經(jīng)失活，故可排除Na+通道電流。

電流-電壓曲線(I-V曲線)：保持電位為-40 mV，以起始于-30 mV、終止于50 mV，以10 mV步進、時長為200 ms的電壓刺激細胞，刺激頻率0.2 Hz。獲得在不同電壓下細胞總鈣離子通道的膜電流。

失活曲線：采用雙脈沖刺激方法，保持電位為-40 mV，先以起始于-40 mV、終止于10 mV，以5 mV步進、時長為1 000 ms的電壓刺激細胞后，即刻給予10 mV、時長為200 ms的電壓刺激，刺激頻率0.2 Hz，觀察該刺激條件下電流的大小。

4.3 心房肌細胞INa的刺激模式 細胞外液及電極內(nèi)液中K+以等摩爾Cs+代替，所以鉀離子通道電流可完全去除。細胞外液中的Co2+可阻斷鈣離子通道。細胞外液中的NaCl使用CsCl部分代替使之減小，可減少鈉離子通道激活時Na+進入細胞的量，從而減少靜止期鈉-鉀交換的量，減少細胞能量消耗，可明顯增加細胞的穩(wěn)定性。

I-V曲線：保持電位為-120 mV，以起始于-80 mV、終止于5 mV，以5 mV步進、時長為30 ms、刺激頻率為0.2 Hz的電壓刺激細胞，獲得在不同電壓下細胞總鈉離子通道的膜電流。

失活曲線：采用雙脈沖刺激方法，保持電位為-140 mV，先以起始于-140 mV、終止于-60 mV、5 mV步進、時長為1 000 ms的電壓刺激細胞后，即刻給予-40 mV、時長為30 ms的電壓刺激，觀察該刺激條件下電流的大小。

靜態(tài)失活曲線：采用雙脈沖刺激方法，保持電位為-120 mV，先給予-75 mV、時長逐漸增加(0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、225、250、275、300、350、400和500 ms)的刺激，間以保持電位3 ms后，給予-40 mV、時長為30 ms的電壓刺激，觀察該刺激條件下電流的大小。

4.4 心房肌細胞IK的刺激模式 在記錄IK時，保持電位設(shè)置在-40 mV，此時鈉離子通道皆已失活。同時在細胞外液中加入了nifedipine，該物質(zhì)為選擇性鈣離子通道阻滯劑，可排除刺激中的鈣通道電流。

IK的I-V曲線：保持電位為-40 mV，先以起始于-40 mV、終止于60 mV，以10 mV步進、時長為2 000 ms的電壓刺激細胞，這時可獲得鉀離子通道的電壓依賴性電流(voltage-dependent current，Ivoltage)，然后電壓恢復至保持電位記錄1 500 ms，此時可獲得鉀離子通道的尾電流(tail current,Itail)。

快激活延遲整流鉀離子通道(rapid activating delayed rectifier potassium current，IKr)及慢激活延遲整流鉀離子通道(slow activating delayed rectifier pota-ssium current，IKs)的刺激模式與上述相似，只是前者刺激的時長為200 ms，后者為5 000 ms。

5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 16.0軟件。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。數(shù)據(jù)擬合采用SigmaPlot(Version 12.5， Systat Software Inc.)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 G-CSF對缺血心房肌細胞ICa，LI-V曲線、激活曲線和失活曲線的影響

1.1 對ICa，LI-V曲線的影響 圖1A顯示50 μg/kg及100 μg/kg的G-CSF對缺血心房肌細胞干預下ICa，L的變化，可見較缺血心房肌細胞ICa，L均有顯著的增加(P<0.05)。圖1B比較了經(jīng)細胞電容校正后得到的ICa，L的I-V曲線，反映了電流的電壓和電流值關(guān)系。從結(jié)果中可以看到隨著G-CSF干預濃度增加(50 μg/kg、100 μg/kg和300 μg/kg)，ICa，L密度均較缺血心房肌ICa，L密度明顯增大(P<0.05)，但G-CSF 300 μg/kg較100 μg/kgICa，L密度改善不明顯。除電流大小發(fā)生變化外，最大激活電壓在300 μg/kg時發(fā)生了變化，曲線右移。圖1C比較了G-CSF各種干預劑量下I-V曲線中電流密度的最大值與濃度之間的關(guān)系(為使對比明顯，取電流的絕對值作圖)。各干預組與缺血對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。各干預組中，100 μg/kg組和300 μg/kg組之間，各組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

