車前草內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性測定

柴明艷

摘要：從車前草葉中分離內(nèi)生真菌，進行發(fā)酵培養(yǎng)，采用其發(fā)酵液開展體外抑菌試驗，觀察其對4種指示菌的抑制作用，與常規(guī)抗生素效果進行對比，并進一步探討該發(fā)酵液對指示菌的最低抑菌濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從車前草葉中分離出19株內(nèi)生真菌，其中菌株Y₁₁對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌均表現(xiàn)出較強的抑菌作用，其效果與桿菌肽相近；菌株Y₁₁對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的最低抑菌濃度分別為0.125、0.250、0.031、1.000 g/L。由結(jié)果可知，車前草葉內(nèi)存在具有抑菌活性的內(nèi)生真菌，可作為篩選抑菌活性物質(zhì)的新資源。

關鍵詞：車前草；內(nèi)生真菌；分離；抑菌活性

中圖分類號：Q939.9 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0353—04

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是指在一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織器官或細胞間隙內(nèi)的細菌、真菌或放線菌。研究證實，內(nèi)生菌和宿主問的生態(tài)關系密切，發(fā)揮著多種生物學功能。有些內(nèi)生菌對植物病原菌具有拮抗作用，可保護植物免受病害侵襲；有些內(nèi)生菌可使宿主體內(nèi)形成某些次生代謝產(chǎn)物；有些內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主相同或類似的生理活性成分；還有些內(nèi)生菌只是與宿主具有共生或伴生關系，其生物學作用尚未被揭示。目前從植物內(nèi)生菌中已分離到較多的生防菌種，但有關車前草內(nèi)生菌資源的研究卻未見報道。車前草作為我國傳統(tǒng)中藥，別稱車輪菜，是車前科植物車前（Plantago asiatica L.）或平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥全草，具有清熱、利尿、通淋、涼血、祛痰、解毒等藥理功效，可用于痰熱咳嗽、吐血衄血、熱淋澀痛、水腫尿少、暑濕泄瀉、癰腫瘡毒等疾病治療。迄今，關于車前草品種資源、種植技術、活性成分及其生物學功能等方面已有較多報道，卻無關于其內(nèi)生菌相關的研究報道。本研究從車前草葉中分離內(nèi)生真菌，并測定其對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等4種指示菌的抑菌活性，旨在篩選出具有抑菌活性的車前草內(nèi)生菌，再篩選出具有明顯抑菌效果的菌株，優(yōu)化其發(fā)酵條件，為進一步發(fā)掘抑菌活性物質(zhì)并開發(fā)利用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試植物 分離內(nèi)生菌所用材料為無病蟲害、生長旺盛的車前草葉片組織，采自山東省淄博職業(yè)學院郊外。

1.1.2指示菌 指示菌為金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌，由淄博職業(yè)學院制藥與生物工程系實驗室提供。

1.1.3培養(yǎng)基 內(nèi)生真菌分離和純化采用PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水補足體積至1 L，pH值7.2～7.4；指示菌生長采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水補足體積至1 L，pH值自然；液體發(fā)酵采用PD培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水補足體積至1 L，pH值為7.2～7.6。以上各種培養(yǎng)基均在0.1 MPa、121℃條件下高溫滅菌30 min后備用。

1.1.4藥敏試紙 藥敏試紙購自北京賽為思生物技術開發(fā)中心，氯霉素藥敏試驗紙片濃度30μg/片，強力霉素藥敏試驗紙片濃度30μg/片，桿菌肽藥敏試驗紙片濃度10μg/片，青霉素藥敏試驗紙片濃度10μg/片，慶大霉素藥敏試驗紙片濃度10μg/片。

1.2試驗方法

1.2.1內(nèi)生菌分離與純化 內(nèi)生真菌分離參照組織塊點植法進行。取新鮮車前草的葉片組織，用自來水洗凈，消毒紙吸干，75%乙醇溶液浸洗15～30 s，無菌水反復沖洗后吸干，0.1%氯化汞漂洗1～2 min，無菌水沖洗吸干。將消毒后的葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小的組織塊，種植于加有30 mg/L鏈霉素的PDA平板上，每平皿接種3塊，于28℃下靜置避光培養(yǎng)，待葉片組織邊緣長出菌絲后，用接種針挑取少許邊緣菌絲接種到新的PDA培養(yǎng)基上，反復純化至單一培養(yǎng)菌株，置于4℃冰箱保存待用，分別將菌種編號為Y₁、Y₂、…、Y_n。

