清氣涼營(yíng)顆粒抗流感病毒藥效學(xué)研究和分子機(jī)制分析

王 旭，余蘇云，沈培亮，汪思亮，韋忠紅，劉兆國(guó)，王愛(ài)云,3，陳文星,3，陸 茵,3

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2. 江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；3. 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

◇復(fù)方藥物藥理學(xué)◇

清氣涼營(yíng)顆?？沽鞲胁《舅幮W(xué)研究和分子機(jī)制分析

王 旭1,2，余蘇云1,2，沈培亮1,2，汪思亮1,2，韋忠紅1,2，劉兆國(guó)1,2，王愛(ài)云1,2,3，陳文星1,2,3，陸 茵1,2,3

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2. 江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；3. 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

目的 探討清氣涼營(yíng)顆?？沽鞲胁《舅幮W(xué)研究和分子機(jī)制分析。方法 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證清氣涼營(yíng)顆粒抗甲型流感藥效，同時(shí)利用活性成分篩選、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)手段，確定清氣涼營(yíng)顆粒治療流感的特異性靶點(diǎn)，并進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，探討其治療流感的分子機(jī)制。結(jié)果 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示清氣涼營(yíng)顆粒具有抗甲型流感的作用，而其抗流感的分子機(jī)制主要參與了Wnt信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)菌侵襲性上皮細(xì)胞信號(hào)通路，同時(shí)也影響了致病性大腸桿菌感染信號(hào)通路、軍團(tuán)桿菌病信號(hào)通路和甲型流感信號(hào)等通路。結(jié)論 清氣涼營(yíng)顆粒主要從抑制細(xì)菌感染、抗病毒感染和抑制病毒復(fù)制3個(gè)方面抑制流感。

清氣涼營(yíng)顆粒；中藥復(fù)方；流感；系統(tǒng)藥理學(xué)；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子機(jī)制

流感是常見(jiàn)的急性呼吸道感染疾病，主要病原體為流感病毒，屬于正粘病毒科的含包膜的RNA病毒。由于其基因突變性較高，人體對(duì)新病毒株缺乏免疫性, 每年爆發(fā)的流感病毒會(huì)造成2～4萬(wàn)人死亡，給社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]?，F(xiàn)有的預(yù)防和治療流感的藥物主要包括生物疫苗、神經(jīng)氨酸酶抑制劑(oseltamivir和zanamivir)、M2離子通道抑制劑(金剛烷胺類(lèi))等，但由于流感病毒高抗原漂移性，這些針對(duì)單靶點(diǎn)的抗流感藥物都面臨著耐藥性和滯后性的問(wèn)題[2]。而中藥及其復(fù)方具有抑制病毒復(fù)制、阻止病毒致細(xì)胞病變、調(diào)節(jié)免疫功能、改善肺循環(huán)、鎮(zhèn)痛抗炎等綜合功效，在治療流感的同時(shí)可以有效地控制流感并發(fā)癥。因此，中藥復(fù)方在防治流感方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和廣闊發(fā)展前景[3-6]。

清氣涼營(yíng)顆粒在國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授“病理中心在氣營(yíng)”及“到氣就可氣營(yíng)兩清”的理論基礎(chǔ)上，由清氣涼營(yíng)注射液工藝優(yōu)化開(kāi)發(fā)而來(lái)，由大青葉、金銀花、大黃、知母、淡竹葉、野菊花等組成，具有清氣泄熱、涼營(yíng)解毒的功效[7]。臨床研究證實(shí)，清氣涼營(yíng)注射液對(duì)于流感具有較好療效，能夠明顯改善流感并發(fā)癥狀[8]，而優(yōu)化的清氣涼營(yíng)顆?？沽鞲凶饔秒m有較為充足的臨床使用經(jīng)驗(yàn)，但缺乏藥效學(xué)研究，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制至今尚不明確。因此，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證清氣涼營(yíng)顆?？共《镜乃幮В治銮鍤鉀鰻I(yíng)顆粒起效的活性成分和作用靶點(diǎn)，分析其可能的作用機(jī)制，對(duì)于闡述清氣涼營(yíng)顆粒的科學(xué)內(nèi)涵，促進(jìn)其臨床推廣應(yīng)用具有重要意義。對(duì)于中藥復(fù)方研究，目前已有的研究手段存在檢測(cè)靈敏度低、缺乏可靠評(píng)價(jià)指標(biāo)等問(wèn)題，難以科學(xué)、全面闡釋中藥復(fù)方的作用機(jī)制。

