雙酶法催化玉米淀粉制備γ-CD

李林林， 張夢柯， 金征宇， 王麗華， 王金鵬*

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

雙酶法催化玉米淀粉制備γ-CD

李林林1，2， 張夢柯1，2， 金征宇1，2， 王麗華1，2， 王金鵬*1，2

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

以玉米淀粉為底物，研究了來自于棲熱水生菌的4α-糖基轉移酶（4αGTase）和來自于嗜堿芽孢桿菌的環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶（CGTase）作用于淀粉制備γ-CD的影響因素。結果表明：兩種酶的添加方式為先加入4αGTase、再加入CGTase；γ-CD的最佳制備條件為底物質量分數5%，4αGTase加酶量4 U/g淀粉，CGTase加酶量8U/g淀粉，反應時間30 h。在此條件下γ-CD的得率最高為12.83%，比對照組提高了76.7%。

4α-糖基轉移酶；環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶；γ-環(huán)糊精；玉米淀粉

環(huán)糊精（cyclodextrin，簡稱CD）是由環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶 （cyclodextringlycosyltransferase，簡稱CGTase）酶解淀粉或者淀粉類似物產生的由D-吡喃型葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵連接而成的一類環(huán)狀低聚化合物[1-2]。常見的為含有6、7和8個葡萄糖單元的分子，根據環(huán)中葡萄糖單元的數量，分別稱為α-CD、β-CD和γ-CD。與α-CD、β-CD相比，γ-CD具有較大的空腔和較高的溶解度，能夠包接較大的分子[2]。然而，盡管市場對γ-CD的需求很大，但是由于其轉化率低、產物特異性差以及分離純化困難造成的高成本大大限制了其工業(yè)化大規(guī)模生產，使其只占有較小部分的市場份額[3]。

由于野生型的CGTase作用淀粉產生的都是不同比例的3種環(huán)糊精的混合物，因而其產物特異性差，并且后期的分離純化困難[4]。針對其產物特異性差的問題，目前很多人采用基因工程的手段，對現有的CGTase基因進行突變，從而提高其產物專一性。Kian Mau Goh等[5]對來自于Bacillus sp.G1菌株的CGTase進行突變，其突變體H43TCGTase產γ-CD的產率從 10%提高到了 39%。王峰等[6]從Bacillusmacorous中篩選出產γ-CGTase的菌株。此外，通過控制反應條件和加入有機溶劑，也可實現提高產物比例和產率[7-8]。Bender等[9]向反應體系中加入溴化苯和醋酸鈉使γ-CD的產率達到了18.7%。Rendleman等[10]以質量分數10%的淀粉為底物，加入C12化合物反應24 h后，γ-CD的產率有較大的提高。但是，這些有機化合物對于工業(yè)生產而言成本較高并且在后期分離過程中很難除去。

淀粉作為底物生產環(huán)糊精過程中存在的基本問題是高濃度淀粉粘度大，阻礙了酶和底物之間的接觸，使得環(huán)糊精產率低。因此可以通過物理、化學和酶法先對淀粉進行預處理[11]。比如用α-淀粉酶或者熱穩(wěn)定性的CGTase先液化淀粉，降低體系的粘度[12-13]。但是Ivan Pishtiyski等[14]發(fā)現添加α-淀粉酶后并沒有使環(huán)糊精的產率增加。并且α-淀粉酶液化后必須要調節(jié)體系的pH，才能加入CGTase進一步反應，操作過程較復雜。另一種提高γ-CD產率的方法是用脫支酶比如異淀粉酶或者普魯蘭酶對淀粉先進行預處理。因為在反應過程中，脫支酶可以首先水解掉支鏈淀粉中的α-1，6糖苷鍵，之后再加入CGTase利用這部分淀粉發(fā)生環(huán)化作用[14-15]。Rendleman等[10]以質量分數10%的支鏈淀粉為底物，先后加入普魯蘭酶和α-CGTase在15℃反應，總環(huán)糊精的產率為84%。然而，先用脫支酶預處理淀粉后容易形成大量的直鏈淀粉晶體，使反應周期延長[16]。

