1株耐Cd細(xì)菌的分離、鑒定及其吸附特性研究

徐淑霞,杜文濤,王曉雅,張繼冉,張世敏,吳 坤

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

1株耐Cd細(xì)菌的分離、鑒定及其吸附特性研究

徐淑霞,杜文濤,王曉雅,張繼冉,張世敏,吳 坤*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

從長(zhǎng)期受農(nóng)藥污染的土壤中分離篩選到1株可耐受重金屬Cd的菌株，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性、16S rRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析確定該菌株為路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)，命名為EM1，為Cd污染水體及土壤的修復(fù)提供微生物菌株。在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中菌株EM1對(duì)Cd2+的最適耐受質(zhì)量濃度為50 mg/L，吸附Cd2+的最適生長(zhǎng)溫度為35 ℃，最適pH值為6.0,在此條件下，其對(duì)Cd2+的吸附率最大，為92%。電鏡掃描結(jié)果表明，在吸附Cd2+的過(guò)程中菌體表面分泌大量的胞外多聚物且菌體形態(tài)發(fā)生變化。紅外光譜分析顯示，Cd2+脅迫條件下，菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化，菌株吸附Cd2+的過(guò)程主要與菌體表面的羥基、N-H、C-H、多糖中的C-O-C及酰胺基團(tuán)有關(guān)。

耐鎘細(xì)菌； 路德維希腸桿菌； 生物吸附； 電鏡觀察； 紅外光譜分析

隨著國(guó)家工業(yè)水平的提高，工業(yè)迅速發(fā)展帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題也越來(lái)越嚴(yán)重。由于采礦、冶煉、電鍍等產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，大量含有重金屬離子的工業(yè)廢水排放到環(huán)境中，引起生態(tài)惡化，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重危害。重金屬污染是目前環(huán)境污染中日趨嚴(yán)重的一種污染方式，其中鎘(Cd)是污染程度最嚴(yán)重的重金屬之一[1]。Cd具有一定的致癌和致突變性，是一種毒性很強(qiáng)的重金屬元素。它能經(jīng)食物鏈在動(dòng)植物體內(nèi)富集，并對(duì)動(dòng)物內(nèi)臟器官以及血液循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生一系列損傷，從而對(duì)動(dòng)物尤其是人類(lèi)的健康產(chǎn)生威脅[2]。重金屬污染是我國(guó)水體和土壤環(huán)境中普遍存在的污染形式，并對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，必須重視重金屬污染問(wèn)題，探索經(jīng)濟(jì)高效的污染修復(fù)技術(shù)，為國(guó)家糧食安全及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。環(huán)境中重金屬污染的處理方法有許多種，在眾多的處理方法中，利用微生物作為吸附劑去除工業(yè)廢水及其污染土壤中的重金屬離子具有吸附容量大、速度快、選擇性好、成本低、易再生等優(yōu)點(diǎn)[3]，具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為目前研究的熱點(diǎn)。目前，重金屬在環(huán)境中的存在與安全性逐漸被人們所重視，但有關(guān)其對(duì)生物的毒害機(jī)制及生物治理的研究還處于探索階段，相關(guān)報(bào)道較少。Holan等[4]研究發(fā)現(xiàn)，海藻對(duì)Cd去除率達(dá)99%；李清彪等[5]研究了白腐真菌對(duì)Pb的吸附，吸附率達(dá)到95%以上；Arivalagan等[6]從電鍍廠土壤中分離得到1株抗Cd菌株B.cereusKTSMBNL 43，在適宜的條件下，其對(duì)Cd2+的最大生物吸附率達(dá)82%；Polti等[7]分離出能夠同時(shí)去除重金屬Cd2+和農(nóng)藥林丹的5株放線菌，其中放線菌M7對(duì)2種污染物的去除率都較高，為40%左右；Olaniran等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在Pb和Hg存在的條件下，微生物對(duì)1，2-二氯乙烷在土壤中的降解產(chǎn)生負(fù)面影響，且生物刺激可以對(duì)1，2-二氯乙烷微生物降解產(chǎn)生積極的影響。以上研究表明，生物方法尤其是微生物方法用于修復(fù)重金屬污染具有可行性。鑒于此，從長(zhǎng)期受農(nóng)藥污染的土壤中分離耐Cd細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定，分析其吸附特性，并利用掃描電鏡、紅外光譜等分析手段對(duì)其在吸附Cd過(guò)程中細(xì)胞表面活性基團(tuán)的變化進(jìn)行了初步研究，從而確定其重金屬結(jié)合位點(diǎn)及與吸附作用相關(guān)的細(xì)胞成分，進(jìn)而為研究菌體吸附重金屬的機(jī)制提供理論依據(jù)，并為微生物在Cd污染治理中的應(yīng)用提供一定的技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 土樣采自河南一農(nóng)藥廠。

