超高效液相色譜法測(cè)定調(diào)味醬中的苯甲酸和山梨酸

建立了超高效液相色譜快速測(cè)定調(diào)味醬中苯甲酸、山梨酸的方法。樣品以亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白質(zhì)。使用C18色譜柱，流動(dòng)相為0.02 mol/L乙酸銨–甲醇（95：5，v/v），梯度洗脫，用二極管陣列檢測(cè)器在波長(zhǎng)240nm處檢測(cè)，流速為0.35 mL/min。結(jié)果表明，苯甲酸、山梨酸在5min內(nèi)可以很好的分離，加標(biāo)回收率在96.00-99.30%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.53-1.39%之間。該法簡(jiǎn)單、靈敏，適用于調(diào)味醬中苯甲酸和山梨酸的檢測(cè)。

調(diào)味醬是我國(guó)人民日常生活中使用的產(chǎn)品，由于其中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，在長(zhǎng)期儲(chǔ)存中極易變質(zhì)，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，企業(yè)為防止其變質(zhì)，會(huì)在其加工過(guò)程中常加入苯甲酸和山梨酸等防腐劑。但是食用含有過(guò)量苯甲酸和山梨酸的食品會(huì)嚴(yán)重影響人體健康。

本實(shí)驗(yàn)的目的是建立一種超高效液相色譜法測(cè)定調(diào)味醬中的苯甲酸和山梨酸的方法，用于快速檢測(cè)苯甲酸和山梨酸在調(diào)味醬中的含量。

材料與方法

材料與試劑。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度99%；甲醇（色譜純）；乙酸銨（色譜純）；超純水；10%亞鐵氰化鉀；22%乙酸鋅。

儀器與設(shè)備。超高效液相色譜儀：Waters UPLC ：配有紫外檢測(cè)器；渦旋振蕩器；高速冷凍離心機(jī)。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制。準(zhǔn)確稱取0.1g（精確至0.0001g）苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別移取濃度為1.0mg/mL的苯甲酸和山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.20mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL，至100mL容量瓶中，用水稀釋成濃度分別為2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

樣品處理。稱取5g（精確至0.01 g）調(diào)味醬樣品，于50mL容量瓶中，加入20mL-30mL純水混勻，加入10%亞鐵氰化鉀、22%乙酸鋅各10.0mL，加水至刻度混勻，靜置30min后用濾紙過(guò)濾，取濾液過(guò)0.45μm濾膜，待測(cè)。

色譜條件。色譜柱：ACOUITY UPLCTM BEH C18柱（1.7μm，2.2mm×50mm）；二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.02mol/L乙酸銨；流速：0.35mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：1.0μL。

結(jié)果與分析

樣品處理方法。調(diào)味醬中基質(zhì)復(fù)雜，且含蛋白質(zhì)較多，本實(shí)驗(yàn)分別采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法和文獻(xiàn)中報(bào)道的方法進(jìn)行對(duì)比。

方法一：樣品稀釋后，加入10%亞鐵氰化鉀和22%乙酸鋅定容混勻后，沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，靜置30min后用濾紙過(guò)濾，取濾液過(guò)0.45μm濾膜，進(jìn)樣。

方法二，樣品采用甲醇提取，離心取上清，過(guò)固相萃取柱，甲醇洗脫后，過(guò)0.45μm濾膜進(jìn)樣。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種前處理方法均能得到較好的提取和凈化效果，但是采用第一種方法，操作簡(jiǎn)單且除蛋白比較徹底。

流動(dòng)相初始比例與進(jìn)樣量的確定。實(shí)驗(yàn)比較了初始甲醇比例分別為1-10%時(shí)對(duì)分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇比例較低時(shí)，2個(gè)峰都能分開(kāi)，但甲醇比例越低出峰時(shí)間越慢；而甲醇比例逐漸增加至10%時(shí)，隨著比例的升高，苯甲酸和山梨酸的峰分離度變差且色譜峰響應(yīng)值降低，綜合考慮選擇流動(dòng)相中甲醇的初始比例為5%。實(shí)驗(yàn)比較了進(jìn)樣量分別為1、2、4、6、8、10μL時(shí)對(duì)分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)樣量為1μL，苯甲酸和山梨酸的分離效果很好，峰形好看；而到10μL時(shí)，苯甲酸和山梨酸的峰則分離不明顯，因此選擇進(jìn)樣量為1μL。

檢測(cè)波長(zhǎng)的確定。通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器在220-300nm之間對(duì)各組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，發(fā)現(xiàn)苯甲酸的最大吸收波長(zhǎng)為225.6nm，山梨酸為243.2nm，在230-240nm之間都能檢測(cè)出2種防腐劑的峰；而在230 nm處，2種防腐劑的吸收峰都比較明顯，因此選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

方法線性范圍和檢出限的確定。配制質(zhì)量濃度為2.0-50μg/mL的苯甲酸和山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程分別為y = 11740x + 3779和y = 1867x - 394.58，相關(guān)系數(shù)分別為0.9994和0.9999，以S/N=3作為檢出限，則苯甲酸和山梨酸的檢出限分別為6mg /kg和7.8mg /kg。

樣品測(cè)定。采用本方法測(cè)定市場(chǎng)上隨機(jī)抽取的10批次調(diào)味醬樣品測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明：調(diào)味醬中主要含有苯甲酸，含量為0.56-0.78g/L，均低于國(guó)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)1.0g/L。

通過(guò)實(shí)際樣品的測(cè)定，本地區(qū)所檢測(cè)調(diào)味醬中的苯甲酸和山梨酸含量均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，但是不能說(shuō)明其他部分企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品也滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，我國(guó)調(diào)味醬市場(chǎng)龐大，建議食品安全相關(guān)部門(mén)還需加強(qiáng)監(jiān)管，確保食品質(zhì)量安全。