毛冬青總黃酮對(duì)小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型的影響

曹利華+鄭雁+辛衛(wèi)云+徐坤+苗明三

[摘要]采用小鼠連續(xù)注射地塞米松復(fù)制血瘀模型，并給予相應(yīng)藥物，連續(xù)灌服15d后，阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流10min，恢復(fù)灌注5d后，再次阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈30min。再灌注24h，復(fù)制小鼠腦缺血耐受模型。取血測全血黏度；斷頭取腦，一半腦置于10%福爾馬林溶液中固定，用于HE染色；另一半腦用生理鹽水制備腦勻漿，用于測定腦組織勻漿中ATPase活力、GLU含量、腦勻漿中NOS表達(dá)；探討毛冬青總黃酮對(duì)小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與缺血耐受組（模型組）比較，高劑量毛冬青總黃酮組能夠顯著降低小鼠血流變高、中、低切值（P<0.01），中、低劑量毛冬青總黃酮組能夠顯著降低小鼠血流變低切值（P<0.01），明顯減輕小鼠血流變中切值（P<0.05），中劑量毛冬青總黃酮組能夠明顯降低小鼠血流變高切值（P<0.05）；高劑量毛冬青總黃酮能夠顯著升高各ATPase活力（P<0.01），中劑量毛冬青總黃酮能夠顯著增強(qiáng)Na⁺-K⁺-ATPase活力（P<0.01），低劑量毛冬青總黃酮能夠明顯升高Na⁺-K⁺-ATPase活力（P<0.05）；高劑量毛冬青總黃酮能夠顯著降低Glu含量（P<0.01），其他給藥劑量能夠明顯降低Glu含量（P<0.05）；高劑量毛冬青總黃酮組可顯著降低小鼠腦組織中TNOS，iNOS的水平（P<0.01），中劑量毛冬青總黃酮組可明顯降低小鼠腦組織中TNOS，iNOS的水平（P<0.05），低劑量毛冬青總黃酮組可明顯降低小鼠腦組織中iNOS的水平（P<0.05）；各劑量毛冬青總黃酮均可改善腦組織病理改變。提示毛冬青總黃酮可從降低全血黏度、抑制炎癥介質(zhì)NOS的表達(dá)、降低Glu含量、升高ATPase活力、改善缺血腦部組織病理方面保護(hù)小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型的腦損傷。

[關(guān)鍵詞]毛冬青總黃酮；血瘀合并腦缺血耐受模型；機(jī)制

毛冬青為冬青科冬青屬植物Ilex pubescensHook.et Am.的干燥根，生于山坡灌木叢中，是我國南方常用中藥，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒之功效。研究表明，毛冬青可增加冠脈血流量、降低冠脈阻力，可增加腦血流量、降低腦血管阻力，對(duì)冠脈血管及腦血管均有一定的擴(kuò)張作用。毛冬青中含有黃酮類成分、酚性成分、香豆素類、二萜類成分、甾醇、鞣質(zhì)、糖類及氨基酸多種化學(xué)成分，主要成分是毛冬青黃酮苷和總皂苷。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型，觀察毛冬青總黃酮對(duì)小鼠腦缺血后全血黏度、腦組織能量代謝，腦勻漿中NOS表達(dá)、GLU含量及腦部組織形態(tài)學(xué)的影響，探討其腦保護(hù)作用的特點(diǎn)及可能機(jī)制。

1材料

毛冬青總黃酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)52%，由河南中醫(yī)學(xué)院分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)20100627）；華佗再造丸（廣州奇星藥業(yè)有限公司，批號(hào)7438）；尼莫地平（山東新華制藥股份有限公司，批號(hào)0808170）；地塞米松磷酸鈉注射液（DX）（江蘇漣水制藥有限公司，批號(hào)0912253）；氯化鈉注射液（鄭州永和制藥有限公司，批號(hào)10062121）；水合氯醛（上海山浦化工有限公司，批號(hào)2010302）；甲醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20100601）；ATP（adenosine-triphosphate）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20100719）；Glu（glutamicacid）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20100719）；NOS（nitric oxide synthetase）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20100717）；考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20100717）。

LBY-N6A型旋轉(zhuǎn)式血液黏度計(jì)（北京普利生集團(tuán)）；72-1分光光度計(jì)，75-2分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；玻璃勻漿器（上海玻璃儀器廠）；恒溫水浴鍋（北京市光明儀器廠）；離心機(jī)（北京醫(yī)療儀器修理廠）；可調(diào)式移液器（上海雷勃分析儀器有限公司）。