4α-糖基轉移酶（4αGTase）是淀粉代謝酶類，它可以產生含有16個葡聚糖單元及以上的大環(huán)糊精[17]。大環(huán)糊精可以轉化為 β-CD和 γ-CD。并且4αGTase更能耐受高溫，可以用4αGTase先預處理淀粉，降低淀粉的粘度，再加入CGTase進一步反應。而4αGTase是否有助于提高γ-CD的產率目前尚不清楚。作者將來自于棲熱水生菌的4αGTase和來自于嗜堿性芽孢桿菌的G825-6的CGTase進行結合，探索雙酶作用催化玉米淀粉對γ-CD產率的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

馬鈴薯直鏈淀粉：Sigma公司產品；普通玉米淀粉：杭州普羅星淀粉有限公司產品；α-CD、β-CD及γ-CD標準樣品：Sigma公司產品；可溶性淀粉：國藥集團化學試劑有限公司產品；棲熱水生菌4α-糖基轉移酶及嗜堿性芽孢桿菌CGTase G825-6：作者所在實驗室制備；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

雙光束紫外可見分光光度計（TU-1900）：北京普析通用儀器有限責任公司產品；電熱恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學儀器廠產品；低速臺式大容量離心機（RJTDL-50A）：無錫瑞江分析儀器有限公司產品；高速冷凍離心機（BIOFUGE PRIMOR）：美國Thermo Scientific有限公司產品；高效液相色譜儀（LC-20AT230V），示差折光檢測器（RID-10A），AKTA purifier900蛋白純化系統(tǒng)：島津公司產品；Hypersil NH2色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 mAPS-2Hypersil微粒）：美國Thermo公司產品；純泰Ni-NTA親和層析柱：GE Healthcare life sciences公司產品；ShodexOHpak SB-804 HQ色譜柱、OHpak SB-802.5 HQ色譜柱：日本昭和公司產品。

2 實驗方法

2.1 棲熱水生菌4α-糖基轉移酶的制備

由基因工程菌E.coli培養(yǎng)發(fā)酵，再經Ni-NTA親和層析柱分離純化得到4α-糖基轉移酶[18]。

4α-糖基轉移酶酶活測定：淀粉-碘顯色法[18]。

2.2 環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶的制備

從低溫冰箱中取出一支甘油管保藏菌接種至含有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)10h。按體積分數5%的接種量接種至含有100mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，待A=1.0時加入IPTG使其終濃度為0.05 mmol/L，在18℃、200 r/min下誘導培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)結束后，菌液5 000 r/min離心30 min，棄掉上清液，收集菌體。菌體懸浮于pH 8.5的Tris-HCl中超聲破碎，離心后所得上清液即粗酶液。

粗酶液的純化采用淀粉吸附法[19]：首先向粗酶液中加入質量分數5%的玉米淀粉和1 mol/L的硫酸銨，在4℃緩慢攪拌1 h，使酶充分被淀粉吸附；反應混合物6 500 r/min離心10 min，沉淀用預冷的1mol/L的硫酸銨洗滌兩次，除去未被吸附的蛋白；為充分洗脫下吸附在淀粉上的CGTase，殘渣用含有1 mmol/Lγ-CD的50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl在37℃振蕩培養(yǎng)30min得到洗脫液1；離心后的沉淀再用同樣含有γ-CD的緩沖液洗脫，得到洗脫液2；兩次得到的洗脫液合并，用50 mmol/L、pH 8.5的Tris-HCl緩沖液在4℃透析24 h，每隔6 h換一次緩沖液。

2.3 CGTase環(huán)化活力的測定

將適量 CGTase的酶液加入預先裝有用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 （pH 8.5）配制的可溶性淀粉溶液（2 g/dL）的試管中，充分混勻，在50℃反應30min后，沸水浴10 min終止反應。用HPLC測定環(huán)糊精含量。

酶活力單位（U）定義為：在上述條件下每30 min生成1μmolγ-CD所需的酶量。

2.4 酶解淀粉產物測定

采用HPLC法對酶催化產物進行分析，色譜條件為：Hypersil NH2色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 mAPS-2Hypersil微粒），示差折光檢測器 （RID-10A）；流動相為70%乙腈水溶液，流量為1mL/min，柱溫40℃。

