紅葉腺柳繼代培養(yǎng)研究

胡 珊，李 青

（北京林業(yè)大學園林學院，花卉種質創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，國家花卉工程技術研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，教育部林木花卉育種實驗室，北京，100083）

紅葉腺柳（Salix chaenomeloides‘Variegata’）為楊柳科柳屬腺柳（Salix chaenomeloides Kimura）的優(yōu)良變種[1]，其頂端新葉于3月初至10月上旬呈紅色，紅葉觀賞期長，是為數(shù)不多的高大彩葉喬木樹種，且對土壤適應性強，耐澇旱、耐鹽堿、耐瘠薄，可用作觀賞樹、行道樹、遮陰樹和湖泊固堤、濕地修復等樹種[2]，近年來在市場上不斷推廣，種苗需求量大。紅葉腺柳扦插繁殖成活率雖高，但扦插時期很受局限（僅限于3-7月較合適），使其開發(fā)及利用受到極大限制。同時，扦插繁殖需要大量插條，利用組培快繁技術為其提供插條，可實現(xiàn)紅葉腺柳的周年生產化生產。因此提高紅葉腺柳在組織培養(yǎng)過程中的增殖系數(shù)及試管苗質量非常關鍵，本試驗研究了繼代培養(yǎng)過程中影響紅葉腺柳叢生芽增殖及試管苗高生長的關鍵因素，并分析了繼代過程中出現(xiàn)的試管苗莖尖壞死、高生長緩慢等問題的原因，提出了相關解決方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以紅葉腺柳的1年生帶芽莖段為外植體，誘導側芽萌發(fā)，以側芽為試驗材料進行繼代增殖及試管苗高生長培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 不同細胞分裂素種類及濃度對叢生芽增殖的影響

接種側芽于基本培養(yǎng)基WPM，添加細胞分裂素6-BA、KT 及 TDZ，分別設置 5 個濃度水平：0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mg·L-1。 接種 30d 后統(tǒng)計平均增殖系數(shù)、平均苗高。

1.2.2 不同生長素種類及濃度對叢生芽增殖的影響

接種側芽于基本培養(yǎng)基WPM+6-BA0.5 mg·L-1。添加生長素NAA、IBA，分別設置4個濃度水平：0.02、0.05、0.10、0.30mg·L-1。 接種 30d 后統(tǒng)計平均增殖系數(shù)、平均苗高。

1.2.3 不同培養(yǎng)基成分對試管苗高生長的影響

接種試管苗于基本培養(yǎng)基WPM+6-BA1mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。 添加物分別為水解乳蛋白（0.5、1.0、2.0g·L-1）、水解酪蛋白（0.5、1.0、2.0g·L-1）、2 倍大量母液Ca2+及2倍有機母液。接種30d后統(tǒng)計平均苗高、生長狀況。

1.2.4 不同抗褐化劑對試管苗高生長的影響

接種試管苗于基本培養(yǎng)基WPM+6-BA1mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。添加抗褐化劑PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、維生素C、檸檬酸、硫代硫酸鈉及活性炭，分別設置 3 個濃度水平：0.5、1.0、2.0g·L-1。 接種 30d 后統(tǒng)計平均苗高、生長狀況。

1.2.5 降低激素濃度對試管苗高生長的影響

接種試管苗于基本培養(yǎng)基WPM+活性炭1 g·L-1，添加不同濃度的細胞分裂素 6-BA（0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1）及生長素 NAA（0.05、0.10 mg·L-1），采用完全隨機區(qū)組設計。接種30d后統(tǒng)計平均苗高、生長狀況。

1.2.6 培養(yǎng)條件

接種后置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度24±2℃，光周期14 h·d-1，日光燈光源，光照強度2000lx。培養(yǎng)基中其他成分為3%蔗糖+0.6%瓊脂，pH值為5.8～6。

1.2.7 數(shù)據統(tǒng)計

增殖系數(shù)=增殖后苗的個數(shù)（個）/接種苗的個數(shù)（個）。

樣本數(shù)為每個梯度20個處理，重復2次。使用SPSS19.0對數(shù)據進行處理分析，運用Duncan多范圍檢驗比較分析數(shù)據的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同細胞分裂素種類及濃度對叢生芽增殖的影響

