孕期LPS刺激對子代6周齡大鼠血管結(jié)構(gòu)的影響

趙釤妤,劉 雅,李曉輝

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物研究所，重慶 400038；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，云南 大理 671000)

孕期LPS刺激對子代6周齡大鼠血管結(jié)構(gòu)的影響

趙釤妤1,2,劉 雅1,李曉輝1

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物研究所，重慶 400038；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，云南 大理 671000)

目的 研究孕期炎癥刺激劑脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)刺激對子代大鼠6周齡時血管結(jié)構(gòu)的影響。方法 12只Sprague dawley(SD)孕鼠隨機(jī)分為3組：對照組(control，Con)、LPS刺激組、LPS刺激加二硫代氨基四氫呋喃(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)干預(yù)組(L+P)，分別在孕8～14 d腹腔注射生理鹽水、LPS(0.79 mg·kg-1)或LPS加PDTC(100 mg·kg-1)，LPS于孕d 8、10、12給藥；生理鹽水及PDTC于d 8～14每天給藥。子代出生6周測體質(zhì)量；透射電鏡觀察血管超微結(jié)構(gòu)；實(shí)時熒光定量PCR檢測仔鼠胸主動脈連接蛋白(connexin，Cx)Cx37、Cx40、Cx43、Cx45的mRNA表達(dá)水平；Western blot和免疫熒光檢測仔鼠胸主動脈Cx37、Cx40、Cx43、Cx45的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與Con組相比，LPS組子代大鼠在6周時♂♀體質(zhì)量均明顯增加(P<0.01)；L+P組♂鼠明顯低于LPS組(P<0.05)，而♀鼠差異無顯著性。LPS組內(nèi)皮受損，內(nèi)皮細(xì)胞間可見明顯縫隙連接(gap junction，GJ)，相對于Con組較長且多見；L+P組內(nèi)皮損傷程度較LPS組稍有改善。LPS組Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯低于Con組(P<0.05)，L+P組則明顯高于LPS組(P<0.05)；Cx37、Cx40和Cx45各組間mRNA及蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LPS組Cx43熒光強(qiáng)度及熒光點(diǎn)數(shù)明顯比Con組降低，而L+P組明顯比LPS組高，各組間Cx37、Cx40和Cx45熒光強(qiáng)度和熒光點(diǎn)數(shù)并無明顯差異。結(jié)論 孕期LPS刺激可致子代大鼠在6周齡時出現(xiàn)血管結(jié)構(gòu)損傷，這種損傷可能持續(xù)于新生兒期，并與其成年發(fā)生高血壓密切相關(guān)。