2.5 淀粉相對分子質量測定

分別稱取50 mg原淀粉和經4αGTase處理過的淀粉分散于5 mL體積分數90%的DMSO中，沸水浴煮沸1 h使其完全溶解并在室溫下磁力攪拌12 h。取1mL經DMSO處理過的淀粉溶液用6mL的無水乙醇沉淀，5 000 r/min離心10 min沉淀淀粉。離心結束后棄上清液，向沉淀物中加入10mL的沸水溶解并在沸水浴中攪拌30min。樣品經0.45 μm濾膜過濾，以未經4αGTase處理的玉米淀粉溶液為對照，進行高壓體積排阻色譜（HPSEC）色譜分析。ShodexOHpak SB-804 HQ色譜柱和OHpak SB-802.5 HQ色譜柱串聯后保持柱溫50℃，超純水作為流動相，流量為1.0 mL/min，進樣量為20μL，分析時間為30min。在上述色譜條件下分析的葡聚糖標準樣品 （相對分子質量為 9 600，21 100， 107 000，337 000，642 000）用于分子質量標準曲線的制作。

2.6 支鏈淀粉鏈長分布測定

分別稱取20 mg原淀粉和經4αGTase處理過的淀粉分散于2 mL體積分數90%的DMSO中，沸水浴煮沸1 h使其完全溶解，用4倍體積的無水乙醇沉淀，5 000 r/min離心10min沉淀淀粉。離心結束后棄上清液，向沉淀物中加入2 mL預熱的50 mmol/L的醋酸鹽緩沖溶液（pH 3.5）使其溶解，再加入50 U/g的異淀粉酶40℃下反應24 h，沸水浴10 min終止反應。10 000 r/min離心10min，取上清液稀釋10倍，經0.45μm濾膜過濾后，采用高效陰離子交換色譜（HPAEC）法測定鏈長分布。

色譜柱型號：CarboPacPA200，檢測器為安培脈沖檢測器；溫度：25℃；流量：0.5 mL/min，流動相A為0.15 mol/L NaOH溶液，流動相B為0.15 mol/L NaOH和0.5mol/L醋酸鈉混合液，采用梯度洗脫，程序為：體積分數60%流動相A+40%流動相B保持2 min，體積分數50%流動相A+50%流動相B保持8 min，體積分數40%流動相A+60%流動相B保持30 min，體積分數20%流動相A+80%流動相B保持20 min[20]。

2.7 酶的添加順序對γ-CD產率的影響

采用同時加酶及先后加酶兩種方式。配制質量分數5%的玉米淀粉溶液 （溶解于pH 8.5的Tris-HCl緩沖液中），電爐煮沸糊化10 min，冷卻至反應溫度。對于先后加酶的方式：向冷卻后的淀粉溶液中分別加入一定量的4αGTase，充分混勻后在70℃、800 r/min下振蕩反應24 h，反應結束后沸水浴30min滅酶，待溶液溫度冷卻至50℃左右時，向溶液中加入CGTase反應24 h。對于同時加酶的方式：向淀粉溶液中同時加入一定量的 4αGTase和CGTase，在不同溫度下反應一定的時間。上述反應結束后，取樣500μL，沸水浴10 min滅酶，10 000 r/min離心15 min除去變性的酶蛋白和未反應的淀粉，上清液經0.45μm濾膜過濾后取20μL進行HPLC分析。

2.8 單因素試驗

對先后加酶方式進行單因素實驗。首先對4αGTase的添加量進行了單因素實驗，然后分別探討了CGTase的添加量、反應時間及底物濃度對對γ-CD產率的影響，此時4αGTase加酶量為4 U/g淀粉，反應溫度為70℃，反應時間為24 h。

2.8.1 4αGTase添加量對對γ-CD產率的影響 向以5%的淀粉為底物中分別加入1、2、4、8、16 U/g淀粉的4αGTase，70℃反應24 h后，加入8 U/g淀粉的CGTase，50℃反應24 h后進行產物分析。

