余甘子清除口臭作用的電子鼻評價方法研究

劉伯科， 秦 溪， 張曉棟， 林仲儀， 劉小玲

（廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

余甘子清除口臭作用的電子鼻評價方法研究

劉伯科， 秦 溪， 張曉棟， 林仲儀， 劉小玲*

（廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

建立基于電子鼻技術(shù)口腔惡臭味的檢測評價方法。采用電子鼻對口腔唾液不同孵育時間的惡臭味進(jìn)行了測定，對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS、PCA、LDA、Loadings分析及雷達(dá)圖特征性分析，獲得電子鼻應(yīng)用于口腔惡臭味評價的最佳檢測時間、特征參數(shù)和表征傳感器。進(jìn)一步比較了電子鼻評價法、感官評價法和蛋白質(zhì)沉淀-分光光度法三者的相關(guān)性，并采用3種方法分析了余甘子提取物對口腔唾液惡臭味氣體的影響。各傳感器在最大值點附近5 s區(qū)分度較好，因此作為特征提取參數(shù)。唾液孵育12 h時，傳感器R6（W1S）、R7（W1W）和R9（W2W）與其他傳感器有顯著性差異（P＜0.05），其響應(yīng)值與感官評價值的相關(guān)系數(shù)均大于0.98。在口臭的檢測和評估中，電子鼻評價法、蛋白質(zhì)沉淀法和感官評價法結(jié)果具有一致性。口腔惡臭味的表征傳感器為R6（檢測甲基類化合物）、R7（檢測無機硫化物）和R9（檢測有機硫化物），電子鼻評價法可用于抑制口臭活性物質(zhì)追蹤，余甘子提取物具有抑制口臭作用。

電子鼻；口臭；余甘子

口臭是指呼吸時從口腔或者其它空腔所散發(fā)的讓人產(chǎn)生不愉快氣體的癥狀，是口腔疾病甚至全身疾病的征兆。口臭是口腔中微生物對滯留含硫氨基酸的代謝產(chǎn)物分解腐化而產(chǎn)生的揮發(fā)性硫化合物（VSCs）引起的[1]。在中國，口臭的患病率為27.5%[2]。臨床實驗證明口臭的VSCs與口腔中微生物及唾液總蛋白存在密切關(guān)系[3-7]。

在對口臭患者進(jìn)行干預(yù)治療時，需要對口腔惡臭味進(jìn)行定性定量評估，以更客觀評價和反映各種治療效果。目前電子鼻迅速發(fā)展并廣泛應(yīng)用于食品中氣味成分的檢測，馬淑鳳[8]、姚璐[9]等運用電子鼻技術(shù)對不同品質(zhì)的氣味進(jìn)行分析、識別，因此電子鼻能依據(jù)食品的不同氣味進(jìn)行等級區(qū)分。有研究表明電子鼻分析與感官評估有良好的線性相關(guān)性，且不受人的主觀因素影響[10-11]。因此，作者采用電子鼻檢測技術(shù)及其他傳統(tǒng)方法，探索了口腔惡臭的評價。利用該評價方法分析了余甘子提取物的抑制口臭作用，為后續(xù)口臭的研究提供一種可靠的分析手段。

1 材料與方法

余甘子（Phyllanthus emblica L.）品種為玻璃甘，產(chǎn)自廣東潮州，購于廣西南寧市海吉星水果批發(fā)市場；唾液：采自健康人群的口腔；牛血清蛋白：上海羅氏制藥有限公司產(chǎn)品；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；PEN3便攜式電子鼻：德國AIRSENSE公司產(chǎn)品。

2 試驗設(shè)計與方法

2.1 唾液的收集處理

從8位自愿者口腔收集他們的唾液樣本并集中處置。要求自愿者在取樣前48 h內(nèi)禁止食用強烈氣味的食物，24 h內(nèi)禁止使用香水、化妝品之類產(chǎn)品，12 h內(nèi)禁止吸煙并建議不要攝取食物和飲料，起床后不做口腔清潔，在早上起床8：30收集全唾。全唾液集中到無菌離心管中，振蕩均勻后分別精密量取1mL于10mL頂空瓶中，置于37℃密封恒溫孵化。多余部分全唾置于-40℃低溫保存，用于抑臭活性的檢測。全唾液樣本分別孵化1、3、6、9、12 h分別表示為M1、M3、M6、M9、M12。同時以純凈水為空白對照樣品M0。每組實驗重復(fù)3次。

