鐵棍山藥和太谷山藥代謝成分差異研究

臘貴曉，理向陽，郭紅霞，劉永康，白自偉，楊鐵鋼*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州 450002； 2.溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,河南 溫縣 454850)

鐵棍山藥和太谷山藥代謝成分差異研究

臘貴曉1，理向陽1，郭紅霞1，劉永康2，白自偉2，楊鐵鋼1*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州 450002； 2.溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,河南 溫縣 454850)

采用代謝組學(xué)方法，利用超高效液相色譜-單四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)鐵棍山藥和太谷山藥的代謝成分進(jìn)行分析，以期為山藥的功能評(píng)價(jià)提供參考。結(jié)果表明，利用Masslynx軟件能將鐵棍山藥和太谷山藥正離子模式下檢測(cè)到的代謝物進(jìn)行很好的分組，這表明，鐵棍山藥和太谷山藥代謝物差異較大；進(jìn)一步對(duì)其差異代謝物質(zhì)進(jìn)行S-Plot分析，發(fā)現(xiàn)有8種差異代謝物質(zhì)，通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)，其中3種為植酸、麥角甾醇和豆固醇，分別屬于酸類和醇類，有5種代謝物需要進(jìn)一步鑒定。由此可見，通過對(duì)山藥代謝物的差異化分析，可以對(duì)山藥的藥效屬性進(jìn)行評(píng)估，這為保持山藥的地道性提供了重要的檢測(cè)手段。

山藥； 鐵棍山藥； 太谷山藥； 代謝組學(xué)； 超高效液相色譜-單四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀

山藥(DioscoreaoppositaThunb.)是我國重要的藥食兼用、高產(chǎn)、高效經(jīng)濟(jì)作物[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將山藥列為滋補(bǔ)上品藥材，有健脾、補(bǔ)肺、固腎、益精之功效[2]。臨床藥理研究表明，山藥具有抗氧化、降血脂、降血糖、肝損傷保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。我國是山藥的原產(chǎn)地之一，其廣泛分布于我國東北、華北、華中、東南、西南等地區(qū)[4]。不同的地域及栽培品種致使山藥成分構(gòu)成及含量有很大差異，進(jìn)而導(dǎo)致山藥質(zhì)量的優(yōu)劣和療效存在差異，因此，在中藥上常有“地道藥材”之說[5]。

我國多版藥典把主產(chǎn)于我國北方的薯蕷(DioscoreaoppositeThunb.)，即懷山藥，記載為山藥基原植物[6]。但目前市場(chǎng)上山藥種源多樣，如淮山參薯(DioscoreaalataL.)、廣西淮山褐苞薯蕷(DioscoreapersimilisPrain et Burkill)、廣東淮山山薯(DioscoreafordiiPrain et Burkill)等在南方均有大面積種植，也是當(dāng)?shù)刂兴幹兄匾纳剿幩幉膩碓础Ｒ虼?，只有明確不同品種山藥藥性成分的差異，才能對(duì)其藥用價(jià)值進(jìn)行評(píng)估及臨床使用。大量研究結(jié)果表明，山藥藥用成分主要取決于其代謝成分，如皂苷、膽堿、黃酮、氨基酸等[7]，因此，山藥代謝成分的差異直接決定其藥用價(jià)值。

代謝組學(xué)是對(duì)細(xì)胞、器官、生物體內(nèi)維持其正常生長(zhǎng)和功能的小分子代謝物或化學(xué)分子(<1 500 u)同步實(shí)時(shí)定量分析的一門新學(xué)科[8]。代謝組學(xué)是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)的系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)分支[9]。植物代謝組學(xué)被認(rèn)為是研究中藥材成分及評(píng)估中藥材品質(zhì)的重要手段。研究表明，通過代謝組學(xué)研究單味藥的代謝指紋圖譜，不僅能夠研究藥物內(nèi)源性代謝物的變化，還能為全面評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量提供可靠的方法和依據(jù)[10-13]。代謝組學(xué)研究方法已經(jīng)在赤藥、白芍、款冬花、柴胡、川烏等藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)中發(fā)揮了重要的作用[14-19]，而在山藥品質(zhì)研究中尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，基于超高效液相色譜-單四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF)，利用代謝組學(xué)研究方法對(duì)鐵棍山藥和太谷山藥的代謝成分進(jìn)行分析，以期為山藥的藥用評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器：超高效液相色譜-單四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF)(Xevo G-2，Waters，USA)、萬分之一電子天平(FA2004B，上海佑科儀器儀表有限公司)、超聲波提取器(KQ-3200DE，昆山市超聲儀器有限公司)、超純水器(MILLI-Q，MILLI-Q INC.，USA)、高速離心機(jī)(MULTIFUGE X1R,Thermo Scientific,USA)。

試劑：甲醇(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)、乙腈(DIKMA TECHNOLOGIE INC.,USA)、甲酸(Fisher Sentific INC.，USA)。