系統(tǒng)藥理學(xué)提供了整套基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，從系統(tǒng)水平研究中藥復(fù)方潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的研究策略。本文利用口服生物利用度、藥物相似性對(duì)清氣涼營(yíng)顆粒中所有已報(bào)道的成分進(jìn)行篩選，預(yù)測(cè)可能入血的活性成分，同時(shí)利用化合物相似性等特征預(yù)測(cè)其分子靶標(biāo)[9-10]。結(jié)合生物信息學(xué)芯片分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的手段，進(jìn)一步預(yù)測(cè)清氣涼營(yíng)顆粒治療流感的作用靶點(diǎn)，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，探討其可能的作用機(jī)制。流程圖見(jiàn)Fig 1。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 清氣涼營(yíng)顆粒：清氣涼營(yíng)浸膏，由江蘇蘇中藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，批號(hào)：20110602，每克浸膏折合生藥量3.572 g。以下均以生藥量計(jì)。雙黃連顆粒：哈藥集團(tuán)中藥二廠(chǎng)，批號(hào)：101106；利巴韋林顆粒：四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：100702。

Fig 1 The molecular mechanism analysis flow chart of QingQiLiangYing granule in treatment of influenza

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用病毒 甲型流感病毒A/PR8/34(H1N1)：由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2008-0010。實(shí)驗(yàn)用全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，由江蘇協(xié)同醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司提供。ICR小鼠隨機(jī)分組，分籠飼養(yǎng)，喂飼全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料，自由飲水，室溫(22±2)℃，濕度55%～65%。

1.1.4 儀器與試劑 FA1004電子天平：上海精科天平廠(chǎng)；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng)；孵箱：上海分析儀器廠(chǎng)；乙醚：上海中試化工總公司，批號(hào)：20100425。

1.2 方法

1.2.1 清氣涼營(yíng)顆粒對(duì)甲型流感病毒A/PR8/34感染小鼠死亡的影響 取ICR小鼠140只，體質(zhì)量13～16 g，♀♂各半，隨機(jī)分7組，每組20只。正常組給予等容積生理鹽水(normal saline，NS)；模型組給予等容積NS；雙黃連顆粒組給予雙黃連顆粒23.4 g·kg-1；利巴韋林組給予利巴韋林0.1 g·kg-1；清氣涼營(yíng)顆粒低、中、高劑量組分別給予清氣涼營(yíng)顆粒10.53、31.59、 63.18 g·kg-1。給藥體積10 mL·kg-1。以上各組按上述劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。于給藥當(dāng)日，各組小鼠(除正常組)在乙醚淺麻醉下，以甲型流感病毒尿囊液給小鼠滴鼻感染。每鼠100 μL，觀(guān)察動(dòng)物感染后發(fā)病及死亡情況，記錄14 d內(nèi)死亡數(shù)。

1.2.2 清氣涼營(yíng)顆粒對(duì)甲型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響 取ICR小鼠70只，體質(zhì)量13～16 g，♀♂各半，隨機(jī)分7組，每組10只。正常組給予等容積NS；模型組給予等容積NS；雙黃連顆粒組給予雙黃連顆粒23.4 g·kg-1；利巴韋林組給予利巴韋林0.1 g·kg-1；清氣涼營(yíng)顆粒低、中、高劑量組分別給予清氣涼營(yíng)顆粒10.53、31.59、63.18 g·kg-1。給藥體積10 mL·kg-1。以上各組按上述劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。于給藥d 1各組小鼠(除正常組)在乙醚淺麻醉下，以甲型流感病毒尿囊液滴鼻感染小鼠，每鼠100 μL。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水，連續(xù)給藥7 d后，d 8各組小鼠稱(chēng)重，脫頸處死，解剖，觀(guān)察肺部病變，取全肺稱(chēng)重，計(jì)算各鼠肺指數(shù)值，比較各組間差異，并取肺用10%甲醛固定，做病理組織學(xué)檢查。