2.2 感官法評價唾液惡臭

請5名嗅覺靈敏且具備一定感官評價經(jīng)驗的食品學(xué)科研究生擔(dān)任感官評價人員。取孵化不同時間的唾液樣本的頂空瓶，用玻璃棒插入孵化全唾中同方向攪動3圈，取出分別由5名感官評價人員用鼻子聞玻璃棒，并對其中的臭味程度用1~6分進(jìn)行量化評分，表示為感官評定值。其中分?jǐn)?shù)越高，表明臭味越顯著（1-無氣味；2-很難聞出氣味；3-稍有不愉快氣味；4-中度不愉快氣味，可以接受；5-重度不愉快氣味，還可接受；6-惡臭，無法忍受）。

2.3 電子鼻口臭檢測模型建立

取孵化不同時間的唾液樣本用PEN3型電子鼻進(jìn)行檢測。檢測時間60 s，參數(shù)獲取時間間隔為1 s，清洗時間100 s，傳感器流速100mL/min。每組均進(jìn)行3次平行試驗。

PEN3型電子鼻共有10個不同的傳感器，每個傳感器對不同的物質(zhì)具有最大的響應(yīng)值（見表1）。

2.4 蛋白質(zhì)沉淀-分光光度法表征抑臭活性

參照王琳[12]等人的方法，待測活性物質(zhì)濃度為3.25mg/mL，以純凈水為空白對照樣。Abs與蛋白質(zhì)沉淀量成正比，Abs越大，說明待測物沉淀底物活性越強，抑臭活性越強。

2.5 余甘子提取物的抑臭效果評價

余甘子去核干燥粉末，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇超聲，過濾，真空濃縮干燥得浸膏，用水分散，得懸浮液，依次用等體積氯仿、乙酸乙酯、正丁醇充分萃取，濃縮干燥，得到不同極性部位萃取樣。將所得的樣品配置成濃度為3.25mg/mL的樣品液，在10mL頂空瓶中分別加入1 mL全唾和0.2 mL樣品液，振蕩均勻后，置于37℃密封恒溫孵化，于12 h時電子鼻分析其臭味程度。并采用2.4方法分析余甘子提取物及萃取物的沉淀底物活性大小。

表1 PEN3的標(biāo)準(zhǔn)傳感器陣列Table 1 Response feature of the PEN3 sensor array

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，通過One-Way ANOVA分析處理，并采用Origin作圖。通過Duncan氏多重比較分析顯著性差異，P＜0.05表示差異顯著。實驗測定次數(shù)需重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列標(biāo)注不同小寫字母表示圖表中同列平均值之間有顯著差異，同行標(biāo)注不同大寫字母表示圖表中同行平均值之間有顯著差異。采用電子鼻自帶分析軟件WinMuster進(jìn)行PCA分析、LDA分析和Loadings分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 唾液樣本的感官評價

收集到的唾液樣本經(jīng)不同時間孵育后，分別由5名感官評價人員對樣品進(jìn)行鼻腔嗅覺感受，并將感受以分值記錄，對其感官評分結(jié)果進(jìn)行分析如表2所示。M0和M12感官評價值一致，其余各孵化時間段標(biāo)準(zhǔn)偏差較小。各孵化時間段均呈現(xiàn)顯著性差異，均與空白對照組差異顯著。由于全唾隨著孵化時間的延長，其中的致臭菌不斷分解蛋白底物，臭味氣體的濃度逐漸增大。

3.2 唾液樣本的電子鼻評價

3.2.1 電子鼻特征值提取時間的確定 全唾37℃恒溫孵育12 h后的樣本，用PEN3電子鼻檢測。圖1為電子鼻10個傳感器感應(yīng)信號隨時間變化的響應(yīng)曲線。圖中橫坐標(biāo)為數(shù)據(jù)采集時間，縱坐標(biāo)為G/G0，表示為傳感器接觸到檢測樣品揮發(fā)成分后的電導(dǎo)率G與傳感器經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)活性炭過濾氣體的電導(dǎo)率G0的比值，每條曲線代表一個傳感器。從圖中可以看出傳感器隨著時間變化響應(yīng)信號快速增強到最大值，在最大值時各傳感器響應(yīng)值達(dá)到最大分離度，各揮發(fā)性氣味物質(zhì)得到明顯區(qū)分，傳感器采樣至40 s后響應(yīng)信號值較小并趨于穩(wěn)定，且各感應(yīng)器響應(yīng)信號數(shù)值比較接近，不能得到氣味物質(zhì)的明顯區(qū)分。因此為保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性，選取電子鼻感應(yīng)器最大響應(yīng)值附近5 s作為特征值提取時間。