1.1.2 培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO41.0 g、NaH2PO41.0 g、CaCl2·H2O 0.02 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NH4NO31.0 g、FeCl3·3H2O 0.05 g、水1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、水1 000 mL。

1.1.3 儀器 主要儀器為MIKRO-22R高速冷凍離心機(jī)、JSM.6490LV掃描電子顯微鏡、DZF-6020真空干燥箱、VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀。

1.2 方法

1.2.1 耐Cd菌株的分離與純化 取10 g采集的土樣加入到90 mL帶玻璃珠的無(wú)菌水中制成土壤懸液。采用10倍梯度稀釋法對(duì)土壤懸液進(jìn)行稀釋?zhuān)? mL稀釋度為10-6的菌懸液加入到含有100 mg/L Cd2+的固體LB培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)5 d，將獲得的單菌落采用平板劃線法進(jìn)行純化。

1.2.2 耐Cd菌株的鑒定

1.2.2.1 耐Cd菌株的形態(tài)觀察及生理生化特性分析 將所得單菌落接種于LB培養(yǎng)基內(nèi)，于35 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)，取1 mL稀釋度為10-6的菌液涂布平板，培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，并參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[9]進(jìn)行革蘭氏染色。細(xì)菌常規(guī)的生理生化鑒定試驗(yàn)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]進(jìn)行。

1.2.2.2 耐Cd菌株的16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 細(xì)菌總DNA利用DNA提取試劑盒提取。引物為16S rRNA通用引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：Taq聚合酶(5 U/μL) 1.0 μL、基因組DNA(20 ng/μL)1.0 μL、10×Buffer (含2.5 mmol/L Mg2+) 5.0 μL、dNTP(10 mmol/L)1.0 μL、27F 引物(10 μmol/L)和1492R 引物(10 μmol/L)各1.5 μL、ddH2O 39.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃10 min；94 ℃1 min、54 ℃1 min、72 ℃1.5 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min終止。PCR產(chǎn)物利用回收試劑盒純化后，交由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)得的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用軟件MEGA 6.0構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 耐Cd菌株吸附Cd2+條件的優(yōu)化

1.2.3.1 外源Cd2+質(zhì)量濃度 將處于對(duì)數(shù)期的耐Cd菌株接種到含有50 mL pH值為7.0以葡萄糖為碳源的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，Cd2+添加量分別為0、25、50、100、200 mg/L，在35 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)8 h，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600值，每個(gè)樣品3個(gè)平行，計(jì)算平均值，確定耐Cd菌株對(duì)Cd2+的耐受質(zhì)量濃度。

1.2.3.2 溫度 將處于對(duì)數(shù)期的耐Cd菌株接種于Cd2+質(zhì)量濃度為50 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(添加0.1%的葡萄糖作為碳源)中，于25、30、35、40、45 ℃條件下培養(yǎng)6 d，離心(10 000 r/min、15 min)后獲得上清，經(jīng)2%稀硝酸稀釋后測(cè)定Cd2+含量，考察溫度對(duì)耐Cd菌株吸附Cd2+性能的影響。