孕期炎癥刺激；血管結(jié)構(gòu)；縫隙連接；連接蛋白；高血壓；NF-κB

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，于大鼠孕期給予炎癥刺激劑脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)或酵母多糖刺激，子代大鼠從6周齡開始血壓升高，隨著鼠齡增加，血壓不斷升高，至24周齡達(dá)高血壓標(biāo)準(zhǔn)；子代大鼠體重增加、脂肪重量異常等[3-4]。在小鼠中的研究也表明，孕期炎癥刺激可致子代小鼠脂肪發(fā)育異常，影響其脂質(zhì)代謝[5]。同時，出現(xiàn)血管反應(yīng)性異常，局部腎素血管緊張素改變及腎損傷等[6-7]。針對孕期炎癥刺激對于子代大鼠血管結(jié)構(gòu)的影響，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)孕期給予LPS刺激后，子代大鼠從新生兒期，即出生1 d至1周，血管即出現(xiàn)損傷[8]。然而，孕期刺激后，子代大鼠6周齡血壓開始升高時的血管結(jié)構(gòu)是如何改變，尚未見報道。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察了孕期LPS刺激后，子代大鼠6周齡時胸主動脈結(jié)構(gòu)的改變，以期對孕期炎癥刺激致子代高血壓的機(jī)制做進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 清潔級SD孕鼠購于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動物中心。總RNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANGEN)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒(TaKaRa)；脂多糖(Sigma)；二硫代氨基四氫呋喃(PDTC)(Sigma)；氯化鈉注射液(太極西南藥業(yè)股份有限公司)；化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore)；顯影液及定影液(柯達(dá))；抗體：Cx37(Abcam， ab101928；Santa Cruz，sc-27716)、 Cx40(Abcam， ab101929；Santa Cruz，sc-20466)、Cx43(Abcam，ab11370)、Cx45(Abcam)、GAPDH(Cell Signing Technology)、β-actin(Santa Cruz)、山羊抗小鼠IgG-HRP(Santa Cruz)、山羊抗兔IgG-HRP(中杉金橋)。熒光定量PCR儀/Relplex(Epqradient)；ND-2000微量核酸定量儀，NANO DRDP 2000(Thermo)；低溫離心機(jī)，H1650-W(Sigma)；正置顯微鏡，E-100(Nikon)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀等(BIO-RAD)。與透射電鏡及激光共聚焦相關(guān)的試劑及儀器均由第三軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 12只孕鼠隨機(jī)分為3組：對照組(Con)、LPS刺激組(LPS)、LPS刺激加PDTC干預(yù)組(L+P)。Con組在孕d 8～14每天腹腔注射生理鹽水0.5 mL；LPS組在孕d 8、10、12腹腔注射LPS(0.79 mg·kg-1)，d 8～14每天注射生理鹽水0.5 mL；L+P組在孕d 8、10、12注射LPS，同時d 8～14注射PDTC(100 mg·kg-1)。出生6周齡時稱體質(zhì)量，各組隨機(jī)處死8只仔鼠，取主動脈弓至胸主動脈分叉處進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 子代大鼠胸主動脈超微結(jié)構(gòu)觀察 主動脈弓段在戊二醛中切成小段(0.2～0.3 cm)固定過夜，脫水、包埋、超薄切片、染色后在透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)。

1.4 胸主動脈Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的mRNA含量檢測 取胸主動脈段至分叉處組織，進(jìn)行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時熒光定量PCR檢測。用β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。引物序列均由上海生工生物工程公司合成、純化(Tab 1)。

Tab 1 Primer sequences

1.5 胸主動脈Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的蛋白含量檢測 胸主動脈提取蛋白，采用Western blot檢測Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的蛋白表達(dá)水平(Cx37、Cx40及Cx43蛋白檢測采用GAPDH作為內(nèi)參蛋白；Cx45檢測采用β-actin作為內(nèi)參蛋白)。凝膠分析系統(tǒng)Quantity One計算條帶光密度。

1.6 胸主動脈Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的免疫熒光檢測 降主動脈段OCT包埋，冰凍切片，固定，封閉、一抗孵育、Cy5二抗孵育、DAPI工作液染核，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察各組Cx37、Cx40、Cx43及Cx45的免疫熒光表達(dá)情況。

第三、銀子“有靈說”。在白銀古道及其左近區(qū)域民間還有許多關(guān)于銀子“有靈說”的故事。老人家多耳熟能詳。大體上說，許多上代財主、大賈發(fā)家之后本著財不露眼的原則將一些銀子或埋于地下，或藏于墻間，或藏于房間地板之下等等。隨著年代的久遠(yuǎn)，或因主人突然去世而遺忘。但年代久遠(yuǎn)的銀子會變成兔子、羊等動物，晚上出來玩耍，如遇有緣之人，去追由白銀變成的兔子或羊，則可得到銀子。如上洋村就有此傳說，相傳，彭八公在煽煉銀子時，曾在圍城底藏有銀子兩缸，并在路旁巖壁上刻著：“銀藏圍城底，弗是在山岡；孰會猜得中，拾銀兩大缸?！惫磐駚?，這兩缸銀子藏在何方？無人猜得中。

2 結(jié)果

2.1 子鼠出生情況 見參考文獻(xiàn)[8]。

2.2 子代大鼠6周時體質(zhì)量情況 LPS組子代大鼠在6周時♂♀體質(zhì)量均明顯高于對照組[分別為(107.062±14.470)g比(57.262±9.817)g，(100.15±13.104)g比(68.325±19.056)g,P<0.01，n=8]，L+P組♂鼠[(89.557±15.756)g]明顯低于LPS組(P<0.05)，而♀鼠[(103.45±16.912)g]無差異(n=8)。