細胞分裂素在促進DNA合成及細胞分裂中起關鍵作用，從而誘導叢生芽的產生[3]，故在培養(yǎng)基中分別添加3種不同的細胞分裂素，以期篩選出適宜種類及濃度的細胞分裂素。

表1 不同細胞分裂素種類及濃度對叢生芽增殖的影響Table1 Effect of different kinds and concentration of cytokinins on multiplication

將初代培養(yǎng)誘導出的側芽切成1.5cm左右的帶芽莖段接種于叢生芽培養(yǎng)基中。

由表1可知，當側芽接種于WPM空白培養(yǎng)基時，試管苗幾乎無增殖且長勢不良，說明細胞分裂素對促進叢生芽增殖效果顯著。試驗發(fā)現(xiàn)，當6-BA濃度為0～1.0mg·L-1時，平均增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加而增長。當添加6-BA濃度為1.0mg·L-1時，平均增殖系數(shù)為4.78，與其他梯度之間產生顯著差異，且葉色翠綠，長勢旺盛（圖版Ⅰ：1）。

當6-BA濃度超過1.5mg·L-1，試管苗會出現(xiàn)玻璃化、莖尖壞死等現(xiàn)象。玻璃化現(xiàn)象是指試管苗呈半透明水漬狀，葉色淡易破碎，長勢弱[4]（圖版Ⅰ：2）。關亞麗等在研究簸箕柳的組培快繁時亦發(fā)現(xiàn)，隨著6-BA濃度的增加，玻璃化明顯加強，嚴重影響增殖[5]。莖尖壞死現(xiàn)象表現(xiàn)為試管苗莖細弱，頂芽及嫩葉在接種20d后卷曲發(fā)黑掉落（圖版Ⅰ：3），繼而導致試管苗全部死亡。這可能是由于外源激素不適宜導致頂端分生組織停止分化或細胞壞死所致[3]。

細胞分裂素種類不同，對植物的效應亦有所差異。當添加KT時，平均增殖系數(shù)為3.53，但試管苗的葉片易脫落。當添加TDZ時，試管苗莖節(jié)呈扁平狀，葉片皺縮發(fā)黃，平均增殖系數(shù)為0。表1的結果顯示KT與TDZ對紅葉腺柳叢生芽增殖沒有明顯的作用，在其他文獻中亦有報道[6]。故誘導紅葉腺柳叢生芽增殖的細胞分裂素宜選擇1.0mg·L-1的6-BA。

2.2 不同生長素種類及濃度對叢生芽增殖的影響

在叢生芽增殖階段，細胞分裂素通常與生長素組合使用為宜。在上述試驗中發(fā)現(xiàn)，單獨添加6-BA，平均苗高均在2.5 cm以下，高生長緩慢，故在培養(yǎng)基中分別添加NAA、IBA，以期篩選出適宜種類及濃度的生長素。

由表2可知，6-BA與生長素組合使用時比單獨使用時增殖效果好。6-BA與NAA配合使用促進試管苗增殖在部分柳屬組織培養(yǎng)中中亦有報告[5,7,8]。當NAA濃度為0.02～0.10mg·L-1時，平均增殖系數(shù)隨NAA濃度的增加而增長，當NAA濃度為0.10mg·L-1時，平均增殖系數(shù)為5.77，與其他梯度之間形成顯著差異。試驗發(fā)現(xiàn)，在添加IBA的培養(yǎng)基里，試管苗易產生莖尖壞死現(xiàn)象，而在添加NAA的培養(yǎng)基里莖尖壞死現(xiàn)象較少見，且試管苗葉色濃綠。但若未及時轉接培養(yǎng)基，亦會出現(xiàn)莖尖壞死現(xiàn)象，適宜的繼代周期為30d。NAA為人工合成的生長素，通過刺激植物細胞內的NAA轉化酶而生成相關生長素來刺激植物生長，但僅對含有NAA轉化酶的植物起作用[9]，說明紅葉腺柳體內含NAA轉化酶較豐富，所以NAA對其增殖及苗高的生長產生影響。故在增殖培養(yǎng)時生長素宜選擇0.10 mg·L-1的NAA。

表2 不同生長素種類及濃度對叢生芽增殖的影響Table2 Effect of different kinds and concentration of auxins on multiplication

綜上所述，適宜的叢生芽增殖培養(yǎng)基配方為：WPM+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。