1.2.3 清氣涼營(yíng)顆粒中活性成分的篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)檢索中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)TCMSP，構(gòu)建清氣涼營(yíng)顆粒所有成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。TCMSP是國(guó)內(nèi)較為全面的中藥成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，包含了藥典收錄的505味中藥，12 144個(gè)已有報(bào)道的中藥成分，每個(gè)成分含有詳細(xì)的ADME參數(shù)，包括口服吸收利用度(oral bioavailability，OB)、藥物相似性(drug-likeness，DL)、Caco-2細(xì)胞滲透性、半衰期、血腦屏障、脂水分布系數(shù)等。根據(jù)前期研究結(jié)果，推薦的篩選條件為OB≥30%，DL≥0.18，將獲取的活性成分與文獻(xiàn)比對(duì)，同時(shí)利用TCMSP靶點(diǎn)預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)活性成分作用靶點(diǎn)[11]。

1.2.4 清氣涼營(yíng)顆?！盎钚猿煞?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建 將從TCMSP獲取的成分、靶點(diǎn)關(guān)系導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.2.1，構(gòu)建清氣涼營(yíng)顆?！盎钚猿煞?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”，其中分子、靶蛋白用“節(jié)點(diǎn)”(node)表示, 成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系用“邊”(edge)表示。完成網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建后，進(jìn)一步利用Cytoscape軟件中的 network analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)特征，分析清氣涼營(yíng)顆粒中較為重要的成分和靶點(diǎn)。并通過(guò)文獻(xiàn)查閱，分析節(jié)點(diǎn)作用。

1.2.5 GEO芯片數(shù)據(jù)分析流感相關(guān)靶點(diǎn) 從Gene Expression Omnibus數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載編號(hào)為：GSE17156的芯片數(shù)據(jù)原始文件，該芯片數(shù)據(jù)的原始文件包含了113個(gè)人的血液樣本，3種不同的感染方式(鼻病毒、呼吸道合胞病毒和N3H2亞型豬流感病毒)感染人體，通過(guò)檢測(cè)感染前和感染后癥狀最嚴(yán)重時(shí)患者的血樣，并進(jìn)行了基因測(cè)序。筆者通過(guò)下載其原始文件，對(duì)其進(jìn)行二次分析，利用robust multiarray average(RMA)算法對(duì)原始文件進(jìn)行背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理，利用limma包對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算P值(Pvalue)和差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)，顯著差異基因的篩選條件為：Pvalue<0.01，F(xiàn)C>1.5[12]。

1.2.6 已知的流感相關(guān)疾病靶點(diǎn)檢索 利用“influenza”作為關(guān)鍵詞，檢索已知的疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。包括：① TTD(http://database.idrb.cqu.edu.cn/TTD/)；② DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù) (http://www.drugbank.ca/)；③ OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org/)；④ GAD (http:// geneticassociationdb.nih.gov/)；⑤ PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/index.jsp)。檢索的靶點(diǎn)刪除重復(fù)，獲得流感發(fā)病過(guò)程已知的靶點(diǎn)。