表2 唾液惡臭味感官評價（感官評定值）Teble 2 Sensory Evaluation of saliva malodor（sensory evaluation value）

圖1 全唾孵育12 h PEN3傳感器響應(yīng)曲線圖Fig.1 Response curve of the PEN3 sensor in saliva incubating for 12 h

3.2.2 唾液樣本的電子鼻雷達(dá)圖 全唾在37℃恒溫孵育不同時間的電子鼻雷達(dá)圖如圖2所示。圖中數(shù)軸1~10分別代表10種傳感器（見表1），不同的孵育時間的唾液樣本其雷達(dá)圖面積、形狀有一定的差異。從圖2可見，傳感器1~5、8、10的雷達(dá)面積較小，信號弱甚至無。傳感器R6（W1S）、R7（W1W）、R9（W2W）的檢測信號較為突出，且數(shù)值變化明顯，這個3個傳感器響應(yīng)信號隨唾液的孵化時間增強，但增強速率有所不同，在前9 h內(nèi)，R6傳感器響應(yīng)信號增強速率最快，R7、R9傳感器響應(yīng)信號的增強速率比較緩慢，這說明在前9 h孵育期間內(nèi)，隨唾液孵化時間延長，口腔微生物通過腐敗蛋白底物主要生成了甲基類的臭味成分物質(zhì)。在9~12 h孵育區(qū)間內(nèi)，R6傳感器響應(yīng)信號增強速率最慢。而R7傳感器響應(yīng)信號值迅速增強，這說明了在此孵育區(qū)間，口腔微生物通過化學(xué)腐敗使口腔中充滿了無機硫化物的臭味成分物質(zhì)，可能是H2S等物質(zhì)。由此可見，唾液中的氣味以無機硫化物、甲基類化合物、芳香成分及有機硫化物為主，分析雷達(dá)特征圖可明顯判別出R6、R7、R9傳感器在唾液氣味判斷上起決定性作用，可用于監(jiān)測唾液臭味氣味的識別和判定。

圖2 全唾不同孵育時間的雷達(dá)掃描圖Fig.2 Radar scan map of saliva w ith different incubation time

3.2.3 唾液樣本的電子鼻傳感器信號響應(yīng) 對不同孵化時間唾液進(jìn)行電子鼻檢測，提取不同傳感器的響應(yīng)比G/G0，結(jié)果如表2所示。采用3.2.1方法提取電子鼻所測得的數(shù)據(jù)，對進(jìn)行顯著性分析，前9 h內(nèi)，電子鼻R1、R3、R5傳感器對全唾的不同孵育時間氣味的響應(yīng)值沒有顯著性差異，但是其各傳感器響應(yīng)值呈上升趨勢，當(dāng)孵育達(dá)到12 h時，3個傳感器均顯示有顯著性差異，顯著值為1.0。對每個孵育時間段中電子鼻各傳感器進(jìn)行顯著性分析，在1~3 h、6~9 h時，R2、R4、R6、R7、R8、R9、R10傳感器均無顯著性差異或差異性不明顯。當(dāng)孵育時間達(dá)到12 h時，各傳感器均有顯著性差異，因此在活性檢測中只有當(dāng)孵育時間達(dá)到12 h時，才能明顯表征出活性物質(zhì)對氣味產(chǎn)生的影響。因此選取12 h作為其唾液樣品用于電子鼻檢測的孵育時間。在1~12 h區(qū)間，傳感器R7、R6、R9響應(yīng)值始終居于前三，明顯高于其余傳感器，且與其他傳感器有顯著性差異（表3）。因此可以把傳感器R7、R6、R9響應(yīng)值作為活性檢測的一個判斷依據(jù)。