1.2 供試材料

供試材料為鐵棍山藥和太古山藥，均由溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所四大懷藥研究室提供。

1.3 樣品處理

把樣品放入研缽加入液氮快速研磨成粉末狀，準(zhǔn)確稱量50 mg磨碎后的樣品放入4 mL樣品瓶中，加入含0.1%甲酸的75%甲醇混合液，配制成溶質(zhì)溶劑比為1∶5溶液；超聲提取15 min,于室溫在12 000 r/min條件下離心10 min,取上清液，用0.22 μm PTFE濾膜(Sigma公司，USA)過濾，取0.1 mL濾液進(jìn)行UPLC-QTOF分析。提取液一式三份以供上機(jī)檢測(cè)及后續(xù)分析，為減少儀器對(duì)檢測(cè)帶來的誤差，樣品需隨機(jī)排列。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 色譜分離條件 色譜柱：BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，粒度1.7 μm，Waters，USA)；流動(dòng)相：流動(dòng)相A(V甲酸︰V去離子水=1︰1 000)和流動(dòng)相B(V甲酸︰V乙腈=1︰1 000)；梯度洗脫條件：0～2.0 min流動(dòng)相B保持5%；2.0～22.0 min，流動(dòng)相B 5%～95%梯度變化；22.0～25.0 min，流動(dòng)相B保持95%；25.0～27.0 min，流動(dòng)相B在95%～5%梯度變化；27.0～30.0 min，流動(dòng)相B 保持5%；流速為0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件 離子源：電噴霧(ESI)；離子模式：正離子；離子源溫度：120 ℃；毛細(xì)管溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓：2 000 V；錐孔電壓：17 V；電噴霧電壓：1 600 V；掃描時(shí)間：0.1 s，掃描間隔0.02 s；脫溶劑流速：450 L/h；霧化氣、吹脫氣、輔助加熱氣、碰撞氣均為高純氮?dú)?；離子監(jiān)測(cè)質(zhì)荷比(m/z)：100～1 000。

1.5 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Waters MasslynxTM4.1軟件進(jìn)行處理；采用SPSS 20.0對(duì)差異化代謝物質(zhì)的含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；作圖通過Excel 2010完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵棍山藥和太谷山藥總離子流差異分析

從圖1可以看出，在5～10 min的總離子流圖譜上，鐵棍山藥和太谷山藥代謝物有明顯的差異。進(jìn)一步采用Waters MasslynxTM4.1軟件對(duì)2種山藥代謝物總離子流信息進(jìn)行主成分分析(PCA)，2種山藥代謝物主成分得分見圖2。由圖2可以看出，2種山藥的代謝物可以進(jìn)行很好的分組，這說明2種不同山藥的代謝成分存在著差異化物質(zhì)。

2.2 鐵棍山藥和太谷山藥代謝成分差異分析

通過Waters MasslynxTM4.1軟件對(duì)2種山藥的代謝物質(zhì)進(jìn)行S-Plot分析，篩選出8種潛在的差異化代謝物質(zhì)，其質(zhì)譜信息見表1。利用Waters MasslynxTM4.1軟件將檢測(cè)到的差異化代謝物質(zhì)質(zhì)譜信息和數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)，在數(shù)據(jù)庫中檢索到3種代謝物質(zhì)與檢測(cè)到的差異化代謝物質(zhì)的質(zhì)譜信息一致，分別為植酸、麥角甾醇和豆固醇，其結(jié)構(gòu)信息見表2。

圖1 鐵棍山藥(A)和太谷山藥(B)代謝物總離子流

圖2 鐵棍山藥和太谷山藥代謝物PCA得分

編號(hào)保留時(shí)間/min質(zhì)荷比特征離子碎片16．28475．3307[453，475，491]26．72566．4270[566，588]37．05679．5015[679，701，717]47．29396．8136[396，416]57．47453．3523[453，472]612．46308．1673[308]714．26457．2842[457，473]820．73413．2757[413，701]

2.3 鐵棍山藥和太谷山藥差異化代謝成分相對(duì)含量分析

對(duì)2個(gè)山藥品種不同差異化代謝成分的峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，作為其在山藥中的相對(duì)含量(圖3)。從圖3可以看出，8種差異代謝成分中，鐵棍山藥有2種代謝物比太谷山藥高，而太谷山藥有6種代謝物比鐵棍山藥高，其中未知物4差異最大，鐵棍山藥中含量是太谷山藥中含量的106.32倍，差異化最小的是未知物2，太谷山藥中含量是鐵棍山藥中含量的3.15倍。3種已知的代謝物中，太谷山藥的植酸、麥角甾醇和豆固醇含量均高于鐵棍山藥。