1.2.7 蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將清氣涼營(yíng)顆粒作用靶點(diǎn)和流感相關(guān)的疾病靶點(diǎn)分別映射到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中，利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)繪制插件BisoGenet繪制2個(gè)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)[13]。BisoGenet包含了6種蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)：Biological General Repository for Interaction Datasets(BioGRID),Biomolecular Interaction Network Database(BIND),Molecular Interaction Database(MINT),Human Protein Reference Database(HPRD), Database of Interacting Proteins(DIP)和Biological General Repository for Interaction Datasets(GRID)。再利用cytoscape將2個(gè)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)合并，抽取交集網(wǎng)絡(luò)。而這個(gè)交集網(wǎng)絡(luò)則是清氣涼營(yíng)顆粒治療流感的直接和間接靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA，借助自由度、中心中介性、特征向量中心性、緊密度、網(wǎng)絡(luò)中心性和局部邊連通性等指標(biāo)篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[14-15]。根據(jù)前期文獻(xiàn)研究，首先篩選出自由度大于所有節(jié)點(diǎn)自由度中位數(shù)2倍的節(jié)點(diǎn)，將這些節(jié)點(diǎn)定義為“Big hubs”。然后，再篩選其他幾個(gè)指標(biāo)大于所有節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，即為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(關(guān)鍵基因)。清氣涼營(yíng)顆粒則有可能是直接、間接調(diào)控這些節(jié)點(diǎn)，發(fā)揮抗流感的作用。

1.2.8 Pathway富集分析 本文使用了較為新穎的ClueGO分析插件，并利用信號(hào)通路富集分析功能。ClueGO插件具有形象的圖像化功能，能夠?qū)⒏患治龅慕Y(jié)果以節(jié)點(diǎn)的形式展現(xiàn)，同一種顏色的節(jié)點(diǎn)代表同一類(lèi)型的信號(hào)通路，而節(jié)點(diǎn)的大小則代表了該信號(hào)通路的顯著性，節(jié)點(diǎn)越大即信號(hào)通路的顯著性越高，該通路的重要性越高[16]。本文利用ClueGO對(duì)清氣涼營(yíng)顆粒治療流感的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，并根據(jù)重要程度繪制信號(hào)通路占比餅狀圖。

2 結(jié)果

2.1 清氣涼營(yíng)顆粒體內(nèi)抗甲型流感病毒藥效學(xué)研究

2.1.1 清氣涼營(yíng)顆粒對(duì)甲型流感病毒A/PR8/34感染小鼠死亡的影響 10.53、31.59、63.18 g·kg-1清氣涼營(yíng)顆粒對(duì)甲型流感病毒(H1N1)感染小鼠有明顯的保護(hù)作用，可明顯延長(zhǎng)甲型流感病毒(H1N1)感染后小鼠的存活天數(shù)，與模型組比較差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)Tab 1。

2.1.2 清氣涼營(yíng)顆粒對(duì)甲型流感病毒感染小鼠肺指數(shù)的影響 清氣涼營(yíng)顆粒高、中劑量組均可明顯降低甲型流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)值，與模型組比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)Tab 2。Fig 2病理結(jié)果顯示，成功復(fù)制了甲型流感病毒感染小鼠肺部炎性病變。主要表現(xiàn)為化膿性支氣管炎、支氣管肺炎、間質(zhì)性肺炎，部分伴有明顯的肺出血。與模型組相比，各藥物均有減輕肺組織病變的趨勢(shì)，但支氣管炎病變改善不明顯?？辜仔土鞲胁《拘Ч岳晚f林組、清氣涼營(yíng)顆粒高劑量組效果為明顯。

以上結(jié)果提示清氣涼營(yíng)顆粒能夠提高受感染小鼠的存活率和存活天數(shù)。同時(shí)也能夠降低小鼠的肺指數(shù)，改善病理形態(tài)，提示清氣涼營(yíng)顆粒具有較好的抗甲型流感作用。

GroupDose/g·kg-1NumberofanimalsNumberofdeathsSurvivalrate/%Survivaldays/dVehicle-20010014．0±0．0Model-2018107．5±2．8##ShuangHuangLian23．4201050?10．7±3．6??Ribavirin0．1020195??13．7±1．6??QingQiLiangYing10．53201145?10．0±3．9?31．5920860??11．0±3．9??63．18201050?10．4±4．1?