1.2 對ICa，L激活曲線的影響 圖1D顯示的是以上各I-V曲線得到的激活曲線。利用上述I-V曲線得到各點對應(yīng)的通道電導(conductance，G)數(shù)值，再以各組中最大的電導數(shù)值作為固定分母，各點電導均可與之相比，即可得到各點的標化電導值(G/Gmax)。以各點的刺激電壓為自變量，對應(yīng)標化電導值作為因變量，即為激活曲線。激活曲線反映的是各刺激條件下離子通道的導電性變化情況，該曲線可以用Boltzmann方程y=1/{1+exp[(Vm-V0.5)/s]}擬合。不同濃度G-CSF干預下參數(shù)s未發(fā)生變化，V0.5在300 μg/kg濃度時明顯縮小，由缺血對照組的(-10.73±1.54) mV縮小為(-2.16±0.34) mV(P<0.01)，可見此時通道更容易被激活。

1.3 對ICa，L失活曲線的影響 以雙脈沖刺激中的第1次刺激時的電壓為自變量，第2次刺激時電流的負向最大值與其中最大值的比值(I/Imax)作為因變量。失活曲線反映的是第1次刺激后未失活的通道數(shù)量。經(jīng)標化處理后反映了通道隨電壓逐漸增大時失活的 動態(tài)變化，著重研究通道的失活動力學，該曲線也可以用Boltzmann方程擬合。圖1E為使用圖示刺激模式在第2次刺激時電流的變化情況?？梢婋S著第1次刺激電壓的逐漸增高，通道的失活比例也逐漸增高，在第2次刺激時電流也越來越小。將電流標化后由I/Imax得到的失活曲線見圖1F。各條曲線均可經(jīng)Boltzmann方程擬合。各曲線擬合后的參數(shù)V0.5及s之間經(jīng)統(tǒng)計學比較差異無統(tǒng)計學顯著性。因此在G-CSF急性干預下缺血心房肌細胞ICa，L的失活動力學未見明顯改變。

Figure 1.The effects of G-CSF onI-Vcurve (A～C), activation curve (D) and availability (E, F) ofICa,Lof ischemic atrial myocytes. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsG-CSF 0 μg/kg group；##P<0.01vsG-CSF 50 μg/kg group.

圖1 G-CSF對缺血心房肌細胞ICa.LI-V曲線、激活曲線和失活曲線的影響

2 G-CSF對缺血心房肌細胞INaI-V曲線、激活曲線、失活曲線和靜態(tài)失活曲線的影響

2.1 對INaI-V曲線的影響 圖2A顯示為缺血對照組和G-CSF 300 μg/kg急性干預組缺血心房肌細胞INa。圖2B為各G-CSF干預組及缺血對照組的INaI-V曲線。在缺血對照組和各濃度G-CSF干預組都在-40 mV左右獲得最大值，各曲線的最大電流值的差異無統(tǒng)計學顯著性。

2.2 對INa激活曲線的影響 圖2C為由I-V曲線計算的g得到的激活曲線。曲線均可用Boltzmann方程擬合。各濃度G-CSF 干預下激活曲線的擬合參數(shù)(s和V0.5)與缺血對照組相比差異無統(tǒng)計學顯著性。

2.3 對INa失活曲線的影響 圖2D為失活曲線的刺激模式及電流形式。圖2E為將得到的電流進行標化處理，即將各條件下的電流除以不同電壓下的最大電流得到I/Imax，與刺激電壓作圖得到失活曲線。曲線均可用Boltzmann方程擬合。兩者擬合參數(shù)之間的差異無統(tǒng)計學顯著性。

2.4 對INa靜態(tài)失活曲線的影響 圖2F為靜態(tài)失活曲線的刺激模式及得到的電流。靜態(tài)失活曲線反映的是通道在穩(wěn)定狀態(tài)下未失活的通道數(shù)量。經(jīng)標化處理后體現(xiàn)了通道在某一恒定電壓時失活的動態(tài)失活變化?？梢?，隨著-75 mV刺激時程的增加，電流逐漸減小。圖 2G為用刺激得到的最大電流做分母將得到的電流標化的I/Imax，與-75 mV刺激時程作圖即可得到如圖靜態(tài)失活曲線。曲線可用單指數(shù)方程擬合，可得到時間常數(shù)τ，各濃度G-CSF干預組與缺血對照組相比差異無統(tǒng)計學顯著性。

Figure 2.The effects of G-CSF onI-Vcurve (A, B), activation curve (C), availability (D, E) and steady-state availability (F, G) ofINaof ischemic atrial myocytes. Mean±SD.n=6.