3.3 電子鼻唾液臭味評價模型分析

3.3.1 主成分分析 采用電子鼻系統(tǒng)自帶數(shù)據(jù)分析軟件WinMuster中PCA分析2.3實驗中所采集的電子鼻圖譜。PCA是一種將多個變量變換為較少的綜合變量的多元統(tǒng)計分析技術(shù)，轉(zhuǎn)變成的變量基本涵括了原始變量的全部信息，是一種分析、簡化數(shù)據(jù)集的技術(shù)，將復(fù)雜的測量數(shù)據(jù)可以轉(zhuǎn)換為二維和三維數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)重新分配形成散點圖，形成一個新的坐標(biāo)系統(tǒng)，PCA分析中的第一主成分為所有數(shù)據(jù)投影的第一大方差的坐標(biāo)，第二主成分為所有數(shù)據(jù)投影的第二大方差的坐標(biāo)，依次類推，體現(xiàn)陣列傳感器在單個數(shù)軸上的彼此相關(guān)性。第一主成分貢獻(xiàn)率為95.61%，第二主成分貢獻(xiàn)率為4.00%，因此兩個主成分累計貢獻(xiàn)率為99.61%＞95%。因此這2個主成分已表達(dá)了樣品的基本信息特征，可用來代表不同孵育時間（即不同臭味指數(shù)）全唾的整體信息。除1 h與3 h、6 h與9 h稍微有部分重疊，其區(qū)分效果不是特別理想，但唾液1~3 h、6~9 h及12 h的臭味成分能夠基本分開，因此PCA可以區(qū)分不同臭味指數(shù)的全唾。

表3 不同孵育時間PEN3傳感器響應(yīng)值比對表Table 3 Com parison of PEN3 sensor w ith different incubation time

3.3.2 線性判別分析（LDA） 與PCA相比其差異之處在于LDA通過計算先前賦予分類信息，同類別內(nèi)的分布以及相互距離能夠得到識別注意，因此提高了分類精度。第1判別函數(shù)（LDA1）的貢獻(xiàn)率為73.27%，第2判別函數(shù)（LDA2）的貢獻(xiàn)率為18.51%，累計貢獻(xiàn)率為91.78%。前3 h的全唾氣味變化主要體現(xiàn)在LDA2上，貢獻(xiàn)率較小，變化速率也較小，且1 h和3 h未能分開，可能由于孵育剛開始，頂空瓶中含有部分氧氣，厭氧型腐敗菌不能很好地分解腐化物質(zhì)生成揮發(fā)性硫化物所致。隨著孵育時間增加，LDA1所占比重增加，可能與揮發(fā)性硫化物及甲基類化合物含量相關(guān)。當(dāng)孵育時間達(dá)到12 h時，氣味的變化速率最快，且在LDA1和LDA2上變化明顯，跟之前的氣味區(qū)分度大，有顯著差異。通過LDA分析可以完全區(qū)分出12 h與前面孵育時間段的臭味組成。

3.3.3 傳感器貢獻(xiàn)率分析 （Loadings分析）Loadings分析與主成分分析都是基于相同的算法，該分析用來計算傳感器本身，識別出電子鼻檢測過程中傳感器的貢獻(xiàn)率，某傳感器負(fù)載參數(shù)越遠(yuǎn)離原點（0，0），越接近1，表示其傳感器的貢獻(xiàn)率越大。如處于原點附近，則表示該傳感器的作用可以忽略。傳感器R6（W 1S）、R7（W1W）、R9（W 2W）對第一主成分的貢獻(xiàn)率較大，R6對第二主成分有負(fù)載現(xiàn)象，因而傳感器R7、R9對第二主成分的貢獻(xiàn)率較大，R3（W3C）、R5（W5C）、R1（W1C）、R10（W3S）與原點接近，表明在此次分析中對結(jié)果貢獻(xiàn)率最低。前兩主成分分析累計貢獻(xiàn)率為99.61%＞＞75%，因此傳感器R6、R7、R9的響應(yīng)值可以作為其活性檢測的指標(biāo)。通過Loadings分析得到全唾中臭味物質(zhì)主要為無機硫化物 （W1W）、甲基類化合物 （W1S）、有機硫化物（W2W）。這也證實了口臭的主要物質(zhì)為揮發(fā)性硫化物、甲硫醇類化合物。

3.4 電子鼻評價方法與感官評價法的相關(guān)性分析

對3.2.3分析中有顯著差異的傳感器R6、R7、R9與3.1中感官評定值進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，都具有良好的擬合度。因此采用電子鼻中傳感器的R6、R7、R9可準(zhǔn)確取代感官評價，該方法便捷方便，不受人的主觀因素影響。