為檢測試驗材料表面是否徹底消毒，取以上最后1次沖洗液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，于同等條件下培養(yǎng)作為對照，如對照平板無菌絲長出即表明消毒徹底，后續(xù)試驗所分離到的真菌來自葉片內(nèi)部。

1.2.2內(nèi)生真菌發(fā)酵液的制備 在內(nèi)生真菌純化用的PDA培養(yǎng)基上，用0.4 cm打孔器在平板上各打取6塊菌餅，接種于裝有PD培養(yǎng)基的100 mL搖瓶中，靜置1 d后，于28℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)5 d，制備成單個內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物。將搖瓶取下靜置后，取上層清液于3 500 r/min離心10 min，取上層清液于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3配制1×10⁶CFU/mL的指示菌懸液 用接種環(huán)取少許指示菌分別接于等量PD營養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于37℃下活化培養(yǎng)1 d。依據(jù)微量稀釋法將活化后的指示菌配成1×106CFU/mL懸液，作為內(nèi)生真菌抑菌作用的后續(xù)研究材料。指示菌包括金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌。

1.2.4內(nèi)生真菌發(fā)酵液抑菌活性 采用濾紙擴散法測定內(nèi)生真菌的抑菌活性。在無菌條件下，取1×10⁶ CFU/mL的指示菌懸液100μL，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，將吸有真菌發(fā)酵液、直徑6 mm的無菌濾紙圓片置于培養(yǎng)基中，每種發(fā)酵液重復3次，以無菌水為對照，同時以氯霉素、青霉素、桿菌肽、強力霉素、慶大霉素等藥敏試紙作抑菌效果對比，37℃培養(yǎng)7～8 h后，用游標卡尺采用十字交叉法測其抑菌圈直徑，取其平均值作為該菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌直徑。各樣品抑菌效果的判定標準為：抑菌圈直徑>15 mm為高度敏感，抑菌圈直徑10～15 mm為中度敏感，抑菌圈直徑7～9 mm為低度敏感，無抑菌圈者為不敏感。

1.2.5最強抑菌活性菌代謝產(chǎn)物的抑菌作用 無菌條件下，取100μL指示菌懸液均勻涂布于LB培養(yǎng)板上，35 min后將浸泡最強抑菌活性菌發(fā)酵液（2 h）、直徑6 mm的無菌濾紙片圓片，貼附到指示菌平板上，同時做氯霉素、強力霉素、桿菌肽、慶大霉素、青霉素等藥敏試紙的對比試驗，每個處理重復3次，37℃培養(yǎng)1 d，觀察各培養(yǎng)板指示菌的生長狀況及抑菌圈大小，測定各處理抑菌圈直徑，即為相應樣品抑菌圈值。

1.2.6最低抑菌濃度（MIC） 將最強抑菌活性菌發(fā)酵液蒸發(fā)濃縮干燥，配制成一定質(zhì)量濃度，采用瓊脂二倍稀釋法、濾紙圓片擴散法，設置3組平行試驗，各設8個梯度，測定車前草內(nèi)生真菌發(fā)酵液對大腸桿菌的MIC值。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析試驗數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生真菌發(fā)酵液抑菌作用

從車前草葉中分離到具有抑菌活性的內(nèi)生真菌共14株，其中至少對1種指示菌具有中等抑菌作用（抑菌直徑>10 mm）的有11株；至少對1種指示菌具有高抑菌活性（抑菌直徑>15 mm）的內(nèi)生真菌有8株，占總分離菌株數(shù)量的42%；另有5株內(nèi)生真菌對各指示菌均無抑制作用（表1）。

2.2內(nèi)生真菌抑菌效果

由表2可見，所分離到的車前草內(nèi)生真菌對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，共有12株內(nèi)生真菌對其有抑菌活性，占總分離菌株數(shù)量的63%；對糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌具有抑菌活性的菌株分別占總分離菌株數(shù)量的47%、58%、37%。總的來說，分離到的內(nèi)生菌對指示菌的抑菌活性有差異，具有一定的特異性。

在具有抑菌活性的14株內(nèi)生真菌中，以Y₁₁的效果最好，在對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌抑菌試驗中的抑菌圈直徑>15 mm，并表現(xiàn)出一定的廣譜特性，可見該菌株抑菌作用顯著，具有很高的研究價值和應用前景。因此，以Y₁₁為車前草高抑菌活性內(nèi)生真菌，進行該菌株與常用抗生素的對比研究，并進一步探討其最低抑菌濃度。