圖2 G-CSF對缺血心房肌細胞INaI-V曲線、激活曲線、失活曲線和靜態(tài)失活曲線的影響

3 G-CSF對缺血心房肌細胞IK、IKr和IKsI-V曲線的影響

3.1 對IKI-V曲線的影響 圖3A顯示的即為由上述刺激模式誘發(fā)的IK。圖3B比較各濃度G-CSF干預下電流密度的最大值，顯示它們之間的差異無統(tǒng)計學顯著性。延遲整流鉀離子通道有快激活和慢激活2種成分，在這種刺激模式下，兩者不能完全區(qū)分。因此我們通過控制刺激時間來區(qū)分這2種電流。

3.2 對IKrI-V曲線的影響 改變刺激時程，在50 ms條件下，IKs尚沒有激活，此時的電流成分以快速激活延遲整流鉀離子通道為主，見圖3C。圖3D為電流密度I-V曲線。100 μg/kg和300 μg/kg的G-CSF干預條件下，最大激活電流與缺血對照組之間的差異均有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，而50 μg/kg濃度條件下最大激活電流與缺血對照組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性。100 μg/kg和300 μg/kg的G-CSF和正常對照組之間差異無統(tǒng)計學顯著性，但均與50 μg/kg的G-CSF之間存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。這表明隨G-CSF的濃度增加可以改善缺血心房肌細胞延遲整流鉀離子通道中的快速激活成分IKr。此外， 100 μg/kg濃度的G-CSF可能為干預的足夠濃度。

3.3 對IKsI-V曲線的影響 圖3E顯示在5 s的刺激時程下刺激細胞得到的延遲整流鉀離子通道電流，此時電流成分以慢激活成分為主。圖3F為其電流密度的I-V曲線。統(tǒng)計分析顯示G-CSF各濃度下最大電流密度之間的差異無統(tǒng)計學顯著性。

Figure 3.The effects of G-CSF onI-Vcurves ofIK(A, B),IKr(C, D) andIKs(E, F) of ischemic atrial myocytes. Mean±SD.n=6.

圖3 G-CSF對缺血心房肌細胞IK、IKr和IKsI-V曲線的影響

討 論

INa是多數(shù)心肌細胞動作電位0期除極的主要電流(在竇房結(jié)、房室結(jié)等部位的心肌細胞動作電位0期除極主要電流為ICa，L)，INa增強或減弱會使0期除極的幅度、速度發(fā)生變化。ICa，L是心肌細胞2期復極時的主要內(nèi)向電流，它與IKr的外向電流對抗，形成了心肌細胞復極的平臺期。平臺期長短是決定心肌細胞動作電位時程的主要因素。因此，ICa，L的抑制或IKr的增強可使平臺期時程縮短，加快細胞復極，縮短動作電位時程，ICa，L的增強或IKr的減弱可發(fā)生相反的作用。心肌細胞2期復極晚期至3期復極早期時的主要電流則為IKs，其增強或縮短亦可使動作電位時程相應(yīng)縮短或延長。

目前對缺血心肌離子通道電流的變化主要集中在心室肌細胞[6]，在冠脈閉塞后24～48 h，心內(nèi)膜下心室肌細胞靜息膜電位及動作電位上升支最大速率(Vmax)均下降，而復極時程增加?？赡艿碾x子通道機制為：(1) 跨膜鈉鉀交換的增加可導致細胞內(nèi)鈉離子濃度的增加及鉀離子濃度的下降，引起外向鉀電流(Ito)及內(nèi)向整流性鉀通道電流(IK1)減小，使靜息電位水平下降。靜息膜電位降低開始可促進鈉通道開放，過度降低則抑制開放，可引起Vmax降低，易于導致折返；(2)正常動作電位復極快速1相主要為Ito，平臺期由ICa，L負責，晚期由IKr和IK1介導。急性心肌缺血后，Ito動力學功能減弱、電流密度顯著減少、衰減加速且恢復活性時間顯著延遲；L型鈣通道電流顯著減少，使平臺期縮短，但其電壓依賴性不變；梗死心肌邊緣區(qū)域心肌細胞IKr、IKs表達下調(diào)，而IK1及INaCa表達不變。因此，此時的心肌細胞復極初期由INaCa及IKp(雙孔鉀通道背景電流)介導、平臺期由減弱的L型鈣通道電流介導、復極晚期主要由IK1介導，導致的結(jié)果為動作電位形狀變?yōu)椤叭切巍薄Ｎ覀兊难芯勘砻髟谌毖毖鯛顟B(tài)下，心房肌細胞的離子通道變化類似于心室肌的離子通道變化。