2.3 不同添加物種類及濃度對試管苗高生長的影響

在叢生芽增殖培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)試管苗高生長緩慢的問題，試管苗的平均苗高均不超過2.5cm，不利于植株的生根移栽，故在培養(yǎng)基中分別添加不同種類的添加物，以期篩選出適宜種類及濃度的添加物。

由表3可知，8組添加物均未促進試管苗高生長。水解乳蛋白及水解酪蛋白易造成試管苗葉子發(fā)黑，植株死亡。水解乳蛋白是由乳蛋白經胰酶消化而成，氨基酸含量豐富[10]。水解酪蛋白是以天然牛奶蛋白為原料，是氨基酸、多肽 、蛋白質混合物[11]。WPM基本培養(yǎng)基有機母液含有甘氨酸、維生素等?？赡苁怯捎谒馊榈鞍住⑺饫业鞍准坝袡C母液中的有機氮含量豐富，促進了乙烯的釋放[12]，反而不利于紅葉腺柳生長。適量Ca2+能抑制葉片衰老，維持葉片濃綠[13]，WPM基本培養(yǎng)基所含的Ca2+可能足以維持試管苗正常生長，故添加2倍Ca2+并未有效促進試管苗高生長。上述8組濃度的添加物均不適宜紅葉腺柳試管苗高生長。

表3 不同添加物種類及濃度對試管苗高生長的影響Table3 Effect of different kinds and concentration of additives on elongation

2.4 不同抗褐化劑種類及濃度對試管苗高生長的影響

繼代培養(yǎng)過程中在試管苗基部發(fā)現(xiàn)褐化現(xiàn)象，這可能是試管苗高生長緩慢的重要原因。褐化現(xiàn)象是指當試管苗傷口中的酚類物質在多酚氧化酶（PPO）的作用下發(fā)生氧化反應，形成有毒的醌類物質，在酪氨酸酶的作用下與試管苗組織中的蛋白質發(fā)生聚合，導致組織代謝紊亂，切面的褐色物質擴散到培養(yǎng)基中，最終使試管苗死亡[14]。木本植物中的酚類物質含量豐富，褐化問題一直是其組織培養(yǎng)中的難題。

表4 不同抗褐化劑種類及濃度對試管苗高生長的影響Table4 Effect of different kinds and concentration of browning inhibitors on elongation

由表4可知，5種抗褐化劑對抑制紅葉腺柳褐化的效果不同。在活性炭濃度為0.5～1.0g·L-1時，平均苗高隨活性炭濃度的升高而增長，當添加1.0g·L-1的活性炭時，平均苗高為6.49 cm，與其他梯度之間形成顯著差異，且試管苗葉片肥厚，莖稈粗壯（圖版Ⅰ：4）。活性炭是強吸附劑，醌類酚類皆可吸附，有效吸附根部周圍傷口產生的褐色有害物質從而抑制褐化現(xiàn)象[15]。同時，活性炭減弱光照，保護了根端產生的IAA，可有效促進壯苗。當添加PVP時，平均苗高雖有顯著提高，苗長勢亦健壯，但對苗的影響不如添加活性炭顯著，可能是因為PVP是酚類物質的專一吸附劑[16]，而培養(yǎng)基中有害物質種類較多，活性炭可起到一定的吸附作用，而PVP只能部分吸附?？箟难?、硫代硫酸鈉對紅葉腺柳試管苗高生長無顯著影響，且在抗壞血酸的作用下，試管苗莖細弱發(fā)黃，不適宜繼續(xù)試驗。檸檬酸、硫代硫酸鈉會導致試管苗發(fā)黑死亡。故抗褐化劑宜選擇1.0g·L-1的活性炭。

圖版Ⅰ 紅葉腺柳繼代培養(yǎng)過程 1.叢生芽；2.叢生芽玻璃化；3.叢生芽莖尖壞死；4.添加活性炭后試管苗高生長；5.激素交替培養(yǎng)后試管苗高生長PlateⅠ SubcultureprocessofSalix Chaenomeloides‘Variegata’ 1.Multiple shoots；2.Vitrification of multiple shoots；3.Apical necrosis of multiple shoots；4.shoot Elongation after adding activated carbon；5.shoot Elongation after using 1.0mg·L-16-BA and 0.5mg·L-16-BA alternately

