淫羊藿總黃酮對大鼠心肌急性缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激干預(yù)機(jī)制的研究

張衛(wèi)萍+鄧楊陽+任建勛+李晶瑾+陳濤+郜姍姍

[摘要]觀察淫羊藿總黃酮對大鼠心肌急性缺血再灌注損傷氧化應(yīng)激干預(yù)作用及其機(jī)制。40只雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，地爾硫卓組（陽性對照藥）以及淫羊藿總黃酮高、低劑量組，每組8只。淫羊藿總黃酮分別以200，100mg·kg^-1的劑量連續(xù)灌胃給藥4d后，結(jié)扎冠狀動脈前降支40min再灌注4h建立大鼠急性心肌缺血再灌注損傷模型。采用N-BT染色法測定心肌梗死范圍，比色法檢測心肌組織中SOD和T-AOc活性及MDA含量，ELISA法測定血清TnI水平，同時光鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)的變化，分別應(yīng)用免疫組化和westem blot法觀察心肌組織中SIRT1與Nrf2表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，淫羊藿總黃酮高、低劑量組以及地爾硫卓組能明顯減少心肌梗死范圍，降低血清TnI水平，提高心肌組織中SOD和T-AOC活性并降低MDA含量（P<0.05或P<0.01），改善缺血再灌注損傷后心肌的組織結(jié)構(gòu)，同時淫羊藿總黃酮高、低劑量組中心肌組織SIRT1和Nrf2表達(dá)明顯增加（P<0.05或P<0.01）。由此可見，淫羊藿總黃酮能夠通過提高機(jī)體SIRT1與Nrf2內(nèi)源性抗氧化信號傳導(dǎo)通路，增加心肌組織的抗過氧化能力，從而抑制心肌急性缺血再灌注過程中氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的心肌細(xì)胞不可逆性傷害，維護(hù)心肌組織的正常功能。

[關(guān)鍵詞]淫羊藿總黃酮；氧化應(yīng)激；缺血再灌注損傷；干預(yù)機(jī)制

氧化應(yīng)激（oxidative stress）反應(yīng)是機(jī)體在各種損傷因素的刺激下，體內(nèi)的活性分子包括活性氧自由基產(chǎn)生過多，超出機(jī)體對過氧化物的清除能力，破壞氧化與抗氧系統(tǒng)之間的平衡，從而造成機(jī)體組織的氧化損傷。心肌缺血再灌注是引起冠心病心肌損傷的重要病理機(jī)制，多見于冠心病溶栓、PCI治療等過程中。而由心肌缺血再灌注過程中產(chǎn)生的大量的活性氧族（ROS）已被證實(shí)是再灌注損傷的重要機(jī)制。因此對心肌缺血再灌注損傷過程中氧化應(yīng)激的干預(yù)是減輕心肌壞死或凋亡、保護(hù)心臟功能、改善預(yù)后的主要途徑和藥理作用靶點(diǎn)。淫羊藿總黃酮是中藥淫羊藿的主要有效部位，對免疫、內(nèi)分泌、心腦血管系統(tǒng)以及骨和腫瘤組織等具有多方面藥理活性。盡管研究證實(shí)淫羊藿有效成分作為天然的抗氧化劑，能夠明顯改善大鼠心肌缺血再灌注后損傷，但是對其抗氧化作用的機(jī)制尚未深入研究。本研究旨在探討淫羊藿總黃酮通過其抗氧化應(yīng)激作用發(fā)揮對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護(hù)的機(jī)制。

1材料

1.1動物

健康雄性SD大鼠40只，SPF級，體重200～220g，斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司提供，合格證號SCXK（京）2011-0004。適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物與試劑

淫羊藿總黃酮購自陜西惠科植物開發(fā)有限公司；鹽酸地爾硫卓片（合心爽，50mg/片，批號1107050）購白天津田邊制藥有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號20150810），丙二醛（MDA）試劑盒（批號20150810），總氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（批號20150508）購自南京建成生物工程研究所；大鼠肌鈣蛋白（TnI）ELISIA測定試劑盒購自美國ANDYGENE公司；抗SIRT1小鼠單克隆抗體（abl04833），抗核因子相關(guān)因子2（Nrf2）大鼠單克隆抗體（ab89443）購自英國abeam公司；BCA蛋白測定試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司。