Wistar小鼠，昆明種，清潔級(jí)，雄性，體重25～30g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證編號(hào)1006135。

2方法

2.1造模及給藥取小鼠144只，隨機(jī)分為9組，每組16只，分別為毛冬青總黃酮高、中、低劑量組（0.2，0.1，0.05 g·kg^-1；10，5，2.5 g·L^-1），尼莫地平片組（0.02 g·kg^-1，l g·L^-1），華佗再造丸組（1.33 g·kg^-1，66.5 g·L^-1），缺血再灌注損傷組，缺血耐受組（模型組），血瘀假手術(shù)組，非血瘀假手術(shù)組。從每天后腿肌肉注射地塞米松造血瘀模型開始給藥，每日1次，連續(xù)20d，缺血再灌注損傷組、缺血耐受組、血瘀假手術(shù)組、非血瘀假手術(shù)組給予相同體積的0.1%CMC混懸液。所有小鼠灌胃體積均為0.02 mL·g^-1，其中，所有藥物用0.1%CMC溶液配制。

非血瘀假手術(shù)組注射同體積生理鹽水，其余8組，每天給藥1次，同時(shí)每天后腿肌肉注射地塞米松0.8 mg·kg^-1（0.01 mL·g^-1），連續(xù)給藥15d，禁食12h后，10%水合氯醛麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸前正中切口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。除假手術(shù)組和缺血再灌注損傷組外，其余各組均用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10min作為預(yù)處理，然后恢復(fù)灌流，假手術(shù)組和缺血再灌注損傷組只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不做預(yù)處理，所有小鼠繼續(xù)灌藥5 d，第5天給藥后1 h，再次經(jīng)10%水合氯醛0.003 mL·g^-1腹腔麻醉，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，除假手術(shù)組外其余各組均用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈30min后進(jìn)行再灌注并縫合，假手術(shù)組只暴露頸總動(dòng)脈，但不阻斷血流。術(shù)中維持環(huán)境溫度25～26℃。

2.2指標(biāo)檢測所有小鼠于末次手術(shù)24h，統(tǒng)計(jì)死亡率后，摘眼球取血1mL，測全血黏度；處死小鼠，迅速剝?nèi)∧X組織，冠狀切取視交叉后腦組織，10%甲醛溶液固定，用于HE檢測，觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化；準(zhǔn)確稱取剩余腦組織質(zhì)量，按質(zhì)量體積比加生理鹽水制備成10%的腦組織勻漿，勻漿液經(jīng)2300r·min^-1，4℃離心10min，取上清液至-70℃冰箱凍存，按照試劑盒操作說明測定腦組織蛋白含量、AT.Pase活力、Glu濃度、NOS活力測定。

2.3數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比較采用單因素方差分析；等級(jí)資料采用Ridit檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3.1對(duì)小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型血液流變學(xué)的影響與缺血再灌注損傷組相比，缺血耐受組、華佗再造組、中劑量毛冬青總黃酮組死亡率降低；尼莫地平組，高、低劑量毛冬青總黃酮組大鼠死亡率明顯降低；與非血瘀假手術(shù)組比較，血瘀假手術(shù)組小鼠全血流變高、中、低切值顯著升高（P<0.01），說明該劑量地塞米松可以造成小鼠血瘀模型；與血瘀假手術(shù)組比較，缺血再灌注損傷組全血流變值沒有明顯變化，而缺血耐受組（模型組）全血黏度中切、高切值顯著升高（P<0.01），說明手術(shù)對(duì)其刺激可使血瘀程度進(jìn)一步加重；與缺血再灌注損傷組比較，缺血耐受組（模型組）全血流變中切、高切值變化明顯（P<0.05）；與缺血耐受組（模型組）比較，華佗再造丸組能夠明顯降低小鼠全血流變中切值（P<0.05），尼莫地平組能顯著降低小鼠全血流變低、中、高切值（P<0.01）；高劑量毛冬青總黃酮組能夠顯著降低小鼠血流變高、中、低切值（P<0.01），中、低劑量毛冬青總黃酮組能夠顯著降低小鼠血流變低切值（P<0.01），明顯減輕小鼠血流變中切值（P<0.05），中劑量毛冬青總黃酮組能夠明顯降低小鼠血流變高切值（P<0.05），說明給予毛冬青總黃酮后，血液粘滯程度與給藥劑量大小成反相關(guān)。結(jié)果見表1。