本研究中，我們利用膜片鉗技術(shù)研究了急性G-CSF干預對缺血心房肌細胞膜離子通道的影響。研究結(jié)果表明，隨G-CSF濃度增加，缺血心房細胞膜L型鈣通道電流較缺血對照組有明顯增大，可能對穩(wěn)定動作電位平臺期有重要作用。當G-CSF濃度超過100 μg/kg后L型鈣通道電流的增強維持于同一水平。當給予G-CSF 300 μg/kg時最大激活電壓發(fā)生改變，較前有所增加，表明該濃度下激活鈣離子通道更難。激活曲線與失活曲線未見明顯改變，表明G-CSF濃度變化對總體鈣離子激活及失活動力學無明顯影響。綜合G-CSF不同濃度對缺血心房肌細胞膜L型鈣離子通道的干預結(jié)果，100 μg/kg G-CSF為理想濃度。G-CSF不同濃度對缺血心房細胞膜鈉離子通道電流無明顯影響，提示G-CSF不影響動作電位0相除極。此外，通過對G-CSF干預缺血心房細胞膜延遲整流鉀電流研究，發(fā)現(xiàn)總體延遲整流鉀電流未見明顯改變，但IKr在G-CSF干預后明顯增加，而IKs未見明顯改變。由于動作電位平臺期主要由ICa，L和IKr負責，平臺期時程的長短主要決定于兩者之間的電流比例。

目前G-CSF應(yīng)用于心肌缺血后治療已經(jīng)進入III期臨床試驗階段[7-8]，但效果仍充滿爭議。此外，陸續(xù)有研究報道了應(yīng)用G-CSF對心律失常發(fā)生的影響。2006年，Kuhlmann等[9]研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF與干細胞因子(stem cell factor，SCF)聯(lián)合應(yīng)用可以增加梗死心肌邊緣區(qū)域心肌細胞直徑、動脈生成及connexin43 (Cx43)蛋白表達，進而使室性心動過速發(fā)生率下降。2007年Kuwabara等[10]研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF可以直接作用于心肌細胞表面G-CSF受體(G-CSF receptor)進而激活Wnt和Jak2信號通路，上調(diào)Cx43蛋白及磷酸化水平，通過募集β-catenin和cadherin蛋白保護心肌細胞之間縫隙連接功能。2011年，我們的研究結(jié)果[11]同樣發(fā)現(xiàn)G-CSF干預能夠減少室性心律失常發(fā)生率，但心功能惡化。同樣在2011年，Kanlop等[12]研究發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，即G-CSF能夠改善缺血/再灌注梗死心肌電生理參數(shù)。但也有研究發(fā)現(xiàn)G-CSF不利結(jié)果。Lee等[13]發(fā)現(xiàn)G-CSF可以通過影響心臟交感神經(jīng)再分布促心律失常發(fā)生。2012年，Baldo等[14]發(fā)現(xiàn)G-CSF對缺血心肌電生理效應(yīng)具有兩面性，一方面可以減少室性心律失常發(fā)生率，另一面不利于室顫的自主復律。綜合上述研究結(jié)果，G-CSF在對心肌缺血后心律失常的發(fā)生有利有弊，可能通過不同的機制影響心肌電生理參數(shù)。我們的研究首次對缺血心房肌細胞進行離子通道水平的電生理研究，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)G-CSF干預能夠改善缺血心房肌細胞L型鈣離子通道電流，而鈉離子通道電流未受影響，說明急性G-CSF干預能通過增加鈣離子內(nèi)流改善缺血心房肌的電生理特性。增加的鈣離子內(nèi)流可以增強心肌細胞的收縮力，延緩缺血心臟的機械重構(gòu)；而且可以通過調(diào)節(jié)Na+/Ca2+生電交換體改善心肌細胞線粒體功能，使之產(chǎn)生足夠的能量供應(yīng)缺血條件下心肌細胞的需求，表現(xiàn)在動作電位上為平臺期延長，可以有效地減少早期后除極和晚期后除極的發(fā)生，避免因觸發(fā)機制引起的房性心律失常。同時，G-CSF干預表明，100 μg/kg為最佳干預劑量。小于100 μg/kg時，隨G-CSF劑量增加離子電流改善程度增大，而大于100 μg/kg，除最大激活電位發(fā)生改變外，電流改善程度基本維持于平臺期，這提示并不是G-CSF量越多越好，而是有一定的劑量限制。