1.3儀器

DENLEY DRAGON Wellsean MK 3酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；Biofuge traetos低溫高速離心機(jī)（德國Heraeus公司）；蛋白垂直電泳系統(tǒng)（美國bio-rad公司）；LEICA HM335E病理切片機(jī)LEICA[（德國）公司]；Nikon 501光學(xué)顯微鏡[Nikon（日本）公司]。

2方法

2.1分組與給藥

動物隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為假手術(shù)組（給予等體積生理鹽水，5 mL·kg^-1），模型組（給予等體積生理鹽水，5 mL·kg^-1），西藥對照藥地爾硫卓組（10 mg·kg^-1），淫羊藿總黃酮高劑量組（200mg·kg^-1），淫羊藿總黃酮低劑量組（100mg·kg^-1）。以上各組采用的干預(yù)藥物均以生理鹽水配至所需濃度，給藥體積為5 mL·kg^-1，連續(xù)灌胃給藥4d后，采用冠狀動脈結(jié)扎法誘導(dǎo)大鼠心肌缺血再灌注模型。

2.2大鼠心肌缺血再灌注模型的建立

參考文獻(xiàn)方法，大鼠以戊巴比妥鈉腹腔麻醉（45 mg·kg^-1）后，仰位插入氣管插管，接動物呼吸機(jī)行人工呼吸；開胸后暴露心臟，撕開心包膜，在肺動脈圓錐和左心耳之間，于冠狀動脈左前降支根部，即穿線（0號縫合線）待結(jié)扎用。待大鼠穩(wěn)定10min后行冠狀動脈左前降支結(jié)扎。結(jié)扎后心肌缺血的可靠性通過同步監(jiān)測心電圖Ⅱ肢體導(dǎo)聯(lián)，表現(xiàn)為J點(diǎn)或ST段的抬高和T波改變，以及心臟表面由紅潤變?yōu)樯n白。假手術(shù)組大鼠僅進(jìn)行冠狀動脈左前降支根部穿線，但不結(jié)扎。在冠狀動脈左前降支結(jié)扎40min后剪斷結(jié)扎線，實(shí)現(xiàn)再灌注過程，縫合胸壁，動物恢復(fù)自主呼吸。隨后再灌注240min后結(jié)束試驗(yàn)。

2.3指標(biāo)檢測

2.3.1大鼠心肌梗死范圍及測定心肌再灌注末，于心臟結(jié)扎線以下水平橫切5片，進(jìn)行N-BT染色，掃描后采用Image-pro plus圖像分析系統(tǒng)，測量總心肌面積及梗死心肌面積。

2.3.2心肌組織中SOD和T-AOC活性及MDA含量的測定心肌再灌注末，于心臟結(jié)扎線下遠(yuǎn)心端1/3處取心肌組織，進(jìn)行組織勻漿，4 000 r·min^-1離心15min，取上清液，采用比色法測定心肌組織中MDA含量以及SOD和T-AOC活力，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3.3血清肌鈣蛋白I（troponin I，TnI）的測定心肌再灌注末，經(jīng)大鼠腹主動脈抽取全血3 mL，常溫3000 r·min^-1離心15min，取上清，采用ELISA法測定血清TnI水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3.4心肌組織病理學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，于心臟結(jié)扎線下近心端取心肌組織，10%甲醛固定，石蠟包埋后切片，蘇木素.伊紅（HE）染色，光鏡下觀察病理變化。

2.3.5心肌缺血遠(yuǎn)端組織SIRTl蛋白表達(dá)檢測心肌再灌注結(jié)束后，于心臟結(jié)扎線下遠(yuǎn)心端1/3處取心肌組織，10%甲醛固定，石蠟包埋后切片、脫蠟。采用H₂O₂去除內(nèi)源性過氧化物，將切片放入0.01mol·L^-1枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行微波修復(fù)。5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min，加入抗SIRT1小鼠單克隆抗體（1：500）37℃孵育30 min。PBS充分漂洗后，依次滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，鹽酸分化，脫水封片，進(jìn)行鏡下觀察。利用IPP6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，隨機(jī)選擇5個視野對陽性細(xì)胞進(jìn)行平均灰度值測定。