3.2對(duì)小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型腦能量代謝的影響與非血瘀假手術(shù)組比，血瘀假手術(shù)組ATP酶活力沒有顯著改變，說明造血瘀模型并不能明顯改變腦組織能量代謝；與血瘀假手術(shù)組比，缺血再灌注損傷組、缺血耐受組（模型組）ATPase活力顯著降低（P<0.01），說明腦缺血可以降低腦組織的能量代謝；與缺血再灌注損傷組比，缺血耐受組（模型組）ATPase活力升高不明顯，與缺血耐受組（模型組）比，華佗再造丸能夠明顯增強(qiáng)Na⁺.K⁺ATPase，Mg²⁺-.ATPase活力（P<0.05），顯著增強(qiáng)Ca²⁺-ATPase活力（P<0.01）；尼莫地平、高劑量毛冬青總黃酮能夠顯著升高各ATPase活力（P<0.01），中劑量毛冬青總黃酮能夠顯著增強(qiáng)Na⁺.K⁺.ATPase活力（P<0.01），低劑量毛冬青總黃酮能夠明顯升高Na⁺K⁺-ATPase活力（P<0.05），表明毛冬青總黃酮對(duì)小鼠血瘀合并腦缺血耐受動(dòng)物模型的ATPase活力有改善作用。以高劑量毛冬青總黃酮提高小鼠血瘀合并腦缺血耐受動(dòng)物模型腦勻漿中ATPase活力為強(qiáng)。結(jié)果見表2。

3.3對(duì)血瘀合并腦缺血小鼠腦組織Glu含量，NOS活力的影響

與非血瘀假手術(shù)組比，血瘀假手術(shù)組小鼠腦組織Glu含量、NOS活力沒有顯著變化；與血瘀假手術(shù)組比，缺血再灌注損傷組Glu含量、TNOS，iNOS活力顯著升高（P<0.01），缺血耐受組（模型組）Glu含量明顯升高（P<0.05），而TNOS，iNOS活力顯著升高（P<0.01），說明腦缺血使興奮性氨基酸大量釋放、增加自由基的釋放；與缺血再灌注損傷組比，缺血耐受組（模型組）Glu含量、NOS活力明顯降低（P<0.05），說明給予缺血預(yù)處理可以降低再次腦缺血造成的興奮性氨基酸的過量釋放、減輕再次缺血所引起的腦組織細(xì)胞大量釋放自由基，從而減輕了大量自由基對(duì)腦細(xì)胞的損傷；與缺血耐受組（模型組）比，華佗再造丸、高劑量毛冬青總黃酮能夠顯著降低Glu含量、TNOS，iNOS的水平（P<0.01），其他給藥劑量能夠明顯降低Glu含量（P<0.05）；尼莫地平組顯著降低iNOS的水平（P<0.01）、明顯降低TNOS水平（P<0.05），中劑量毛冬青總黃酮組可明顯降低小鼠腦組織中TNOS，iN.OS的水平（P<0.05），低劑量毛冬青總黃酮組可明顯降低小鼠腦組織中iNOS的水平（P<0.05）；高、中劑量毛冬青總黃酮對(duì)小鼠血瘀合并腦缺血耐受動(dòng)物模型腦勻漿中NOS表達(dá)作用具有優(yōu)勢(shì)；高劑量毛冬青總黃酮能夠減輕再次大缺血造成的腦組織谷氨酸大量釋放，顯著誘導(dǎo)腦缺血耐受產(chǎn)生，作用較優(yōu)。結(jié)果見表3。

3.4對(duì)小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型腦組織海馬區(qū)組織形態(tài)的影響

非血瘀假手術(shù)組動(dòng)物海馬CA1區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞基本正常；缺血耐受組（模型組）動(dòng)物海馬CA1區(qū)大部分腦神經(jīng)細(xì)胞基本正常，少數(shù)萎縮；血瘀假手術(shù)組動(dòng)物海馬CA1區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞基本正常；缺血再灌注損傷組動(dòng)物海馬CA1區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞明顯萎縮；尼莫地平組動(dòng)物海馬CA1區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞基本正常；華佗組動(dòng)物海馬CA1區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞部分萎縮；高劑量毛冬青總黃酮組動(dòng)物海馬CA1區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞基本正常；中劑量毛冬青總黃酮組動(dòng)物海馬CA1區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞部分萎縮；低劑量毛冬青總黃酮組動(dòng)物海馬CA1區(qū)腦神經(jīng)細(xì)胞明顯萎縮。結(jié)果見圖1，表4。