1.2.3.3 pH值 配制含Cd2+質(zhì)量濃度為50 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接種處于對(duì)數(shù)期的耐Cd菌株，于最適溫度培養(yǎng)6 d，離心(10 000 r/min、15 min)后獲得上清，經(jīng)2%稀硝酸稀釋后測(cè)定Cd2+含量，考察pH值對(duì)耐Cd菌株吸附Cd2+性能的影響。

1.2.4 Cd2+含量的測(cè)定 采用原子吸收光譜(AAS)測(cè)定Cd2+含量,AAS檢測(cè)條件：火焰類(lèi)型Air-C2H2、燃?xì)饬髁?.8 L/min、助燃?xì)饬髁?5 L/min、檢測(cè)波長(zhǎng)228.8 nm。

1.2.5 耐Cd菌株的掃描電鏡分析 將篩選獲得的耐Cd菌株分別接種于含有0(對(duì)照)、50、100、200 mg/L Cd2+的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(添加0.1%的葡萄糖作為碳源)中，于35 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)6 d，然后于4 ℃條件下160 r/min離心5 min，收集菌體。菌體于2.5%的戊二醛溶液中固定4 h ，固定后的菌體于0.1 mol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液中清洗3次，然后依次用30%、50%、70%、85%、95%的乙醇分別對(duì)菌體進(jìn)行脫水15 min，用100%乙醇脫水2次，每次20 min，最后乙酸異戊酯置換2次，每次20 min[11]。隨后將處理好的菌體轉(zhuǎn)移到潔凈錫箔紙上，置于真空干燥箱中干燥24 h，使菌體充分干燥，然后噴金、電鏡觀察。

1.2.6 耐Cd菌株的紅外吸收光譜分析 將在含有0(對(duì)照)、50、100、200 mg/L Cd2+的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(0.1%葡萄糖作為碳源)中培養(yǎng)6 d的耐Cd菌體離心(4 ℃條件下，160 r/min離心5 min)，收集菌體，然后于0.1 mol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液中洗滌，冷凍干燥后與KBr粉末充分混合均勻，研磨壓片后置于FTIR樣品倉(cāng)中進(jìn)行紅外吸收光譜分析[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐Cd菌株的形態(tài)特征及生理生化特性

從長(zhǎng)期受農(nóng)藥污染的土壤中分離獲得1株耐Cd細(xì)菌，命名為EM1。由圖1可知，該菌菌落呈白色、黏液狀，菌體表面較濕潤(rùn)，用接種環(huán)挑起時(shí)易拉成絲。革蘭氏染色結(jié)果(圖2)表明，菌株EM1為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞呈桿狀。菌株EM1的檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)及淀粉水解試驗(yàn)均為陽(yáng)性；吲哚試驗(yàn)及甲基紅試驗(yàn)均為陰性(表1)。

圖1 耐Cd菌株的菌落形態(tài)

圖2 耐Cd菌株的革蘭氏染色結(jié)果

試驗(yàn)名稱(chēng)結(jié)果試驗(yàn)名稱(chēng)結(jié)果檸檬酸鹽利用試驗(yàn)+吲哚試驗(yàn)-接觸酶試驗(yàn)+淀粉水解試驗(yàn)+V-P試驗(yàn)+甲基紅試驗(yàn)-

注：+代表陽(yáng)性，-代表陰性。

2.2 菌株EM1的16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)顯示，菌株EM1的16S rRNA基因片段約為1 500 bp。將PCR產(chǎn)物純化，測(cè)序后將獲得的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)，結(jié)果表明，菌株EM1與路德維希腸桿菌(EnterobacterludwigiiEN-119)的同源性達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特性鑒定EM1為路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)。

M：DL2000 DNA Marker； 1：PCR產(chǎn)物

圖4 菌株EM1菌株基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株EM1吸附Cd2+的最優(yōu)條件

微生物吸附重金屬的過(guò)程與菌體的生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)，菌體的正常生長(zhǎng)是高效富集重金屬離子的保證，而微生物的生長(zhǎng)會(huì)受到多種環(huán)境因素的影響。因此，研究不同環(huán)境因子對(duì)菌體吸附重金屬離子過(guò)程的影響，有利于優(yōu)化吸附條件，為環(huán)境中重金屬離子的治理提供一定的技術(shù)依據(jù)。