2.3 子代大鼠6周時胸主動脈超微結(jié)構(gòu) 如Fig 1所示，子代大鼠在出生第6周時，Con組內(nèi)皮層未見損傷，內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)形態(tài)完整，內(nèi)彈力膜完整，平滑肌層細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)排列整齊，胞核形態(tài)規(guī)則，平滑肌層彈性纖維及膠原纖維連續(xù)完整，各細(xì)胞器正常，EC間可見膜通道結(jié)構(gòu)的GJ(Fig 1A、1B)；LPS組內(nèi)皮層受損，EC見大量破裂，內(nèi)彈力膜斷裂，VSMC排列相對紊亂，胞核形態(tài)不規(guī)則，明顯向內(nèi)皮層生長，EC間明顯可見GJ，相對于Con組較長且多見(Fig 1C、1D)；L+P組內(nèi)皮損傷程度較LPS組稍有改善，VSMC排列紊亂，EC間可見GJ(Fig 1E、1F)。

Fig 1 Representative transmission electron micrographs of aortas in 6-week offspring

A,B:Con group;C,D:LPS group;E,F:L+P group.EC:endothelial cell, SMC: smooth muscle cell, IE: internal elastic lamina, GJ: gap junction, L: lumen

2.4 子代大鼠6周時Cx37、Cx40、Cx43、Cx45的mRNA表達(dá) 如Fig 2所示，子代大鼠6周時，♀♂間胸主動脈Cx mRNA的表達(dá)無差異。LPS組Cx43的mRNA表達(dá)明顯比Con組降低(P<0.05)；L+P組Cx43的mRNA表達(dá)明顯比LPS組增加(P<0.05)。各組間Cx37、Cx40及Cx45的mRNA表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig 2 mRNA expression of connexin

*P<0.05vsCon;#P<0.05vsLPS

2.5 子代大鼠6周時Cx37、Cx40、Cx43、Cx45的蛋白表達(dá) 如Fig 3～6所示，LPS組胸主動脈Cx43的蛋白表達(dá)比Con組明顯降低(P<0.05)；L+P組Cx43的蛋白表達(dá)比LPS組明顯升高(P<0.05)。各組間Cx37、Cx40、Cx45的蛋白表達(dá)差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig 3 Protein expression of Cx37 in 6-week

2.6 子代大鼠6周時Cx37、Cx40、Cx43、Cx45免疫熒光表達(dá) 如Fig 7所示，Cx37和Cx40主要在血管內(nèi)皮表達(dá)，Cx43和Cx45主要在平滑肌層中大量表達(dá)?！馐笈c♂鼠的胸主動脈Cx37、Cx40、Cx43和Cx45免疫熒光結(jié)果并無明顯差別。LPS組的Cx43熒光強(qiáng)度及熒光點(diǎn)數(shù)明顯比Con組降低；L+P組Cx43的熒光強(qiáng)度及熒光點(diǎn)數(shù)明顯比LPS組增高。各組間Cx37、Cx40和Cx45的熒光強(qiáng)度和熒光數(shù)量并無明顯差異。