經(jīng)Ridit檢驗(yàn)，與假手術(shù)組相比，缺血耐受組（模型組）、缺血再灌注組有顯著的統(tǒng)計(jì)意義（P<0.01），說明造模成功。與缺血耐受組（模型組）相比，高、中劑量毛冬青總黃酮組和陽性對(duì)照藥尼莫地平組可顯著減輕腦組織的病理損傷程度（P<0.01），低劑量毛冬青總黃酮組有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與缺血再灌注組相比，缺血耐受組（模型組），高、中、低劑量毛冬青總黃酮組和陽性對(duì)照藥組差異顯著（P<0.01），高、中劑量毛冬青總黃酮對(duì)血瘀合并腦缺血小鼠腦組織病理改變較為優(yōu)越。

4討論

臨床上血栓的形成是導(dǎo)致缺血性腦血管病的一個(gè)重要原因，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為活血化瘀是治療腦缺血疾病主要方法和治則。因此，建立與臨床病癥相似的病癥模型，能夠更好地闡明腦缺血耐受的產(chǎn)生及產(chǎn)生機(jī)制。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，本研究所采用的血瘀合并腦缺血耐受模型是在血瘀的基礎(chǔ)上造成的，缺血程度適宜，手術(shù)方法簡單，模型成功率高，動(dòng)物死亡較少，且與臨床特征較吻合，更適合用于中藥防治缺血性腦血管病的研究。

腦缺血耐受現(xiàn)象（brain ischemic tolerance，BIT）是指預(yù)先短暫性缺血或輕度缺氧激發(fā)或動(dòng)員機(jī)體內(nèi)在的防護(hù)能力，使機(jī)體對(duì)隨后嚴(yán)重的缺血、缺氧產(chǎn)生防御和保護(hù)作用的現(xiàn)象。腦缺血耐受的機(jī)制至今還不很明確。研究表明，耐受涉及遞質(zhì)、受體、通道、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成的多環(huán)節(jié)調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程。某些中藥提取物能夠提高腦缺血耐受性。毛冬青中含有黃酮類成分、酚性成分、香豆素類、二萜類成分、甾醇、鞣質(zhì)、糖類及氨基酸多種化學(xué)成分，其主要成分是毛冬青黃酮苷和總皂苷。毛冬青總黃酮是從冬青屬植物毛冬青的干燥根中提取出來的一類有效成分，具有抗血小板聚集、抗血栓形成、改善血流動(dòng)力學(xué)及抑制平滑肌增生等作用。

腦缺血缺氧后，腦組織內(nèi)NOS表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生了大量具有神經(jīng)毒性的NO、自由基，損傷細(xì)胞膜和線粒體呼吸酶，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡及腦組織損傷。NOS也是一重要的炎癥介質(zhì)，多在免疫應(yīng)答和神經(jīng)損傷后才表達(dá)。研究表明，給予p38MAPK抑制劑可減少腦組織內(nèi)NOS表達(dá)，從而減少腦梗死體積。目前發(fā)現(xiàn)的NOS有3類：神經(jīng)元型（nNOS）、內(nèi)皮型（eNOS）和誘導(dǎo)型（inducible NOS，iNOS），其中iNOS在正常組織中未見表達(dá)，只有在細(xì)胞受到刺激后其表達(dá)呈現(xiàn)，可持續(xù)產(chǎn)生大量NO。抑制iNOS能夠改善神經(jīng)功能評(píng)分，降低死亡率，減少腦梗死體積比，衰減的形態(tài)變化在皮層神經(jīng)元，降低缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度。這些也在一定程度上說明炎癥免疫反應(yīng)參與了腦梗死所致的腦組織損傷，而NOS是啟動(dòng)腦梗死后炎癥免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)。NOS過量表達(dá)可造成自由基的大量釋放，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，損傷細(xì)胞膜和線粒體呼吸酶，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡及腦組織損傷。缺氧激活KATP通道，可以減輕海馬神經(jīng)元的去極化，并可對(duì)谷氨酸興奮毒性所致的神經(jīng)元損傷起到保護(hù)作用。HE染色是腦組織病理改變最直觀的觀察方法，通過觀察其病理改變，可以直接說明藥物作用的強(qiáng)弱。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型復(fù)制成功，毛冬青總黃酮能改善地塞米松導(dǎo)致的血瘀程度，使小鼠血瘀合并腦缺血耐受模型的全血黏度降低，使血液流變得以改善；通過抑制炎癥介質(zhì)NOS的表達(dá)，降低再次大缺血時(shí)對(duì)腦組織的損傷，起到腦缺血耐受作用；減輕自由基對(duì)腦細(xì)胞的損傷，保護(hù)細(xì)胞膜和線粒體呼吸酶；并可對(duì)谷氨酸興奮毒性所致的神經(jīng)元損傷起到保護(hù)作用，且治療效果顯著。