2.3.1 外源Cd2+質(zhì)量濃度 微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中受各種外界環(huán)境因素的影響，若培養(yǎng)條件適宜，則微生物能夠進(jìn)行正常的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，反之則生長(zhǎng)受到抑制甚至發(fā)生變異或死亡。由圖5可知，以葡萄糖為碳源不添加Cd2+時(shí)，菌體OD600為0.33，菌體生長(zhǎng)相對(duì)較好。當(dāng)加入25、50 mg/L Cd2+時(shí)，菌體OD600均為0.30，菌體仍可正常生長(zhǎng)。隨著重金屬Cd2+質(zhì)量濃度的不斷增加，菌體OD600逐漸減小，當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度分別為100、200 mg/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)受到明顯抑制，菌體OD600分別為0.02、0.01。這是由于重金屬Cd2+的毒性較大， 高質(zhì)量濃度的Cd2+產(chǎn)生的毒性抑制了菌株的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致OD600下降。以上結(jié)果表明，EM1可耐受200 mg/L的Cd2+，且對(duì)Cd2+的最適耐受質(zhì)量濃度為50 mg/L。

圖5 重金屬Cd2+質(zhì)量濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)量的影響

2.3.2 溫度 溫度在菌體吸附重金屬離子時(shí)起到很重要的作用，溫度會(huì)影響細(xì)胞壁的穩(wěn)定性及結(jié)合位點(diǎn)表面官能團(tuán)的電離，從而影響微生物吸附重金屬的過(guò)程。從圖6可以看出，隨著溫度升高，菌株EM1對(duì)重金屬Cd2+的吸附率呈先增加后降低的趨勢(shì)。在溫度為25 ℃時(shí)，菌株EM1對(duì)Cd2+的吸附率為32%；溫度為35 ℃時(shí)，菌株EM1對(duì)Cd2+的吸附率最大，為90%；隨著溫度的進(jìn)一步升高，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，吸附率則下降為30%。綜上，菌株對(duì)50 mg/L Cd2+吸附的最適溫度為35 ℃。

圖6 溫度對(duì)菌株EM1吸附Cd2+的影響

2.3.3 pH值 生物吸附能力取決于生物量的多少及菌體表面所帶電荷可與金屬離子位點(diǎn)結(jié)合的多少[13]，且微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中機(jī)體時(shí)刻發(fā)生著酶促反應(yīng)，只有在適宜的pH值范圍內(nèi)酶促反應(yīng)速率才能達(dá)到最高，高于或低于這個(gè)范圍微生物生長(zhǎng)都會(huì)被抑制。因此，pH值也是影響菌體吸附Cd2+的一個(gè)重要因素。由圖7可知，隨著pH值升高，菌株EM1對(duì)Cd2+的吸附率呈先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為6.0時(shí)，菌株EM1對(duì)Cd2+的吸附率最高，為92%。這是因?yàn)楫?dāng)溶液體系中pH值較低時(shí)，H+濃度較高，從而形成大量的H3O+占據(jù)著菌體表面大多數(shù)的金屬結(jié)合位點(diǎn)，抑制Cd2+與相關(guān)基團(tuán)的結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致吸附率降低。隨著pH值升高，當(dāng)pH值為6.0時(shí)，生物質(zhì)表面官能團(tuán)的離解度增加，靜電相互作用增強(qiáng)，生物質(zhì)表面的負(fù)電荷也隨之增多，因此促進(jìn)了對(duì)帶正電的Cd2+的富集，菌株EM1對(duì)Cd2+的吸附率最高。pH值進(jìn)一步升高，Cd2+的富集率降低，這可能是由于pH偏堿性時(shí)，Cd2+與溶液中的-OH形成沉淀，進(jìn)而導(dǎo)致Cd2+吸附率降低。綜上，菌株對(duì)50 mg/L Cd2+吸附的最適pH值為6.0。

