土家藥白頭婆成分及含量研究△

龔星軍 溫 曉 魏媛媛 田 蘭 張元忠* 谷利民 胡 杰

(1.湖南張家界市人民醫(yī)院，湖南 張家界 427000；2．吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000；3.湖南湘西州民族醫(yī)藥研究所，湖南 吉首 426000)

方藥縱橫

土家藥白頭婆成分及含量研究△

龔星軍1溫 曉2魏媛媛2田 蘭3張元忠1*谷利民1胡 杰1

(1.湖南張家界市人民醫(yī)院，湖南 張家界 427000；2．吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000；3.湖南湘西州民族醫(yī)藥研究所，湖南 吉首 426000)

本文對湖南產(chǎn)的土家藥白頭婆進行初步研究，結(jié)果顯示，白頭婆含有豐富的黃酮類、蛋白質(zhì)與Ca類化合物，Pb、Cd、Hg等元素未檢出。

土家族藥；白頭婆；成分分析；檢測

白頭婆Eupatorium japonicum Thunb.被子植物門 Magnoliophyta雙子葉植物綱 Magnoliopsida 菊目 Asterales 菊科 Asteraceae 澤蘭屬Eupatorium，為多年生草本植物，卵圓形或披針形葉子對生，邊緣有粗齒，下面有柔毛和腺點；秋季開白色管狀花，頭狀花序多數(shù)，在枝端排列成傘房狀；瘦果有柔毛和腺點。主要分布于我省及武陵山脈周邊等高山盆地，尤常見于密疏林下、灌叢中、山坡草地、水濕地和河岸水旁，目前尚未由人工引種栽培。白頭婆原載昆明植物研究所中國高等植物數(shù)據(jù)庫全庫、中國科學(xué)院微生物研究所。全國第四次中藥資源普查武陵山區(qū)均有分布，民間藥用常呼別名為山蘭、孩兒菊、神仙草、不老草等。

本品全草入藥，味苦、辛，性平，祛暑發(fā)表、化濕和中、理氣活血、化瘀、行水消腫，主治夏傷暑濕、發(fā)熱頭痛、胸悶腹脹、消化不良、月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷、癰腫、蟲蛇咬傷。土家民間用于傷科，是著名的強盜藥；其花泡制的藥酒還有抗衰老、延年益壽等功能。目前對白頭婆的研究從藥物成分和臨床資料均缺乏，有較大研究價值。本文對其基本成分、營養(yǎng)物質(zhì)、礦物質(zhì)元素等進行了檢測，以期為其開發(fā)打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料：白頭婆采自湖南省龍山縣，經(jīng)鑒定為菊科澤蘭屬植物白頭婆(Eupatorium japonicum Thunb.)帶花的全草，干燥后粉碎，過100目篩，裝瓶備用。

1.2 化學(xué)試劑：蘆丁對照品購于中國生物制品檢定所，甲醇美國Tedia公司，牛血清蛋白國藥集團化學(xué)試劑有限公司，葡萄糖隴西化工股份有限公司，L-谷氨酸購自中國生物制品檢定所，水合茚三酮天津市光復(fù)精細化工研究所，沒食子酸國藥集團化學(xué)試劑有限公司，考馬斯亮藍G-250上海沃凱公司，蒽酮國藥集團化學(xué)試劑有限公司，硫酸、氯化亞錫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、福林酚、三氯化鋁、氯化鉀、氯化鈉、碳酸鈣、純鎂、鐵粉、鉛粉、鎘粉、金屬銅均為光譜純；鉛標準儲備液購自國家標準物質(zhì)研究中心，鹽酸、氫氧化鈉為優(yōu)級純，維生素C、硅藻土、甲醇、無水乙醇、重鉻酸鉀、2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)、三羥基甲基氨基甲烷(TRIS)、石油醚(沸程30℃～60℃)、丙酮、鹽酸、硼酸、草酸、硝酸、檸檬酸、硫脲、氧化鑭、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、活性炭、2，4-二硝基苯肼、酚酞、甲基紅、溴甲酚綠、亞甲基藍均為分析純。