2.3 Y9發(fā)酵液與抗生素抑菌活性對比

如表3所示，與幾種常用抗生素相比，車前草內(nèi)生真菌Y₁₁發(fā)酵液對4種指示菌均有較好的抑菌作用。Y₁₁發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果與強力霉素、桿菌肽接近，顯著弱于青霉素（P<0.05），顯著強于氯霉素（P<0.05）；對糞鏈球菌的抑制作用也相對較強，與對照抗生素抑菌效果接近；對大腸桿菌的抑菌圈大于青霉素、慶大霉素，卻小于氯霉素、強力霉素、桿菌肽；對沙門氏菌的抑菌圈只是略大于氯霉素?？梢?，Y₁₁發(fā)酵液具有較強的抑菌效果，且廣譜性較好，但特異性不如部分供試抗生素。

2.4對大腸桿菌的最低抑菌濃度

從表4可見，將Y₁₁發(fā)酵液濃縮干燥后，其對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌的最低抑菌濃度分別為0.125、0.250、0.031、1.000 g/L，反映出車前草最強抑菌株的抑菌特性。

3討論

3.1車前草內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

現(xiàn)有研究證實，植物內(nèi)生真菌遍存在于各種植物體內(nèi)，可作為微生物資源進行應用開發(fā)，成為新型生物醫(yī)藥。其原因是內(nèi)生真菌能與宿主植物形成特殊生境心，二者均具備類似代謝物的合成途徑，即可產(chǎn)生宿主植物所富集的生物活性物質(zhì)。車前草所含生物活性物質(zhì)抑菌功能顯著，具有重要的醫(yī)藥價值，目前卻無相關內(nèi)生真菌的研究?，F(xiàn)代生物學中，體外抑菌試驗常被作為抑菌研究的主要方法，能準確地揭示供試品的抑菌效果，不受內(nèi)環(huán)境各因素的干擾，且具有重復性好的特點。因此，要研究車前草內(nèi)生真菌的抑菌作用，可先分離純化出內(nèi)生真菌，再進行發(fā)酵液體外抑菌試驗。

本試驗對車前草內(nèi)生真菌進行分離純化，共獲取19株活菌，并全部進行發(fā)酵，獲取代謝產(chǎn)物進行抑菌試驗，篩選出1株Y₁₁菌株，具有最強抑菌作用。車前草內(nèi)生真菌的獲取受到生境、品種、分離、純化等因素的影響，個樣研究已揭示其代表性，但有關車前草內(nèi)生真菌的分離研究還有待進一步探討。

3.2車前草內(nèi)生真菌的抑菌作用

內(nèi)生真菌可脫離宿主植物獨立生長，在適宜生境中能通過發(fā)酵獲得大量目的活性產(chǎn)物，依據(jù)該特性可獲取新源天然藥物，以緩解某些藥用植物資源短缺、生長周期長、生態(tài)系統(tǒng)損害等現(xiàn)象，并能為新藥開發(fā)與瀕危藥用植物保護等難題提供重要思路。研究證實，車前草體內(nèi)能合成多種活性物質(zhì)，并具有廣譜抗菌效果，可能與其共生的內(nèi)生真菌有關。

一直以來，抗生素在人與動物疾病防治中發(fā)揮著巨大功能，但由于病原菌耐藥性增加、藥物殘留等問題的日益凸顯，使得尋求天然、高效、綠色的替代品更加重要。本研究從車前草葉片內(nèi)共分離到19株內(nèi)生真菌，其中8株發(fā)酵液至少對1種指示菌具有較強的抑菌效果，而其他不具有抑菌活性的內(nèi)生真菌極可能是由于所取組織部位處在代謝休眠期，也可能因培養(yǎng)條件不適等?？梢?，內(nèi)生真菌合成抑菌活性物質(zhì)還受到外界環(huán)境溫度、pH值以及培養(yǎng)時間等因素的影響，有待深入研究。后續(xù)研究證實，Y₁₁發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌均表現(xiàn)出較強的抑制作用，尤其是對前三者具有很好的抑菌效果，可與部分抗生素相媲美，且具有較低的最低抑菌濃度，預示Y₁₁菌株具有非常高的開發(fā)價值，極可能取代部分抗生素進行應用。

3.3結(jié)論

本研究從車前草內(nèi)生真菌中篩選出Y₁₁菌種，其代謝活性產(chǎn)物對金黃葡萄球菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等指示菌均表現(xiàn)出很好的抑菌作用，且效果與部分常用抗生素相近，具有良好的應用價值。因此，下一步有必要研究車前草內(nèi)生真菌活性產(chǎn)物的抑菌成分、理化特性、作用機制以及活菌株培養(yǎng)時間、pH值、溫度、營養(yǎng)素構(gòu)成等條件優(yōu)化，為車前草抗菌活性物開發(fā)利用提供依據(jù)。