##P<0.01vscontrol；*P<0.05，**P<0.01vsmodel

Fig 2 Pathological changes of lung tissue in mice infected with influenza A virus(HE×100)

A:Vehicle;B:Model;C:Model;D:Ribavirin 0.1 g·kg-1;E:ShuangHuangLian 23.4 g·kg-1;F:QingQiLiangYing 10.53 g·kg-1;G:QingQiLiangYing 31.59 g·kg-1;H:QingQiLiangYing 63.18 g·kg-1

GroupDose/g·kg-1Weight/gLungweight/gLungindex/g/10gVehicle-17．57±1．920．15±0．030．83±0．16Model-12．66±1．18##0．20±0．06##1．62±0．45##ShuangHuangLian23．414．74±2．49?0．15±0．04?1．05±0．34??Ribavirin0．1014．46±1．27??0．14±0．02??0．97±0．17??QingQiLiangYing10．5315．00±2．10??0．19±0．031．30±0．3131．5915．15±1．59??0．17±0．051．15±0．34?63．1815．07±1．17??0．16±0．02?1．08±0．18??

##P<0.01vscontrol；*P<0.05，**P<0.01vsmodel

2.2 清氣涼營(yíng)顆?；钚猿煞趾Y選與ADME分析 檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，搜集清氣涼營(yíng)顆粒中6味中藥中所有的已報(bào)道的成分及其ADME參數(shù)，共搜集到485個(gè)成分，其中大青葉45個(gè)，金銀花225個(gè)，大黃92個(gè)，知母81個(gè)，淡竹葉12個(gè)，野菊花30個(gè)。根據(jù)口服吸收利用度(OB)和藥物相似性(DL)篩選清氣涼營(yíng)顆粒中入血的活性成分，共搜集到入血成分71個(gè)(Fig 3A)。清氣涼營(yíng)顆粒各味中藥中符合口服吸收利用度和藥物相似性成分比例圖，見(jiàn)Fig 3B。此外，有8個(gè)成分雖然不符合篩選參數(shù)，但文獻(xiàn)報(bào)道有較好的抗流感活性，同時(shí)也納入作為清氣涼營(yíng)顆粒的活性成分，因此，根據(jù)ADME參數(shù)篩選和文獻(xiàn)確證最終篩選得到79個(gè)活性成分。同時(shí)，利用系統(tǒng)藥理學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)技術(shù)，預(yù)測(cè)活性成分作用靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，共獲得246個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

Fig 3 ADME parameters distribution of active ingredients in QingQiLiangYing granule

A:Components that meet the criteria for screening in QingQiLiangYing granule;B:Component ratio in accordance with the screening conditions in each herb in QingQiLiangYing granule

2.3 清氣涼營(yíng)顆粒“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建和分析 利用網(wǎng)絡(luò)圖形化工具Cytoscape繪制潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，尋找網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，確定清氣涼營(yíng)顆粒中發(fā)揮重要作用的成分和靶點(diǎn)。如Fig 4所示，通過(guò)cytoscape構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)共有325個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 257個(gè)關(guān)系。進(jìn)一步分析“成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”發(fā)現(xiàn)，有效成分槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚和木犀草素能作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)靶點(diǎn)，而PTGS2、CDK2、CA2等靶點(diǎn)，也能與多個(gè)成分作用。前期研究表明，槲皮素、山奈酚能夠預(yù)防和治療流感[17]；而β-谷甾醇具有消炎、鎮(zhèn)痛等功效，能夠緩解流感發(fā)生過(guò)程中發(fā)熱、頭痛等并發(fā)癥[18]；木犀草素在體內(nèi)、外均有較好的抗流感作用，尤其是抗流感病毒H1N1效果較好[19-20]。而網(wǎng)絡(luò)中重要的靶點(diǎn)PTGS2是流感發(fā)生過(guò)程中誘導(dǎo)干擾素γ1產(chǎn)生的關(guān)鍵因子，能夠協(xié)同其他抗病毒因子發(fā)揮抗流感作用[21]?！俺煞?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”分析顯示，清氣涼營(yíng)顆粒的有效成分之間存在協(xié)同，而協(xié)同調(diào)控的靶點(diǎn)也在流感的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同作用，具有治療流感的潛力。