2.3.6心肌缺血遠(yuǎn)端組織Nrf2蛋白表達(dá)檢測心肌再灌注結(jié)束后，于心臟結(jié)扎線下遠(yuǎn)心端1/3處取心肌組織進(jìn)行勻漿，采用BCA法測定總蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白質(zhì)以12%凝膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，大鼠Nrf2單克隆一抗（1：1000）4℃孵育過夜，PBS沖洗后加入二抗室溫下孵育3h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影、轉(zhuǎn)片、掃描；利用Photoshop軟件分析蛋白印跡條帶的灰度值。以目的蛋白與-actin光密度值的比值作為該目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以X±S表示，采用One-Way ANOVA（單因素方差分析）方法，方差齊性應(yīng)用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane's T2檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1心肌缺血再灌注損傷程度的變化

與模型組比較，地爾硫卓組大鼠心肌梗死面積以及梗死區(qū)占心室面積百分比明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，地爾硫卓組，淫羊藿總黃酮高、低劑量組大鼠心肌梗死面積以及梗死區(qū)占心室面積百分比也同樣明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

3.2血清TnI含量的變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TnI含量明顯升高，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，地爾硫卓組，淫羊藿總黃酮高、低劑量組大鼠血清TnI含量明顯減低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表2。

3.3心肌組織中SOD和T-AOC活性及MDA含量的變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織MDA含量明顯升高，SOD與T-AOC活力明顯下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，地爾硫卓組大鼠心肌組織MDA含量明顯下降，同時SOD與T-AOC活力明顯提高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；同時淫羊藿總黃酮高、低劑量組大鼠心肌組織MDA含量也明顯下降，SOD與T-AOC活力則有一定程度的升高，見表3。

3.4心肌組織病理學(xué)改變

假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，肌束排列有序，心肌細(xì)胞無水腫；模型組動物心肌細(xì)胞水樣變性明顯，排列紊亂，肌束間隔增寬，間質(zhì)多量炎細(xì)胞浸潤。地爾硫卓組心肌細(xì)胞肥大，水樣變性略減輕，輕度排列紊亂，肌束間隔略增寬，間質(zhì)內(nèi)可見部分炎細(xì)胞浸潤。淫羊藿總黃酮組心肌細(xì)胞可見輕中度水樣變性，排列無序，肌束間隔略增寬，間質(zhì)有一定量的炎細(xì)胞浸潤，淫羊藿總黃酮2個劑量組心肌組織病理學(xué)變化無明顯的差異性改變，見圖1。

3.5心肌缺血遠(yuǎn)端組織SIRT1蛋白表達(dá)的變化

與假手術(shù)組比較，模型組以及大鼠缺血遠(yuǎn)端心肌組織SIRT1蛋白表達(dá)具有一定程度的提高（P<0.05）；與模型組比較，淫羊藿總黃酮高、低劑量組梗死區(qū)遠(yuǎn)端心肌組織SIRT1蛋白表達(dá)明顯提高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4，圖2。

3.6心肌缺血遠(yuǎn)端組織Nrf2蛋白表達(dá)的變化

與假手術(shù)組比較，模型組Nrf2蛋白表達(dá)明顯降低；與模型組比較，淫羊藿總黃酮高、低劑量組Nrf2表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05或P<0.01），見圖3，表5。

4討論

心肌缺血再灌注損傷時，通過黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)、激活的中性粒細(xì)胞、線粒體呼吸鏈功能異常產(chǎn)生大量氧自由基。大量活性氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞死亡、收縮與舒張功能下降的重要起始因素。在本研究中采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法誘導(dǎo)心肌急性缺血再灌注的病理過程，使心肌組織處于急性缺氧/復(fù)氧狀態(tài)下，由此心肌細(xì)胞線粒體電子轉(zhuǎn)移障礙而產(chǎn)生大量的自由基。自由基蓄積過多，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的過氧化，使膜結(jié)構(gòu)遭到破壞、蛋白降解、核酸主鏈斷裂，最終細(xì)胞崩解，造成心肌的不可逆性損害，表現(xiàn)為心肌中MDA含量增加以及SOD與T-AOC活力下降；同時心肌出現(xiàn)大片的梗死區(qū)，心肌細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的損傷改變，與心肌損傷相關(guān)的血清標(biāo)志酶TnI水平升高，其與心肌的損傷程度呈正比。因此針對心肌缺血再灌注損傷過程中氧化應(yīng)激的處理措施可明顯減少心肌梗死范圍，保護(hù)心功能。