2.8.2 CGTase添加量對γ-CD產率的影響 向以5%的淀粉為底物且經4αGTase反應后的溶液中加入CGTase，加入量分別為0．05、1、2、8、10 U每克淀粉，50℃反應24 h后進行產物分析。

2.8.3 CGTase反應時間對γ-CD產率的影響 向以5%的淀粉為底物且經4αGTase反應后的溶液中加入 8 U/g淀粉的 CGTase，50℃反應 2、5、8、11、24、30 h后對產物進行分析。

2.8.4 底物質量分數對γ-CD產率的影響 向以質量分數1%、3%、5%、10%、15%的淀粉為底物且經4αGTase反應后的溶液中加入 8 U/g淀粉的CGTase，50℃反應24 h后對產物進行分析。

2.9 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交表對底物濃度，4αGTase添加量，CGTase添加量和CGTase反應時間進行優(yōu)化，以γ-CD得率為評定指標，試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計表Table 1 Design table of factor and level in orthogonal test

3.1 酶的添加順序對γ-CD產率的影響

由圖1可知：先加入4αGTase預處理淀粉后再加入CGTase這種先后加酶的方法所制備γ-CD的產率顯著優(yōu)于兩種酶同時加入的方式，并且兩種酶協(xié)同作用所產γ-CD的產率均顯著高于對照組；當加入 4 U/g的 4αGTase時，γ-CD的產率最高為10．43%，比對照組多41．71%。

圖1 酶的添加順序對γ-CD產率的影響Fig.1 Effect of the adding sequence of enzymes on theγcyclodextrinyiled

推測造成這一現象的原因可能是因為加入4αGTase在70℃對淀粉預處理后淀粉的相對分子質量和結構發(fā)生了變化，使得經4αGTase處理后的淀粉比原淀粉更適合作為CGTase進一步反應的底物[21]。為驗證這一推測，研究了普通玉米淀粉經4αGTase酶解后淀粉相對分子質量和分子結構的變化，結果如圖2、圖3所示。經測定未經處理的普通玉米淀粉的重均相對分子質量M w為3．36×107，而淀粉經4αGTase酶解10 h之后的重均相對分子質量M w為4．75×105，隨著酶解時間延長為24 h淀粉重均相對分子質量M w變?yōu)?．35×105，而將這3種相對分子質量的淀粉作為底物，再經CGTase催化所得γ-CD的產率分別為7．26%、9．38%、10．43%。并且由圖3可知，隨著4αGTase酶添加量的增加，支鏈淀粉的A鏈（DP＜12）、B2（DP 25-36）、B3鏈（DP＞36）的相對含量都增加，而將這3種結構的淀粉作為底物，再經CGTase催化所得γ-CD的產率分別為9．52%、10．43%、10．34%。該結果表明，玉米淀粉經4αGTase作用后的分子大小及分子結構更適于作為CGTase的催化底物。

3.2 4αCGTase添加量對γ-CD產率的影響

由表2可以看出，隨著 4αGTase添加量的增加，γ-CD的產率先上升后下降，4αGTase加入量為4 U/g時γ-CD的產率達到最高。原因可能是過多的4αGTase作用淀粉之后所產生的較小分子量的物質不適于作為CGTase的最佳底物。

圖2 普通玉米淀粉經4通GTase酶解前后相對分子質量分布圖Fig.2 M olecular weight distribution of nativeand 4nGTase-treated corn starch

圖3 普通玉米淀粉經4αGTase酶解前后支鏈淀粉鏈長分布圖Fig.3 Chain length distribution ofnativeand 4αGTasetreated corn starch

表2 4αGTase加酶量對γ-CD產率的影響Table 2 Effect of the amount of 4-α-glucosyltransferase on theγ-cyclodextrinyiled

3.3 CGTase添加量對γ-CD產率的影響

由表3可知，γ-CD的得率隨著CGTase添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，當CGTase添加量為8 U/g時，γ-CD的得率達到最大，為11.93%；并且隨著加酶量繼續(xù)增加，不僅γ-CD的得率下降，而且γ-CD所占的百分比也減少，β-環(huán)糊精所占百分比增加。引起這一現象的原因可能是產生的γ-CD進一步被CGTase催化轉化為β-CD或其他小分子低聚糖所致。