2.4 流感相關(guān)基因分析和檢索

2.4.1 流感相關(guān)差異表達(dá)基因分析 通過(guò)對(duì)基因芯片進(jìn)行分析，獲取不同感染方式感染后明顯影響和改變的基因，進(jìn)一步分析清氣涼營(yíng)顆粒的作用靶點(diǎn)是否與這些明顯改變的基因相關(guān)。通過(guò)對(duì)GEO芯片數(shù)據(jù)庫(kù)的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行二次挖掘分析，共找出107個(gè)變化最為明顯的基因，而這些基因則可能與流感及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。差異表達(dá)基因熱圖見(jiàn)Fig 5。

2.4.2 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索已有流感相關(guān)靶點(diǎn) 尋找已知的流感相關(guān)靶點(diǎn)基因，還可以通過(guò)檢索疾病相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。本文檢索了5個(gè)國(guó)際公認(rèn)的疾病基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，搜集前期已經(jīng)有大量研究和報(bào)道的與流感發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的靶點(diǎn)基因。TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB分別檢索到35、3、88、9、1個(gè)靶點(diǎn)。去除重復(fù)靶點(diǎn)，共檢索到106個(gè)已知的流感發(fā)病過(guò)程中相關(guān)的靶點(diǎn)。共檢索到101個(gè)流感相關(guān)的疾病靶點(diǎn)基因。

2.5 清氣涼營(yíng)顆粒治療流感的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

2.5.1 清氣涼營(yíng)顆粒治療流感的蛋白相互作用 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建機(jī)體的內(nèi)在調(diào)控是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而非單一的信號(hào)通路，不同的信號(hào)通路和靶點(diǎn)之間會(huì)存在信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因而藥物的治療作用也不僅僅是成分靶點(diǎn)的直接結(jié)合，更為常見(jiàn)的調(diào)控方式是直接調(diào)控靶點(diǎn)，同時(shí)間接調(diào)控其他靶點(diǎn)。而蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)為認(rèn)識(shí)靶點(diǎn)的直接、間接調(diào)控作用提供了可能。通過(guò)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)清氣涼營(yíng)顆?？梢灾苯踊蜷g接與7 240個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生作用，而這些靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的聯(lián)系多達(dá)133 765種。同樣，對(duì)流感相關(guān)的靶點(diǎn)繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，也發(fā)現(xiàn)與流感直接或者間接相關(guān)的靶點(diǎn)多達(dá)2 701個(gè)。利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，我們可以深入分析清氣涼營(yíng)顆粒影響流感發(fā)生發(fā)展中的靶點(diǎn)，繪制蛋白質(zhì)相互作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)分析和機(jī)制探討提供了可能。

2.5.2 清氣涼營(yíng)顆粒治療流感的關(guān)鍵 靶點(diǎn)篩選通過(guò)對(duì)清氣涼營(yíng)顆粒調(diào)控流感的蛋白質(zhì)相互作用交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，利用網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵傩裕瑢ふ揖W(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)理論，這些節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中能夠傳遞更多的信息，信息傳遞效率更高，單一節(jié)點(diǎn)能夠影響的節(jié)點(diǎn)更多，因而也在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著更加重要的作用。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，筆者共發(fā)現(xiàn)了113個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。篩選策略示意圖見(jiàn)Fig 6。

2.6 清氣涼營(yíng)顆粒治療流感的機(jī)制分析 利用ClueGO對(duì)113個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，分析他們參與的主要信號(hào)通路，研究清氣涼營(yíng)顆粒治療流感可能的作用機(jī)制。分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)涉及的信號(hào)通路主要與以下三類(lèi)信號(hào)通路相關(guān)，見(jiàn)Fig 7。

Fig 4 Compound-target network of QingQiLiangYing granule

Fig 5 Different expression genes of influenza virus infection

Blue ribbon represented blood samples before infection; brown bands represented the blood sample after infection