2.5 降低激素組合濃度對試管苗高生長的影響

在繼代培養(yǎng)過程中，試管苗一直處于高濃度的激素環(huán)境里可能會抑制其營養(yǎng)生長，促使苗增殖但不高生長，且試管苗在同一培養(yǎng)基里繼代多次，易造成試管苗發(fā)黃退化，葉片易發(fā)黑掉落。故降低激素濃度，以期篩選出適宜的促進試管苗高生長的激素配比。

細胞分裂素質量濃度過高不僅能促進酚類物質形成，還能刺激多酚氧化酶（PPO）的活性從而造成褐化[7]。由表5可知，當6-BA濃度為0.1～1.0mg·L-1時，平均苗高隨6-BA濃度的升高而增長，適當降低6-BA濃度能促進試管苗高生長及苗的質量（圖版Ⅰ：5）。王關林等試驗研究亦發(fā)現(xiàn)，當三倍體速生楊誘導出叢生芽后，若直接轉入生根培養(yǎng)，試管苗會發(fā)黑死亡，而若將其轉入低濃度6-BA培養(yǎng)基里，試管苗將從矮化叢生芽狀態(tài)轉入高生長且長壯的狀態(tài)[17]。當6-BA濃度為0.5mg·L-1時，平均苗高為6.56cm，苗生長健壯，葉色濃綠。但6-BA濃度為1.0mg·L-1時，平均苗高雖與0.5 mg·L-16-BA時的平均苗高無明顯差異，但在培養(yǎng)20d后試管苗發(fā)黃，葉片從尖端開始發(fā)黑掉落。故在試管苗高生長階段6-BA應選擇0.5mg·L-1為宜。

表5 降低激素組合濃度對試管苗高生長的影響Table5 Effect of different reduced plant growth regulators combination on elongation

3 結論與討論

由試驗得出結:適宜的繼代培養(yǎng)周期為30d。適宜紅葉腺柳叢生芽增殖培養(yǎng)基為：WPM+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1，適宜紅葉腺柳試管苗高 生 長 培 養(yǎng) 基 為 ：WPM+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+活性炭 1.0g·L-1。在繼代叢生芽增殖培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)試管苗高生長緩慢，莖尖壞死等現(xiàn)象，原因主要是褐化問題及6-BA濃度過高、試管苗長期處于同一激素種類與濃度所致。

對于褐化問題，抗褐化劑選擇1.0g·L-1的活性炭為宜?；钚蕴渴菑娢絼捎行礁恐車鷤诋a生的各類醌類酚類物質從而抑制褐化現(xiàn)象[15]。PVP效果不如活性炭可能是因為PVP是酚類物質的專一吸附劑[16]，只能部分吸附培養(yǎng)基中的有害物質。抗壞血酸、亞硫酸鈉、檸檬酸為抗氧化劑，不適宜做紅葉腺柳試管苗的抗褐化劑。對抗壞血酸抑制褐化的機理，陳凱認為抗壞血酸能使多酚氧化酶失活同時消耗掉溶解氧從而阻止酚類物質氧化，但無法破壞已形成的醌類物質，所以其抗褐化效果較弱[18]。硫代硫酸鈉作為有效的抗氧化劑但同時也是鈣的螯合劑[19]，會降低培養(yǎng)基里Ca2+濃度，從而不利于試管苗生長。檸檬酸可能由于抗氧化性太強，消耗培養(yǎng)基中的溶解氧過量，從而促使試管苗發(fā)黑死亡。

Siddique等研究表明6-BA會抑制頂端優(yōu)勢，從而促進芽增殖及分化[20]，故6-BA濃度過高是抑制試管苗高生長的關鍵因素之一。Khan等在研究四子柳的組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)高濃度的細胞分裂素在試管苗擴繁階段效果顯著，但在生長后期應轉入低濃度的細胞分裂素中，有利于試管苗的長期增殖和高生長[12]。故在試管苗高生長階段應降低6-BA用量，6-BA濃度0.5mg·L-1與1.0 mg·L-1交替使用，可使紅葉腺柳試管苗保持高繁殖率的同時，試管苗高生長顯著，長勢健壯，葉色濃綠。余如剛[8]、郭小燕[21]等分別在旱柳Q106、柳樹優(yōu)良雜交品種的繼代培養(yǎng)時使用激素交替的方法。

試驗研究了適宜紅葉腺柳試管苗增殖與高生長的培養(yǎng)基配比，分析繼代培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的問題及其解決方法，對于如何提高成苗速度及試管苗質量，如何更適宜工廠化生產擴繁，降低成本等問題還有待進一步研究。

參考文獻：

［1］鄭萬鈞.中國樹木志:第 2卷［Z］.北京:中國林業(yè)出版社,1985.