1.3 儀器設(shè)備：FA224B萬分之一天平(上海佑科儀器公司)，HH型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠)，SB-25-12DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，LD5-2A離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，U-3900H型紫外可見分光光度計(日本Hitachi公司)，Agilent1260 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)，AA-680火焰原子吸收(日本SHIMADZU公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 水分：參考GB 5009.3—2010采用直接干燥法。

1.4.2 灰分：參考GB 5009.4—2010。

1.4.3 總黃酮的測定[1]：稱取0.010g蘆丁，用30%乙醇溶解并定容至100mL的容量瓶中，制成0.1mg/mL的蘆丁標準溶液。分別吸取剛配制好的蘆丁標液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL置于6個50mL的容量瓶中，依次編號0～5，用65%乙醇補至10mL后，加入5%的NaNO21mL搖勻，靜置6min，再加入10%的硝酸鋁1mL搖勻，靜置6min，加入10mL的4%的氫氧化鈉，并用65%乙醇定容至50mL，搖勻15min后顯色置于510nm處分光光度計測吸光度。 [標準曲線測得：A=0.0217C 0.0053 r=0.9996]。

樣品測定：準確稱取白頭婆樣品1.0000g粉末1.0g，置于索氏提取器中，用65%的乙醇提取3次，每次提取2h, 每次加入60mL，后經(jīng)蒸餾回收乙醇，濃縮后，用65%的乙醇定容至 50mL容量瓶中，取1mL置于50mL的容量瓶中用65%乙醇補至10mL后，加入5%的NaNO21mL搖勻，靜置6min，再加入10%的硝酸鋁1mL，搖勻，靜置6min，加入4%的氫氧化鈉10mL，并用65%乙醇定容至50mL，搖勻15min后顯色置于510nm處分光光度計測吸光度。測黃酮的吸光度，標準曲線上，讀出黃酮含量。

1.4.4 總生物堿的測定[2]：稱取 5.0 mg干燥的鹽酸小檗堿標準品，用蒸餾水溶解置 50 mL容量瓶中，稀釋至容量瓶的刻度線，搖勻備用。用移液管從中精密吸取5.0 mL該溶液于 25 mL的容量瓶中，加入 0.1 mol/L的鹽酸溶液并稀釋至容量瓶的刻度線，制備0.02 mg/m l的液體作為鹽酸小檗堿對照品母液。分別吸取 0.02 mg/mL 的鹽酸小檗堿對照母液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于 10 mL容量瓶中，加入 0.1 mol/L 的鹽酸溶液定容，搖勻備用，作為實驗組，在波長為 345 nm下測定其吸光值A(chǔ))。選擇等體積的 0.1 mol/L 的鹽酸溶液，作為空白對照組，在相同的條件下測定其吸光值(A)，以橫坐標為濃度 C，縱坐標為吸光值(A)，得出標準曲線：A=0.35+1.1832C(r=0.9995)。

樣品測定：稱取白頭婆樣品粉末 200 g，采用超聲輔助法提取，功率 60 W，提取時間 30 min/次，提取 2 次，料液比(g∶mL)1∶9，提取溫度 70℃，提取劑 70%乙醇 ，合并濾液，經(jīng)石油醚去除色素，用氯仿萃取 2 次，取下層液體水浴蒸發(fā)濃縮至褐色浸膏。稱取浸膏 5.0 g 置于燒杯中，用蒸餾水溶解，置于250 mL的容量瓶中，加蒸餾水定容，制成 0.02 g/mL的液體混合均勻備用；精密吸取5.0 mL提取物溶液至 10 mL容量瓶中，加入 0.1 mol/L鹽酸溶液定容，混合均勻備用；采用二倍稀釋法得到5 mg/mL溶液，再次用紫外 - 可見分光光度法于345 nm 波長下測定其吸光值(A)，通過標準曲線方程計算總生物堿含量。

1.4.5 蛋白質(zhì)：參考GB/T 5009.5-2008采用凱氏定氮法進行測定。

1.4.6 脂肪：參考GB 5413.3-2010 與GB/T 5009.6-2003采用石油醚索式提取法進行測定。

1.4.7 礦質(zhì)元素含量的測定[3-4]：火焰原子吸收法(GB5413.21-2010)與(GB 5413.22-2010、GB/T5009.12-2003、GB/T5009.15-2003。)