G-CSF對離體缺血心房肌細胞的作用可能通過心房肌細胞表面G-CSF受體實現(xiàn)。已經(jīng)在小鼠和大鼠心肌細胞上檢測到G-CSF受體的mRNA和蛋白質(zhì)表達[15]。近期研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF能夠以劑量依賴性方式顯著激活Jak2、STAT1和STAT3，通過Jak2-STAT3途徑對心肌細胞發(fā)揮保護作用[15-16]。且G-CSF可以通過Akt-eNOS路徑對I/R心臟發(fā)揮急性保護作用[15]，提示G-CSF可能通過與心肌細胞表面G-CSF受體結(jié)合，激活下游路徑改善心肌細胞電生理參數(shù)。Cx43廣泛分布于心房和心室，負責心肌細胞間的低電阻信號傳導。2015年，饒芳等[17]研究發(fā)現(xiàn)心房肌中的Cx43可通過與L型鈣通道形成分子復合物，調(diào)控L型鈣電流，參與心房肌細胞的電重塑。心肌缺血條件下Cx43表達下降[18]，而G-CSF對缺血心肌急性干預使鈣內(nèi)流增加，有利于細胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的重新恢復，避免了后期因鈣超載產(chǎn)生的Cx43內(nèi)化，有助于缺血心肌細胞表面Cx43的維持[9]，減少心律失常的發(fā)生。

綜上所述，本研究較為全面地驗證了G-CSF干預對缺血心房肌細胞部分離子通道的保護作用。目前自主神經(jīng)系統(tǒng)與免疫炎癥系統(tǒng)相互影響在心血管疾病中的作用越來越受到重視[19]，因此G-CSF能否通過心臟自主神經(jīng)叢調(diào)控房顫的免疫炎癥反應(yīng)是將來研究的重點。

[1] Kovacic JC, Muller DW, Graham RM. Actions and therapeutic potential of G-CSF and GM-CSF in cardiovascular disease[J]. J Mol Cell Cardiol, 2007, 42(1):19-33.

[2] 葉新和， 駱秉銓， 胡大一， 等. 胺碘酮對豚鼠缺血缺氧心肌細胞電生理影響的研究[J]. 中國心臟起搏與心電生理雜志, 2000, 14(3):74-75.

[3] 田志廣， 鄭 楊, 張文杰. 福辛普利預處理對缺氧復氧期豚鼠心Na+/Ca2+交換電流的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2006, 22(9):1852-1853,1872.

[4] Eto K, Hashimoto K, Nakaya H. Preferential inhibition ofIKrby MCI-154, a putative cardiotonic Ca2+sensitizer, in guinea pig atrial cells[J]. Cardiovasc Res, 1998, 38(3):685-694.

[5] Hamill OP, Marty A, Neher E, et al. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches[J]. Pflugers Arch, 1981, 391(2):85-100.

[6] 羅 濤， 李玉明. 心肌梗死后心室電重構(gòu)的細胞和分子生物學機制[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(11):2276-2281.

[7] Achilli F, Malafronte C, Cesana F, et al. Granulocyte-colony stimulating factor for large anterior ST-elevation myocardial infarction: rationale and design of the prospective randomized phase III STEM-AMI OUTCOME trial[J]. Am Heart J, 2015, 170(4):652-658.e7.

[8] Steppich B, Hadamitzky M, Ibrahim T, et al. Stem cell mobilisation by granulocyte-colony stimulating factor in patients with acute myocardial infarction. Long-term results of the REVIVAL-2 trial[J]. Thromb Haemost, 2016, 115(4):864-868.

[9] Kuhlmann MT, Kirchhof P, Klocke R, et al. G-CSF/SCF reduces inducible arrhythmias in the infarcted heart potentially via increased connexin43 expression and arteriogenesis[J]. J Exp Med, 2006, 203(1):87-97.

[10]Kuwabara M, Kakinuma Y, Katare RG, et al. Granulocyte colony-stimulating factor activates Wnt signal to sustain gap junction function through recruitment of beta-catenin and cadherin[J]. FEBS Lett, 2007, 581(25):4821-4830.