圖7 pH值對(duì)菌株EM1吸附Cd2+的影響

2.4 菌株EM1吸附Cd2+前后的掃描電鏡分析

不同質(zhì)量濃度Cd2+脅迫條件下菌株EM1的電鏡掃描結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出，對(duì)照組(圖8a)細(xì)胞呈短棒狀，細(xì)胞長(zhǎng)約5 μm，寬約2 μm，菌體飽滿，表面光滑平整，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，個(gè)體形態(tài)明顯。對(duì)處理組(圖8b、c)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，隨著重金屬Cd2+質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞表面開(kāi)始有少量分泌物生成并伴隨著輕微的集聚現(xiàn)象；當(dāng)Cd2+質(zhì)量濃度進(jìn)一步增大時(shí)(圖8d)，菌體細(xì)胞嚴(yán)重皺縮變小并由短棒狀變?yōu)闄E球狀，同時(shí)菌體周邊生成大量白色霧狀的多聚物使細(xì)胞之間相互嵌合，集聚現(xiàn)象更加明顯。有研究表明，在重金屬離子脅迫條件下，菌體的形態(tài)及細(xì)胞膜的通透性會(huì)發(fā)生改變并分泌大量的胞外多聚物，這些多聚物可以為重金屬提供眾多的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而形成一道選擇性屏障阻止重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[14]。因此，菌體形態(tài)的變化及多聚物的分泌是對(duì)環(huán)境壓力產(chǎn)生的一種保護(hù)機(jī)制。

a.對(duì)照; b.50 mg/L Cd2+; c.100 mg/L Cd2+; d.200 mg/L Cd2+

2.5 菌株EM1吸附Cd2+前后的紅外吸收光譜分析

綜合分析發(fā)現(xiàn)，菌體對(duì)重金屬吸附前后的紅外光譜圖在吸光度上有較大的差異，而峰型則基本保持一致，并沒(méi)有明顯的新峰出現(xiàn)，表明吸附過(guò)程中Cd2+并未對(duì)菌體細(xì)胞壁造成破壞，這也進(jìn)一步證明，菌體對(duì)Cd2+的富集過(guò)程為表面吸附，且參與Cd2+吸附過(guò)程的只是菌體表面的一些活性基團(tuán)。當(dāng)菌體吸附的Cd2+質(zhì)量濃度增大時(shí)，3 422、2 927、2 962 cm-1處的譜峰均出現(xiàn)不同程度的寬化、增強(qiáng)并伴隨著向低波數(shù)的紅移現(xiàn)象，而1 651、1 540 cm-1處的酰胺帶，1 065 cm-1處多糖吸收帶的吸收峰則變得尖而窄，并同樣伴隨著吸光度增加的現(xiàn)象，這表明菌體表面主要含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及多糖類(lèi)物質(zhì)。綜上所述，羥基、N-H、C-H、酰胺基團(tuán)及多糖中的C-O-C是菌體表面吸附、螯合或絡(luò)合金屬離子的主要活性基團(tuán)。