表2 鐵棍山藥和太古山藥差異化代謝物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息

注：-表示數(shù)據(jù)庫中未檢索到對(duì)應(yīng)的物質(zhì)，需要進(jìn)一步分離鑒定。

圖3 鐵棍山藥和太古山藥差異化代謝物質(zhì)的相對(duì)含量

3 結(jié)論與討論

山藥是我國中醫(yī)臨床上一味重要中藥，山藥重要藥效的發(fā)揮與其代謝物密切相關(guān)[20]，因此，只有對(duì)其代謝物進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，才有利于全面評(píng)價(jià)山藥藥效[2,7]。代謝組學(xué)作為一門新興學(xué)科，已經(jīng)在中藥藥效物質(zhì)及作用機(jī)制研究方面取得了很多突出成果[10]。Li等[21]通過HPLC-TOF，利用代謝組學(xué)方法對(duì)不同防風(fēng)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，不同的防風(fēng)得到很好的區(qū)分，并且找到了升麻素等10個(gè)特征成分；此外，在對(duì)南柴胡和北柴胡的區(qū)分、赤芍和白芍的品質(zhì)評(píng)價(jià)等方面[15,18]，代謝組學(xué)都起到了非常重要的作用。但是目前代謝組學(xué)在山藥品質(zhì)分析中還未見報(bào)道。本研究通過選取我國有代表性的2個(gè)山藥品種鐵棍山藥和太古山藥，利用基于UPLC-QTOF的代謝組學(xué)方法對(duì)其代謝物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，不同品種山藥的代謝物可以得到很好的分組，這表明代謝組學(xué)方法可以用來對(duì)不同山藥進(jìn)行品質(zhì)分析和評(píng)估。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，2種山藥中有8種潛在的代謝物差異顯著；通過標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定出3種差異化代謝物，分別為植酸、麥角甾醇和豆固醇，這3種物質(zhì)被認(rèn)為是山藥中重要的保健成分[2,4,7]。植酸能改善血紅細(xì)胞功能，延長(zhǎng)血紅細(xì)胞的生存期[22]；麥角甾醇對(duì)促進(jìn)細(xì)胞膜完整性具有重要作用[23]；豆固醇有預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病、抑制腫瘤、促進(jìn)新陳代謝、調(diào)節(jié)激素水平等多種保健功效[7]。進(jìn)一步對(duì)差異化代謝物相對(duì)含量分析發(fā)現(xiàn)，有6種差異化代謝物在太古山藥中含量較高，而在鐵棍山藥中只有2種含量較高，在中醫(yī)上，多以太古山藥入藥，這兩者是否有關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步分析。

在本研究中，采用了正離子模式對(duì)山藥代謝物進(jìn)行分析，而負(fù)離子模式下，不同品種山藥代謝物的差異化還有待進(jìn)一步分析，以便更全面地了解代謝組學(xué)在山藥品質(zhì)評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值；同時(shí)，本研究?jī)H選取了2個(gè)代表性山藥品種，更多其他山藥品種的代謝組學(xué)品質(zhì)評(píng)估，還有待進(jìn)一步開展。

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Research on Metabolomics of Tiegun Yam and Taigu Yam

LA Guixiao1,LI Xiangyang1,GUO Hongxia1,LIU Yongkang2,BAI Ziwei2,YANG Tiegang1*

(1.Industrial Crops Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 2.Wenxian Institute of Agricultural Sciences,Wenxian 454850,China)

In this article, using ultra high performance liquid chromatography with single quadrupole-time of flight mass spectrometry(UPLC-QTOF), the metabolomics of Tiegun yam and Taigu yam were analyzed,to provide a basis for evaluation of yam function. The results indicated that the metabolites of Tiegun yam and Taigu yam detected under positive ion mode could be grouped well using Masslynx software, which revealed that there were significant differences between two Chinese yams.ByS-Plotanalysis under Masslynx software, 8 different kinds of metabolic substances were revealed between Tiegun yam and Taigu yam,among which 3 kinds were identified belonging to acids and alcohols(phytic acid, ergosterol, stigmasterol),while 5 kinds needed to be analyzed further. In conclusion,research on metabolomics can be used to evaluate the efficacy attribute of Chinese yam,which provides an important means of detection for maintaining the authentic nature of Chinese yam.

Chinese yam; Tiegun yam; Taigu yam; metabolomics; ultra high performance liquid chromatography with single quadrupole-time of flight mass spectrometry (UPLC-QTOF)

2017-01-16

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新項(xiàng)目

臘貴曉(1981-)，男，河南淅川人，副研究員，博士，主要從事次生代謝物質(zhì)的分離、鑒定及營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究。 E-mail：zju-l@163.com

*通訊作者：楊鐵鋼(1967-)，男，河南長(zhǎng)垣人，研究員，博士，主要從事中藥材遺傳育種及栽培技術(shù)研究。 E-mail：ytgha@163.com

S632.1;O657.63

A

1004-3268(2017)05-0116-04