2.6.1 細(xì)菌感染相關(guān)信號(hào) 通路細(xì)菌感染是流感發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的并發(fā)癥之一，而細(xì)菌感染相關(guān)的信號(hào)通路也是最為主要的信號(hào)通路，主要富集在細(xì)菌侵襲性上皮細(xì)胞信號(hào)通路、致病性大腸桿菌感染信號(hào)通路和軍團(tuán)桿菌病信號(hào)通路幾種信號(hào)通路。細(xì)菌感染時(shí)，黏附于細(xì)胞上，除少數(shù)定植的細(xì)菌在表面引起局部感染外，大部分細(xì)菌還會(huì)侵入細(xì)胞內(nèi)，并擴(kuò)散到其他的細(xì)胞、組織或全身而引起侵襲性感染[22]；腹瀉是流感的重要并發(fā)癥之一，致病性大腸桿菌在腹瀉的發(fā)生中扮演了重要角色[23]；軍團(tuán)菌感染則是流感并發(fā)癥細(xì)菌感染所致肺炎的重要因素之一[24]。以上結(jié)果提示，清氣涼營(yíng)顆粒治療流感的機(jī)制之一是緩解流感發(fā)生過(guò)程中細(xì)菌感染相關(guān)并發(fā)癥及其信號(hào)通路。

2.6.2 病毒感染相關(guān)信號(hào) 通路病毒感染是流感發(fā)生的直接誘因，病毒感染相關(guān)的信號(hào)通路主要富集在Influenza A(甲型流感信號(hào)通路)和Herpes simplex infection(單純皰疹感染信號(hào)通路)，這2種病毒感染中尤其以甲型流感感染更為常見(jiàn)。甲型流感是一種急性傳染病，病毒基因變異后能夠感染人類(lèi)，感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高[25]。而單純皰疹病毒一般經(jīng)呼吸道、生殖器黏膜以及破損皮膚進(jìn)入體內(nèi)，潛居于人體正常黏膜、血液、唾液及感覺(jué)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)高熱、咽痛、潰瘍等癥狀[26]。這提示清氣涼營(yíng)顆?？梢灾苯右种萍仔土鞲胁《拘盘?hào)通路，并且其作用靶點(diǎn)還具有抑制單純皰疹病毒感染的潛力。

Fig 6 Target screening strategy for key nodes in QingQiLiangYing granule

A:The core protein-protein network of QingQiLiangYing granule and influenza; B: Big hubs; C:The key node of QingQiLiangYing granule in the treatment of influenza

Fig 7 Results of signal pathway analysis of QingQiLiangYing granule in treatment of influenza

2.6.3 病毒復(fù)制 相關(guān)信號(hào)通路病毒不具有能獨(dú)立進(jìn)行代謝的酶系統(tǒng)，因此只有進(jìn)入活的易感宿主細(xì)胞內(nèi)，由宿主細(xì)胞提供合成病毒核酸與蛋白質(zhì)的原料，如低分子量前體成分、能量、必要的酶等，病毒才能增殖。病毒增殖的方式不是二分裂，而是自我復(fù)制[27]。清氣涼營(yíng)顆粒作用靶點(diǎn)富集分析結(jié)果顯示，病毒復(fù)制也是其重要的調(diào)控信號(hào)通路之一。尤其是Wnt信號(hào)通路，除了在流感發(fā)生過(guò)程中機(jī)體發(fā)熱和炎癥的過(guò)程中產(chǎn)生影響，研究表明其與流感病毒的復(fù)制密切相關(guān)[28-29]。