[11]Liu HM, Luo T, Zhou X, et al. Disassociation between left ventricular mechanical and electrical properties in ischemic rat heart after G-CSF treatment[J]. Cardiovasc Drugs Ther, 2011, 25(3):203-214.

[12]Kanlop N, Thommasorn S, Palee S, et al. Granulocyte colony-stimulating factor stabilizes cardiac electrophysiology and decreases infarct size during cardiac ischaemic/reperfusion in swine[J]. Acta Physiol (Oxf), 2011, 202(1):11-20.

[13]Lee TM, Chen CC, Chang NC. Granulocyte colony-stimulating factor increases sympathetic reinnervation and the arrhythmogenic response to programmed electrical stimulation after myocardial infarction in rats[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2009, 297(2):H512-H522.

[14]Baldo MP, Rodrigues SL, Mill JG. Acute effects of granulocyte colony-stimulating factor on early ventricular arrhythmias after coronary occlusion in rats[J]. J Pharmacol Pharmacother, 2012, 3(1):39-42.

[15]Harada M, Qin Y, Takano H, et al. G-CSF prevents cardiac remodeling after myocardial infarction by activating the Jak-Stat pathway in cardiomyocytes[J]. Nat Med, 2005, 11(3):305-311.

[16]Gnecchi M, He H, Liang OD, et al. Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-mo-dified mesenchymal stem cells[J]. Nat Med, 2005, 11(4):367-368.

[17]饒 芳， 薛玉梅， 鄧春玉， 等. 縫隙連接蛋白43通過調(diào)控L型鈣電流參與心房肌細胞的電重塑[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(11):1986-1991.

[18]李華波， 陳世健， 胡建華， 等. 通心絡(luò)對心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43重構(gòu)及室性心律失常的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(2):274-278.

[19]馬度芳， 姜 萍， 楊金龍， 等. 調(diào)節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng):心血管疾病抗炎治療的新領(lǐng)域[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(2):374-378, 384.

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of G-CSF on calcium, sodium and potassium ion channel currents of ischemic atrial myocytes in guinea pig

LUO Tao1, GUO Mei2, SHI Cheng-long1, ZHOU Min1, JIA Zhong-wei1, PU Kui1

(1DepartmentofCardiology，2DepartmentofClinicalLaboratory,ChinesePLANo. 254Hospital,Tianjin300142,China.E-mail:tluo.cardiolab@live.com)

AIM: To observe the effects of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) on calcium, sodium and potassium ion channel currents of the ischemic atrial myocytes in guinea pig by whole-cell patch clamp technique. METHODS: The guinea pig atrial myocytes were obtained by enzymolysis. Under ischemia and hypoxia condition, whole-cell patch clamp was used to observe the effects of G-CSF at various concentrations on the changes of theI-Vcurve, activation curve and availability of L-type calcium channel current (ICa，L) and voltage-dependent sodium channel current (INa), as well asI-Vcurve of delayed rectifier potassium channel current (IK). RESULTS: Under ischemic condition, theI-Vcurves ofICa,Lwere changed by acute G-CSF intervention in a dose-dependent fashion. Except for G-CSF at dose of 300 μg/kg, the other concentrations of G-CSF did not change the activation curve and availability ofICa，L, indicating that the effects of G-CSF onICa，Lwere in a voltage-independent fashion. TheI-Vcurves ofICa，Lunder ischemic condition were gradually approaching the normal levels by the higher dose of G-CSF, while the effect of 300 μg/kg G-CSF onICa，Lwas similar to 100 μg/kg G-CSF. Acute G-CSF intervention at different doses did not changeI-Vcurve, activation curve, and availability or steady-state availability ofINa. As a part ofIK, the rapid activating component (IKr) was improved by 100 μg/kg and 300 μg/kg G-CSF intervention with the similar effects, while the slowly activating component (IKs) was not changed by G-CSF. CONCLUSION: G-CSF affects ion channel electrophysiological properties of ischemic atrial myocytes in a voltage-independent but concentration-dependent manner, thus reducing the incidence of atrial arrhythmia.

Granulocyte colony-stimulating factor; Sodium ion channels; L-type calcium ion channels; Delayed rectifier potassium ion channels; Atrial myocytes

1000- 4718(2017)05- 0857- 08

2016- 09- 21

2017- 02- 22

R541.7； R329.2+4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.015

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 022-84683046； E-mail: tluo.cardiolab@live.com