Fig 4 Protein expression of Cx40 in 6-week

Fig 5 Protein expression of Cx43

*P<0.05vsCon;#P<0.05vsLPS

3 討論

有研究表明[9]，動脈壁結(jié)構(gòu)變化所致的大動脈順應(yīng)性降低，是心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的獨(dú)立危險因素，高血壓大鼠主動脈中出現(xiàn)血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ ，AngⅡ)受體AT1、AT2表達(dá)改變等[10]，這些均說明，大動脈的病變對于高血壓的發(fā)生發(fā)展具有重要的意義。本研究結(jié)果表明，孕期LPS刺激子代大鼠在6周齡時胸主動脈出現(xiàn)內(nèi)皮損傷，內(nèi)彈力膜斷裂，VSMC明顯向內(nèi)膜生長等病理改變，這些病變可能是繼新生兒期血管病變后的持續(xù)病變，其所致的血管壁增厚、血管緊張度改變等，可能是其在6周齡即出現(xiàn)血壓升高的關(guān)鍵，也是高血壓維持和發(fā)展的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。至子鼠12周齡，內(nèi)皮損傷越發(fā)嚴(yán)重，VSMC增殖、遷移更為明顯，血管反應(yīng)性異常[11]。孕期LPS刺激后，從大鼠出生后的持續(xù)的血管病變，可能是子代大鼠高血壓發(fā)生的重要原因。

Fig 6 Protein expression of Cx45 in

Fig 7 Immunolabeling of connexin in 6-week offspring aorta(scale:25 μm)

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，孕期LPS刺激致子代發(fā)生高血壓與血管及腎臟局部腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)異常激活相關(guān)，孕期LPS刺激同時給予核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)特異性抑制劑PDTC能逆轉(zhuǎn)子代血壓的升高，改善血管的功能[6-7,12-13]；最新研究亦表明孕期炎癥刺激所致的NF-κB的調(diào)節(jié)紊亂，可作用于RAS系統(tǒng)的異常激活，也是子代高血壓發(fā)病的機(jī)制之一[14]。連接血管細(xì)胞之間的連接通道排列而成一種特殊膜結(jié)構(gòu)，稱之為縫隙連接(GJ)，其由細(xì)胞膜上的連接子相互銜接而成，每個連接子由6個Cx組成。組成同一個連接子的Cx可同可不同，因而使連接子所形成的連接通道具有不同的通透性和選擇性。大動脈中常見的連接蛋白為Cx37、Cx40、Cx43及Cx45。小鼠的基因敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GJ與血壓調(diào)節(jié)存在著一定聯(lián)系[15]，Cx的表達(dá)與高血壓的關(guān)系，可能是其參與了腎素及對內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelium NO synthase，eNOS)的調(diào)節(jié)[16-17]，不同類型的高血壓模型中，主動脈Cx受到不同的調(diào)節(jié)，表達(dá)變化不一致，這說明不同的Cx可能具有共同或獨(dú)特的功能[18]。前期研究發(fā)現(xiàn)[8]，孕期炎癥刺激后，子代大鼠在新生兒期就出現(xiàn)Cx的異常變化，但在子代大鼠6周齡，即血壓開始升高時，Cx的變化如何，尚未見報道。本研究結(jié)果提示，孕期LPS刺激后，子代大鼠在6周齡時其胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞間的GJ較對照組多且長，平滑肌細(xì)胞之間及異型細(xì)胞之間的GJ少見；同時，Cx43的mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，而Cx37、Cx40及Cx45的mRNA及蛋白表達(dá)無明顯改變；孕期LPS刺激同時給予PDTC干預(yù)可明顯增加子代大鼠6周齡時Cx43的mRNA及蛋白表達(dá)量。Cx43對于壓力改變較為敏感，在血管壁中含量最為豐富，Cx43通道所調(diào)節(jié)的細(xì)胞間信號交流可參與血管壁彈性的調(diào)節(jié)，從而影響高血壓的發(fā)生發(fā)展，在不同的高血壓模型中，Cx43的表達(dá)有差異[19]；Cx基因敲除小鼠外周血中Ang Ⅱ含量明顯增加，Cx43表達(dá)升高可有效降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓[20]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，孕期LPS刺激后，從新生兒期開始，子代大鼠隨著鼠齡的增加，血管損傷進(jìn)一步加重，血壓升高，Cx的mRNA及蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出不同的變化格局[8,11](部分?jǐn)?shù)據(jù)未列出)。因此，有理由推測Cx表達(dá)改變是孕期LPS刺激后，其子代大鼠維持血管穩(wěn)態(tài)的適應(yīng)性反應(yīng)，主動脈縫隙連接的異常及Cx43表達(dá)的異常與其血管的損傷密切相關(guān)。Alonso等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在高血壓中表達(dá)異常，可能與Ang Ⅱ及NF-κB的異常調(diào)節(jié)有關(guān)，NF-κB能直接并特異地與編碼Cx43的Gja1基因的啟動子位點(diǎn)結(jié)合，從而直接調(diào)節(jié)Cx43的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)用NF-κB特異性抑制劑PDTC干預(yù)后，可逆轉(zhuǎn)Cx43的異常表達(dá)，因此我們推測孕期炎癥刺激致子代大鼠6周齡時Cx43的異常表達(dá)可能受血管組織中NF-κB的調(diào)節(jié)。