［2］侯元凱，劉松楊，張彥.紅葉柳等彩葉樹種栽培與管理［Z］.北京:中國農業(yè)出版社,2008.

［3］Amo-Marco J B,Lledo M D.In vitro propagation of Salix tarraconensis Pau ex Font Quer,an endemic and threatened plant ［J］.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Plant.1995,32(1):42-46.

［4］Leshem B,Sachs T.'Vitrified'Dianthus—Teratomata in vitro due to Growth Factor Imbalance ［J］.Annals of Botany.1985,56(5):613-617.

［5］關亞麗，陳英，黃敏仁.簸箕柳組織培養(yǎng)初步研究［J］.海南師范大學學報(自然科學版).2009，(02):204-208.

［6］胡珊，李青.紅葉腺柳組織培養(yǎng)及快速繁殖技術研究:2015年中國觀賞園藝學術研討會［Z］.中國福建廈門:20156.

［7］王雅群，李辛晨，陳玉珍，等.北京頤和園西堤古柳組織培養(yǎng)體系的建立［J］.林業(yè)科技開發(fā).2009，(03):48-51.

［8］余如剛，杜雪玲，夏陽，等.旱柳Q106組織培養(yǎng)及快繁體系的建立［J］.草原與草坪.2005，(05):59-61.

［9］馬宗新，高玉祥，趙紅，等.三倍體速生楊樹的組織培養(yǎng)及應用［J］.安徽農業(yè)科學.2004，(04):715-716.

［10］湯青林，牛義，王志敏，等.芋芽繼代培養(yǎng)中激素、水解乳蛋白、碳源的調節(jié)研究 ［J］.西南農業(yè)學報.2006，(05):928-930.

［11］李忠光，龔明.水解酪蛋白對煙草愈傷組織和懸浮培養(yǎng)細胞生長的促進作用［J］.云南師范大學學報(自然科學版).2006，(04):60-61.

［12］Khan M,Ahmad N,Anis M.The role of cytokinins on in vitro shoot production in Salix tetrasperma Roxb.:a tree of ecological importance ［J］.Trees.2011,25(4):577-584.

［13］王亞琴，張康健，黃江康.植物衰老的分子基礎與調控［J］.西北植物學報.2003，(01):182-189.

［14］陳菲，李黎，宮偉.植物組織培養(yǎng)的防褐化探討［J］.北方園藝.2005，(02):69.

［15］鄭文靜，趙海巖，楊立國.植物組織培養(yǎng)操作過程中的常見問題及其解決辦法［J］.遼寧農業(yè)科學.2001，(02):49-51.

［16］杜敬然，趙斌，李英麗，等.紅掌組織培養(yǎng)過程中外植體褐變的研究［J］.北方園藝.2010，(09):160-162.

［17］王關林，方宏筠，那杰.高活性細胞激動素TDZ在植物組織培養(yǎng)中的應用 ［J］.植物學通報.1997，(03):48-54.

［18］陳凱.植物組織培養(yǎng)中褐變的產生機理及抑制措施［J］.安徽農業(yè)科學.2004，(05):1034-1036.

［19］Hayden M R,Tyagi S C,Kolb L,et al.Vascular ossification –calcification in metabolicsyndrome,type 2 diabetes mellitus,chronic kidney disease,and calciphylaxis–calcific uremic arteriolopathy:the emerging role of sodium thiosulfate ［J］.Cardiovascular Diabetology.2005:4.

［20］Siddique I,Anis M.Direct plant regeneration from nodal explants of Balanites?aegyptiaca L.(Del.):a valuable medicinal tree［J］.New Forests.2009,37(1):53-62.

［21］郭小燕.材用優(yōu)良無性系雜交柳遺傳轉化體系的研究［D］.山東師范大學,2007.