表3 CGTase加酶量對γ-CD產率的影響Table 3 Effect of the amount of cyclodextrin glucosyl trans ferase on theγ-cyclodextrinyiled

3.4 CGTase反應時間對γ-CD產率的影響

由圖4可知，γ-CD的得率隨著反應時間的增加呈先增加后下降的趨勢，當反應24 h時γ-CD的得率最高，為11.83%，因此確定CGTase的最佳反應時間為24 h。

圖4 反應時間對γ-CD產率的影響Fig.4 Effectof the reaction timeon theγ-cyclodextrinyiled

3.5 底物濃度對γ-CD產率的影響

由圖5可知，隨著反應底物質量分數的增加，γ-CD的得率呈現先增加后下降的趨勢。當反應底物質量分數增加到5%時，γ-CD的得率最高，為10.43%；隨著淀粉質量分數的進一步增加，γ-CD得率迅速下降。造成這一現象的原因可能有：隨著底物質量分數從5%增加到15%，玉米淀粉的粘度增大，導致流動性變差，底物和酶分子之間無法充分相互接觸，從而使得反應速率降低；其次是高濃度的底物，使得多個底物分子占據酶蛋白的部分活性位點，形成無效的中間產物，從而抑制了酶活性；此外，體系中較高質量分數的小分子物質將抑制CGTase的環(huán)化作用，增強其偶合和歧化作用，從而降低γ-CD的得率。

圖5 底物質量分數對γ-CD產率的影響Fig.5 Effect of the substrate concentration on γcyclodextrin yield

3.6 正交試驗結果

按照表1的設計進行正交試驗，結果如表4所示。根據極差R的大小，由直觀分析可知各因素對γ-CD產率影響的大小順序為C（CGTase添加量）＞A（底物濃度）＞D（CGTase反應時間）＞B（4αGTase添加量），最佳工藝為A2B2C2D3，即底物質量分數5%、4αGTase添加量 4 U/g、CGTase添加量 8 U/g、CGTase反應時間30 h。按照方案A2B2C2D3進行驗證試驗，γ-CD的產率為12．83%，比單酶法制備γ-CD產率提高了76．7%。

表4 正交試驗結果Table 4 ResuLts of the orthogonal test

4 結語

通過4αGTase和CGTase雙酶修飾淀粉，研究了其對γ-CD得率的影響。發(fā)現雙酶法能夠顯著提高γ-CD的得率，雙酶的添加順序為先加入4αGTase，再加入CGTase；反應條件為底物質量分數5%，4αGTase添加量4 U/g淀粉，CGTase添加量8 U/g淀粉，反應時間30 h，在此條件下γ-CD的得率為12．83%，比單酶法制備γ-CD的得率提高了76．7%。

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γ-CD Catalyzed from M aize Starch by Dual Enzymatic Reaction

LILinlin1，2， ZHANGMengke1，2， JIN Zhengyu1，2， WANG Lihua1，2， WANG Jinpeng*1，2
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Theconjunction of4α-glycosyltransferase（4αGTase）w ith cyclodextringlycosyltransferase（CGTase）were screened for their ability ofproducingγ-cyclodextrin（CD）usingmaize starch as substrate.The studies on the influence factors showed that4αGTase should be added first，followed byCGTase.The optimal conditions forγ-CD production was as follow ing：4U of 4αGTase and 8U ofCGTasepergram ofsubstratewereused to convertmaizestarch（5%，w/v）intoγ-CDw ith the reaction time of30 h.the subsequentyield ofγ-CD was12.83%，whichwas76.7%higher than the control.This studyhaspotentialvalue for theindustrialproductionofγ-CD.

4α-glycosyltransferase，cyclodextringlycosyltransferase，γ-cyclodextrin，maizestarch

TS 236.9

A

1673—1689（2017）04—0357—07

2015-05-15

國家自然科學基金項目 （31230057，31401524）；江蘇省自然科學基金項目 （BK20140143）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2013311）。

*通信作者：王金鵬（1984—），女，河南開封人，副教授，主要從事碳水化合物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：jpwang1984@jiangnan.edu.cn

李林林，張夢柯，金征宇，等.雙酶法催化玉米淀粉制備γ-CD[J].食品與生物技術學報，2017，36（04）：357-363.