綜上所述，孕期炎癥刺激致子代大鼠6周齡時血管結(jié)構(gòu)的損傷，是繼新生兒期就開始的損傷的持續(xù)性變化；是子代大鼠6周齡即出現(xiàn)血壓異常的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也可能是其成年大鼠高血壓發(fā)生的關(guān)鍵因素。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)老鼠模型建立、RT-PCR、WB等相關(guān)實(shí)驗(yàn)在第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物研究所完成；免疫熒光實(shí)驗(yàn)及透射電鏡實(shí)驗(yàn)在第三軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室完成。感謝中心實(shí)驗(yàn)室老師對激光共聚焦及透射電鏡的技術(shù)指導(dǎo)。)

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Effect of maternal lipopolysaccharides exposure during pregnancy on vascular structure in 6-week offspring rats

ZHAO Shan-yu1,2, LIU Ya1, LI Xiao-hui1
(1.InstituteofMateriaMedicaandDeptofPharmaceutics,CollegeofPharmacy,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China;2.DeptofPathology,BasicMedicalScienceSchoolofDaliUniversity,DaliYunnan671000,China)

Aim To explore the role of prenatal exposure to lipopolysaccharides(LPS) on aortic morphology in the 6-week offspring rats. Methods Twelve pregnant rats were randomly divided into three groups: control group, LPS group, L+P(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)group. The rats were intraperitoneally administered vehicle, LPS(0.79 mg·kg-1),or LPS plus PDTC(100 mg·kg-1).LPS was given on the 8th,10th and 12th day, where as vehicle and PDTC were given daily from the 8th to the 14th day during gestation. Offspring body weight was measured at 6-week, and histopathological alteration of the thoracic aorta was observed by transmission electron microscopy, the thoracic aorta mRNA and protein expression of connexin(Cx) molecules including Cx37, Cx40,Cx43 and Cx45 in offspring rats were detected by real time PCR ,Western blot and confocal laser-scanning microscope.Results Body weight at 6-week offspring rats was significantly higher in LPS group than in control group whatever male or female(P<0.01);and that in L+P group was significantly lower than in LPS group in male rats(P<0.05),but not in female rats. The LPS group thoracic aortas exhibited lesions, including impaired endothelial cells, and the vascular smooth muscle cells were arranged disorder and migration and proliferation; the number of gap junction was increased and longer than control group; the pathological changes were improved to some extent in L+P group. Cx43 mRNA and protein expression in LPS group was obviously lower than in control group(P<0.05), which could be partly reversed in L+P group(P<0.05). There was no significant difference in Cx37,Cx40 or Cx45 mRNA or protein expression among each group.The results of protein expression with confocal laser-scanning microscope was the same as those of Western blot.Conclusion Maternal LPS exposure during pregnancy leads to vascular changes in 6-week offspring rats, which might last until neonatal stage, and is closely correlated to hypertension in adult offsprings.

pregnant inflammation exposure; vascular structure; gap junction; connexin; hypertension; NF-κB

2016-12-10,

2017-01-15

國家自然科學(xué)基金資助項目 (No 81373420，81573440，81273507，81473210)

趙釤妤(1988-)，女，碩士，助教，研究方向：抗炎免疫與心血管藥理學(xué)，E-mail：zhaoshanyu2011@163.com； 李曉輝(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：抗炎免疫與心血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：lpsh008@aliyun.com

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.030.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.015

A

1001-1978(2017)05-0662-06

R-332；R322.12；R343.9；R364.5；R544.1；R977.6