目前研究發(fā)現(xiàn)心臟組織還存在內(nèi)源性抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的途徑，以減少應(yīng)激狀態(tài)下自由基對細(xì)胞的損傷，從而改善心臟功能，成為干預(yù)氧化損傷研究的新靶點(diǎn)。Nrf2與Sirtl是近年來被證實(shí)的與抗氧化應(yīng)激相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，分別通過不同的通路，在調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著重要的作用。Sirtl是依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的第Ⅲ類組蛋白去乙?；?，在心臟和腦組織中分布較多，多表達(dá)在細(xì)胞核中。研究顯示，細(xì)胞核中的Sirtl可能增加對心肌細(xì)胞保護(hù)功能。在氧化應(yīng)激初期過程中心肌細(xì)胞中Sirtl的過表達(dá)通過Sirtl-FoxO1依賴途徑或增加FoxO3和FoxO4活性以保護(hù)心肌細(xì)胞免于氧化應(yīng)激損傷。中藥成分白藜蘆醇能通過增加細(xì)胞核中Sirtl誘導(dǎo)Mn-SOD生成，保護(hù)心臟減少氧化應(yīng)激損傷。同樣，在心肌細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的Nrf2也具有抗心肌細(xì)胞氧化損傷的作用。Nrf2在外來刺激作用下與其阻遏蛋白Keapl解離，再通過與抗氧化反應(yīng)元件（anti-oxidant response element，ARE）結(jié)合，形成Nrt2/ARE通路，啟動下游多種抗氧化蛋白類基因的表達(dá)，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞免疫與氧化應(yīng)激損傷的目的。本研究顯示在心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的過氧化反應(yīng)過程中，與抗自由基氧化相關(guān)的Nrf2表達(dá)下降，提示心肌細(xì)胞的抗氧化能力下降，導(dǎo)致自由基代謝失衡，引起心肌損傷。但是結(jié)果也顯示，模型組大鼠心肌SIRT1表達(dá)明顯增加，說明缺血后心肌遠(yuǎn)端組織低灌注狀態(tài)下的細(xì)胞呼吸鏈功能失常產(chǎn)生的過氧化物質(zhì)刺激組織抗氧化應(yīng)激效應(yīng)出現(xiàn)代償性增加，但是這種應(yīng)激性的抗氧化保護(hù)作用具有一定的時效性，往往隨缺血時間的延長和程度的加重逐漸減弱。

已有證實(shí)，淫羊藿及其活性成分可以明顯保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷，與其抗炎和抗自由基反應(yīng)相關(guān)。本研究同樣顯示，淫羊藿總黃酮對大鼠急性缺血再灌注引起的心肌損傷具有一定程度的保護(hù)作用，可以明顯降低血清心肌酶損傷標(biāo)志物TnI，減少心肌梗死的范圍，減輕心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷。同時提高心肌組織中SOD與T-AOC抗氧化活力，相對應(yīng)的減少M(fèi)DA含量。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮干預(yù)后心肌組織細(xì)胞中抗氧化因子Nrf2和Sirt1表達(dá)也明顯升高，通過核轉(zhuǎn)錄促進(jìn)組織的抗氧化效應(yīng)，抑制心肌的氧化性損傷。此外本研究還提示，心肌缺血再灌注導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在一定程度激活了Sirt1相關(guān)的信號通路，從而促使下游的SOD等抗氧化物質(zhì)的生成，部分提高了機(jī)體總抗氧化能力，發(fā)揮其在組織氧化損傷的病理?xiàng)l件下對心肌組織的適應(yīng)性保護(hù)作用。而淫羊藿總黃酮則進(jìn)一步通過促進(jìn)心肌組織Nrf2和Sirt1的表達(dá)，提高機(jī)體的抗氧化能力，抑制過氧化物質(zhì)的心肌細(xì)胞損傷效應(yīng)，防止再灌注過程中心肌壞死的進(jìn)一步發(fā)展。