3.5 余甘子提取物抑臭活性分析

表4中，與空白對照比對，乙醇提取物和各萃取部位都有顯著性差異，說明余甘子有明顯的抑臭作用。電子鼻傳感器R6（W1S）、R9（W2W）信號顯示，乙酸乙酯萃取部位與其他部位有顯著性差異，說明余甘子乙酸乙酯萃取部位有明顯抑制硫化物產(chǎn)生的作用，傳感器R7（W 1W）信號顯示，氯仿與乙酸乙酯萃取部位無顯著性差異，但兩者相對其他部位有顯著差異，說明余甘子中中小極性物質(zhì)有明顯的抑制甲基類化合物產(chǎn)生的活性。將測試樣品的電子鼻圖譜應(yīng)用WinMuster軟件導(dǎo)入臭味評價模型中，分析得到模型臭味指數(shù)，從表4中可以看出乙酸乙酯萃取部位的模型臭味指數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他各樣品的指數(shù)值。通過分析沉淀蛋白能力判別，乙酸乙酯及正丁醇萃取層有很好的沉淀底物活性，乙酸乙酯萃取層活性最強，且與正丁醇有顯著性差異。由感官評價值可以明顯看出，相對空白而已，各樣品液臭味指數(shù)都有減小，且呈現(xiàn)顯著性差異，其中乙酸乙酯萃取層的感官評定值最小，因而活性最強。綜合可得，從感官評價、電子鼻分析、沉淀底物活性分析來說，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取液有明顯的抑制口臭能力，余甘子萃取分離后所得乙酸乙酯萃取物活性顯著高于95%乙醇提取液，是由于萃取分離對余甘子的抑臭活性物質(zhì)進(jìn)行了富集純化。3種方法在抑臭活性分析判定上具有一致性，因而可以作為后續(xù)余甘子分離純化活性追蹤方法。

表4 余甘子提取物抑臭活性比對表Table 4 Com parison of activity to suppress oralmalodor of Phyllanthus emblica L.extracts

4 結(jié)語

建立應(yīng)用電子鼻測定口腔惡臭味測定的采集方法，電子鼻在測定口腔惡臭中在傳感器最大值附近5s，各傳感器體現(xiàn)最大分離度，因而選定其特征值提取時間。傳感器R6（W1S）、R7（W1W）、R9（W2W）在臭味表征上與其他傳感器有顯著性差異，在臭味表達(dá)上起主要作用。在抑臭物質(zhì)活性檢測中只有當(dāng)孵育時間達(dá)到12 h時，才能明顯表征出活性物質(zhì)對氣味產(chǎn)生的影響。

電子鼻檢測中，傳感器R6（W1S）、R7（W1W）、R9（W2W）與感官評價值有較顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)大于0.98。應(yīng)用3種方法評估余甘子提取物的抑臭活性，結(jié)果表明電子鼻、感官及蛋白沉淀-分光光度法均表現(xiàn)出一致性，運用這個測定評價體系分析，發(fā)現(xiàn)余甘子提取物均有抑臭活性，其中乙酸乙酯萃取層活性最大。作者的研究為抑臭活性的評價建立一個系統(tǒng)的測定分析方法，可用于后續(xù)抑臭物質(zhì)活性追蹤。

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Evaluation Assessment of Oral Odor Inhibition of Phyllanthus emblica L.Using Electronic Nose

LIU Boke， QIN Xi， ZHANG Xiaodong， LIN Zhongyi， LIU Xiaoling*
（College of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China）

An electronic nose（eNose）analysis was established to determ ine oral odor in this research.Saliva stench of different incubation timeswas detected by eNose.The optimal detection time，characteristic parameters and main sensors were obtained via the experimental data from SPSS，PCA，LDA，Loadings analysis and radarmap characteristic analysis.The correlation among eNose measurement，sensory evaluation and protein precipitation-spectrophotometry method were compared and analyzed.The impact of Phyllanthus emblica L.extracts on saliva odor was determ ined by the above threemethods.Each sensorwas sufficiently distinguished in vicinity 5 s of maximum，which was thus used as the characteristic extraction parameters.There was significant difference（P＜0.05）between R6（W 1S），R7（W 1W），R9（W 2W）and the other sensorsw ith 12 h incubation.The correlation coefficients between their response valuesand sensory evaluation valueswere larger than 0.98.Consistent results of the oral malodour exam ination and evaluation were achieved for all three methods.The characteristic sensors of oral odor were R6 detecting methyl compounds，R7 detecting inorganic sulfideand R9 detecting organic sulfide.TheeNose can beused to evaluate the inhibitionoforalodor.And Phyllanthusemblica L.extractsshowed inhibitiononoralodor.

electronic nose，oralodor，Phyllanthus emblica L.

R 331

A

1673—1689（2017）04—0432—06

2015-05-02

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金項目（2014GXNSFAA118048）。

*通作作者：劉小玲（1972—），女，壯族，廣西凌云人，工學(xué)博士，教授，主要從事功能性食品研究。E-mail：xiaolingliu@hotmail.com

劉伯科，秦溪，張曉棟，等.余甘子清除口臭作用的電子鼻評價方法研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（04）：432-437.