3 討論

近年來(lái)，新型流行性感冒不斷爆發(fā)，抗流感病毒藥物的研發(fā)難度不斷增加。許多中藥和中藥復(fù)方也被證實(shí)具有抗流感病毒的作用。清氣涼營(yíng)顆粒則是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，結(jié)合國(guó)醫(yī)大師多年臨床實(shí)踐開(kāi)發(fā)出的驗(yàn)方，具有較好的臨床療效。實(shí)驗(yàn)室前期的藥效學(xué)研究也證明，清氣涼營(yíng)顆粒在體內(nèi)具有較好的抗甲型流感作用。筆者利用系統(tǒng)藥理學(xué)分析手段，篩選了清氣涼營(yíng)顆粒的入血成分，并預(yù)測(cè)了其可能的直接作用靶點(diǎn)。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)相互功能網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，確定了清氣涼營(yíng)顆粒治療流感的直接和間接調(diào)控靶點(diǎn)[30]，并以此為基礎(chǔ)分析及可能的作用機(jī)制。從筆者分析的結(jié)果來(lái)看，清氣涼營(yíng)顆粒主要機(jī)制是直接抑制流感病毒和間接改善流感相關(guān)并發(fā)癥。例如調(diào)控Wnt信號(hào)通路抑制病毒復(fù)制，直接調(diào)控甲型流感相關(guān)信號(hào)通路；同時(shí)，抑制細(xì)菌感染，緩解流感發(fā)病過(guò)程中細(xì)菌感染相關(guān)的并發(fā)癥。例如，細(xì)菌侵襲表皮細(xì)胞或者全身組織引起的侵襲性感染，軍團(tuán)菌誘發(fā)的肺炎，致病性大腸桿菌誘發(fā)的腹瀉等。

后續(xù)研究可以此分析為基礎(chǔ)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和機(jī)制探討，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)。使實(shí)驗(yàn)研究更加合理，更加具有指導(dǎo)性。同時(shí)，本文也為中藥復(fù)方機(jī)制的研究提供了思路和方法，尤其是中藥復(fù)方針對(duì)某種特定疾病的機(jī)制分析。

(致謝:本文主要在江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，衷心感謝南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥理室朱萱萱教授課題組對(duì)抗病毒實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和協(xié)助。)

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Analysis of anti-influenza virus pharmacodynamics of QingQiLiangYing granule and its molecular mechanism

WANG Xu1,2,YU Su-yun1,2, SHEN Pei-liang1,2, WANG Si-liang1,2, WEI Zhong-hong1,2, LIU Zhao-guo1,2, WANG Ai-yun1,2,3,CHEN Wen-xing1,2,3, LU Yin1,2,3
(1.SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China;2.JiangsuKeyLaboratoryforPharmacologyandSafetyEvaluationofChineseMateriaMedicine,Nanjing210023,China; 3.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofTraditionalChineseMedicinePreventionandTreatmentofTumor,Nanjing210023,China)

Aim To analyse the anti-influenza virus pharmacodynamics of QingQiLiangYing ganule and explore the possible mechanism in the treatment of influenza.Methods The anti-influenza effect of QingQiLiangYing granule was confirmed byinvivoexperiment. Unique targets regulated by QingQiLiangYing granule were predicted using the systematic pharmacology and bioinformatics technology. Further pathway enrichment analysis was performed to research the potential mechanism of QingQiLiangYing curing influenza.Results Theinvivoexperiment showed that QingQiLiangYing granule had the anti-influenza effect and its molecular mechanism of anti-influenza was mainly involved in Wnt signaling pathway, regulation of bacterial invasion of epithelial cells, thus affecting the pathogenicEscherichiacoliinfection, Legionella disease and influenza A disease processes.Conclusion QingQiLiangYing granule inhibits influenza mainly from three aspects:anti-bacterial infection, anti-viral infection and inhibition of virus replication.

QingQiLiangYing granule；Chinese herbal compound；influenza；systematic pharmacology；network pharmacology；molecular mechanism

2017-01-18,

2017-02-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81673725, 81573859,81673648,81403260)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(No 2014M 551639)；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No BK2012 854)；江蘇省博士后資助項(xiàng)目(No 1401138C)；2013年江蘇高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃；江蘇高校品牌專(zhuān)業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目(No PPZY2015A070)；江蘇高校中藥學(xué)優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)

王 旭(1992-)，男，碩士生，研究方向：中藥復(fù)方藥理機(jī)制，E-mail: wxtcm1992@foxmail.com; 陸 茵(1965-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，Tel: 025-85811239, E-mail: luyingreen@126.com

時(shí)間：2017-4-24 11:21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1121.050.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.025

A

1001-1978(2017)05-0719-10

R282.71；R283.6；R373.13；R978.7