a.對(duì)照; b:50 mg/L Cd2+; c.100 mg/L Cd2+; d.200 mg/L的Cd2+

3 結(jié)論與討論

本研究從長(zhǎng)期受農(nóng)藥污染的土壤中分離篩選到1株可耐受重金屬Cd的菌株。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性、16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該菌株為路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)，命名為EM1。研究表明，路德維希腸桿菌可用于去除廢水中的Cd2+[19]，且還具有解鉀、解磷的特性[20]，可作為生物肥料的備選菌株。因此，將其應(yīng)用于Cd2+污染環(huán)境的治理具有廣闊的前景。本研究結(jié)果表明，EM1最高可耐受200 mg/L的Cd2+，且菌株EM1對(duì)Cd2+的最適耐受質(zhì)量濃度為50 mg/L，吸附Cd2+的最適生長(zhǎng)溫度為35 ℃，最適pH值為6.0,在此條件下，其對(duì)Cd2+的吸附率最大，為92%。電鏡掃描結(jié)果顯示，菌體呈短棒狀，細(xì)胞長(zhǎng)約5 μm，寬約2 μm，Cd2+脅迫條件下菌體由短棒狀變?yōu)闄E球狀，同時(shí)菌體周邊生成大量白色霧狀的多聚物，并伴隨著集聚現(xiàn)象，表明Cd2+脅迫過(guò)程中菌體表面會(huì)形成大量的分泌物并參與 Cd2+的吸附過(guò)程。有研究表明，在微生物對(duì)重金屬離子的抗性機(jī)制中，菌體會(huì)產(chǎn)生胞外分泌物如多糖、酶等大分子有機(jī)物，參與重金屬的吸附并在細(xì)胞表面累積，以減少重金屬離子濃度起到解毒的作用，而這些物質(zhì)多是由染色體或質(zhì)粒編碼[21]，其中后者居多。紅外光譜分析結(jié)果顯示，菌體表面主要含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及多糖類(lèi)物質(zhì)，菌體吸附Cd2+前后紅外光譜圖的峰型基本保持一致，只是一些特征峰的吸收位置和強(qiáng)度發(fā)生了變化，說(shuō)明菌體對(duì)Cd2+的吸附過(guò)程中細(xì)胞成分及整體結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化，該過(guò)程為表面吸附過(guò)程，而參與菌體吸附、螯合或絡(luò)合金屬離子的主要活性基團(tuán)主要為細(xì)胞壁表面的羥基、N-H、C-H、多糖中的C-O-C及酰胺基團(tuán)。

微生物修復(fù)是消除環(huán)境中重金屬污染的有效手段，但實(shí)驗(yàn)室中篩選出的高效富集菌株直接應(yīng)用于環(huán)境污染修復(fù)難度相對(duì)較大，主要是因?yàn)榧?xì)菌應(yīng)用于重金屬的富集時(shí)受多種因素的影響。為此，本研究對(duì)菌株EM1的吸附特性進(jìn)行研究，以期為Cd2+污染環(huán)境的治理與修復(fù)提供必要的基礎(chǔ)資料。

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Isolation,Identification and Adsorption Characteristics of a Cd-tolerant Bacterium

XU Shuxia,DU Wentao,WANG Xiaoya,ZHANG Jiran,ZHANG Shimin,WU Kun*

(College of Life Sciences,Henan Agricultural University/Key Laboratory of Agricultural Microbial Enzyme Engineering of Ministry of Agriculture,Zhengzhou 450002,China)

A Cd-tolerant strain was isolated from the pesticide polluted soil,on the basis of morphological observation,physiological and biochemical characteristics,16S rRNA gene sequence and phylogenetic analysis,the strain was identified asEnterobacterludwigii,and named as EM1,so as to provide strain for remediation of Cd polluted water and soil.The optimal Cd2+concentration of strain EM1 against Cd2+was 50 mg/L,the optimum growth temperature of strain EM1 against Cd2+was 35 ℃,and the optimum pH value of strain EM1 against Cd2+was about 6.0.Under this condition,the Cd2+adsorption rate of EM1 was the highest,reached 92%.The SEM results showed that in the process of adsorption of Cd2+,the morphology of the strains was changed,and a large number of extracellular polymeric substances were secreted on the strain surface.Infrared scanning analysis showed that under the Cd2+stress condition,the cell walls structure had not changed,and hydroxy,N-H,C-H,C-O-C and aminoacyl were confirmed to be the key functional groups for the strain to adsorb Cd2+.

Cd-tolerant bacterium;Enterobacterludwigii; bioadsorption; electron microscopic observation; infrared spectroscopy analysis

2017-02-20

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(152102110054)； 河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15A180005)

徐淑霞(1971-)，女，河南靈寶人，副教授，博士，主要從事環(huán)境污染物的微生物轉(zhuǎn)化和修復(fù)研究。 E-mail：xushuxia97@163.com

*通訊作者：吳 坤(1963-)，男，河南平輿人，教授，博士，主要從事環(huán)境污染物的微生物降解研究。 E-mail：wukun63@126.com

X172;X53

A

1004-3268(2017)05-0071-07