1.4.8 可溶性總糖：葡萄糖標準曲線的制作：稱取105℃真空干燥至恒重的葡萄糖100mg，配成0.5mg/mL葡萄糖溶液。分別取該溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL于5個50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容。各取以上5組溶液2mL于錐形瓶，在每支試管中立即加入蒽酮試劑8.0m1，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準確煮沸l(wèi)0 min取出，用冰浴冷卻至室溫，在620 nm波長下以第一管為空白，迅速測其余各管吸光值。以多糖濃度為橫坐標X(mg / mL)，以吸光度為縱坐標Y。[標準曲線測得：Y =0.1012X + 0.0083，r= 0.9991]

白頭婆中總糖的提取與測定：精確稱取0.500 g，置于50 mL三角瓶中，加水15 m1，鹽酸10 mL，沸水浴20 min，定容至100mL，得提取液。取5 mL濾液定容至50 mL。吸取2 mL已稀釋的提取液于試管中，加入4.0 mL蒽酮試劑，平行三份；空白管以等量蒸餾水取代提取液。以下操作同標準曲線制作。根據(jù)A620平均值在標準曲線上查出葡萄糖的含量(μg)。

1.4.9 總氨基酸： 總氨基酸標準曲線繪制：取7個25mL容量瓶，吸取標液0、0.5、1.0 、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于7個25 mL容量瓶，加水補充至容積為4 mL，然后加茚三酮和緩沖液各1 mL，于水浴加熱15 min，冷卻后定容25 mL，靜置15 min，在570 nm下測消光值，繪制標準曲線。[標準曲線測得：Y =33.21X + 0.045，r= 0.9995]

樣品測定：準確稱取白頭婆樣品1.0000g，置于50mL錐形瓶中，加沸蒸餾水30mL，立即置于沸水浴中，浸提45 min，期間每隔10 min搖動一次，45 min以后趁熱真空過濾，殘渣用少量沸水洗滌2～3次，濾液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，待冷卻后加水至刻度備用。吸取濾液1 mL，置于25 mL容量瓶中，再加0.5mL緩沖液(pH=8)，加茚三酮顯色劑0.5 mL，在沸水浴中加熱15 min，待冷卻后加水定容至25 mL，放置10 min后，用波長570 nm測定吸光度。

2 結(jié)果

白頭婆分析結(jié)果見表1。

表1 白頭婆分析結(jié)果

3 討論

3.1 從結(jié)果可以看出，白頭婆中含有較為豐富的總黃酮和生物堿等具較強生物活性的有效成分，其中總生物堿為1.20%，總黃酮達到了3.85%，為白頭婆臨床療效提供了理論基礎(chǔ)，其具體成分和作用有待進一步研究。

3.2 白頭婆的其他成分中蛋白質(zhì)的含量達到了11.31%，脂肪含量不高僅為2.6%，蛋白質(zhì)含量是脂肪的4.35倍。碳水化合物含量高達53.12%。礦物質(zhì)元素中Ca的含量達27.5%，分別是Cu的2291倍、Fe的85.9倍、Na的21倍；K、Mg含量也超過5%。提示白頭婆除了藥理作用外，還有綜合利用的前景。

3.3 白頭婆中Pb、Cd、Hg等重金屬元素未檢出。提示本品應(yīng)用安全。

[1]李桂蘭，劉計權(quán),等.山西產(chǎn)金蓮花總黃酮及3種黃酮苷含量的測定[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016.31(1): 275-278.

[2] 劉燕,劉艷,馬宇穎,等.雞骨草葉總生物堿的含量測定及其體外抗氧化活性研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016.13(28):25-27、55.

[3]劉嶺,賀浪沖,梁曉聰,等.5種藥食同源中藥中重金屬元素鉛與鎘的測定[J].陜西中藥，2010.31(7):897-899.

[4]GB 5009.3-2010、GB 5009.4-2010、GB 5009.4-2010、GB 5413.3-2010、GB/T 5009.6-2003、GB5413.21-2010、GB 5413.22-2010、GB/T5009.12-2003、GB/T5009.15-2003。

2017年1月6日收稿

湖南張家界市科技項目2015YB007

龔星軍，男，副主任藥師。聯(lián)系方式：13974450858

R297.3

A

1006-6810(2017)03-0031-03

*通訊作者