大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 激活介導(dǎo)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬☆

趙雅寧孫竹梅劉俊杰李建民薛承景陳長香

·論 著·

大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 激活介導(dǎo)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬☆

趙雅寧*孫竹梅*劉俊杰*李建民△☆薛承景△陳長香*

目的 探討大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）后海馬區(qū)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 （extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）激活與神經(jīng)細(xì)胞自噬的關(guān)系。方法 120只雄性SD大鼠隨機分成假手術(shù)組、SAH組、ERK1/2抑制劑U0126組、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（rapamycin,Rap）組。采用枕大池二次注血法制作SAH大鼠模型；U0126組和Rap組分別于造模前30min側(cè)腦室注射U0126（5μg/μL）和Rap（10nmol/μL）。光鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；免疫組化法和實時熒光定量PCR法檢測海馬區(qū)磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、ERK1/2 mRNA和自噬標(biāo)志蛋白（Beclin-1和Beclin-1mRNA、LC3-Ⅱ和LC3mRNA）表達(dá)水平。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，SAH組神經(jīng)細(xì)胞死亡率增加（14.9%±5.7%，28.3%±9.8%，44.2%±10.9%）（q值依次為27.56、35.65、44.81；均P＜0.05），ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA水平增加（1.83±0.01，2.82±0.06，1.34±0.04；1.46±0.02，1.76±0.02，1.35±0.02；1.52±0.04，1.89±0.01，1.31±0.04）(q值依次為42.99、60.66、48.08，71.26、72.46、49.50，48.49、82.40、41.18；均P＜0.05），p-ERK1/2、Beclin-1和LC3–II蛋白水平增加（均P＜0.05）；與SAH組比較，U0126組神經(jīng)細(xì)胞死亡率增加（19.6±6.5%，36.2±7.7%，58.2±12.7%）（q值依次為9.59、10.43、14.66；均P＜0.05），U0126組ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA表達(dá)降低（1.23±0.02，1.40±0.02，1.12±0.02；1.22± 0.04，1.48±0.06，1.24±0.03；1.34±0.04，1.33±0.02，1.14±0.04）(q值依次為 75.66、65.35、31.11，37.18、26.70、15.56，16.79、51.85、22.58；P＜0.05），p-ERK1/2、Beclin-1和LC3–II蛋白水平降低（P＜0.05）；與SAH組比較，Rap組神經(jīng)細(xì)胞死亡率降低（9.1%±4.6%，18.8%±8.6%，28.21%±9.2%）（q值依次為11.86、12.54、16.74；均P＜0.05），Rap組 Beclin-1mRNA和LC3mRNA增加（1.78±0.02，2.27±0.05，1.86±0.04；1.97±0.06，2.31±0.08，1.85± 0.00）(q值依次為49.57、48.63、72.12、41.96、38.88、71.73；P＜0.05），Beclin-1和LC3–II蛋白增加（P＜0.05），ERK1/2 mRNA變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q值依次為2.63、2.65、2.83，P＞0.05），p-ERK1/2蛋白變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 SAH后激活的ERK1/2激活，可促進Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞丟失。

蛛網(wǎng)膜下腔出血 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 自噬 微管相關(guān)蛋白-1

自噬是真核細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞防御機制。應(yīng)激狀態(tài)下自噬的程度對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡起到不可忽視的作用。研究顯示蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）病理過程中伴隨自噬的發(fā)生，進一步誘導(dǎo)自噬可減低SAH后早期腦損傷（early brain injury,EBI）的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能損傷[1],但SAH后自噬發(fā)生的機制尚未明確。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）是有絲分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族重要成員之一；已證實ERK1/2信號活化在多種中樞神經(jīng)疾病如腦卒中、腦創(chuàng)傷、阿爾茨海默病等等病理過程中具有關(guān)鍵作用，是神經(jīng)細(xì)胞存活調(diào)控靶點之一[2-3]。那么，SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬是否與ERK1/2信號活化有關(guān)，目前報道甚少。因此，本研究通過建立大鼠SAH，分別應(yīng)用ERK1/2抑制劑和自噬誘導(dǎo)劑進行干預(yù)，觀察海馬區(qū)ERK1/2激活、自噬關(guān)鍵因子Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1（輕鏈LC3-Ⅱ）表達(dá)以及神經(jīng)細(xì)胞丟失情況，探討SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬與ERK1/2信號活化的關(guān)系，為SAH后EBI的早期救治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 清潔級雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量350～450g購置于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(京)2009-003。按照隨機數(shù)字表法，將大鼠分為假手術(shù)（Sham）組、SAH組、ERK1/2抑制劑U0126組、自噬誘導(dǎo)劑Rap組。每組又分6、24、72h 3個時間。

1.2 動物模型制作 采用自體血二次枕大池注血法[4]制備大鼠SAH模型。Sham組向枕大池2次注入0.3 mL等滲鹽水，余操作均與SAH組一致。U0126組和Rap組分別于造模前30min側(cè)腦室注射U0126（5μg/μL）和Rap（10nmol/μL），然后再制備SAH模型。模型判定標(biāo)準(zhǔn)：①當(dāng)行第二次枕大池注血時，可見少量血性腦脊液在穿刺部位滲出，說明穿刺針位置準(zhǔn)確；②剝離腦部時肉眼可以見到極其顯眼的血性液體散在分布于腦底基底池部位，或光鏡下見到蛛網(wǎng)膜下腔有明顯血性液體（圖1）。模型制作過程中，SAH組死亡7只，1只模型不符合標(biāo)準(zhǔn)被剔除；U0126組和Rap組分別死亡6只，各組有2只模型不符合標(biāo)準(zhǔn)被剔除；上述被剔除動物依次補齊，最終各組30只動物納入統(tǒng)計學(xué)分析。

圖1 SAH動物模型的判定。A：肉眼見到血性液體分布于腦底基底池部位；B:光鏡下見到蛛網(wǎng)膜下腔有明顯血性液體。

1.3 腦組織海馬區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 各組各時間點取5只動物，常規(guī)麻醉后處死；用4%多聚甲醛灌注固定后，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織。經(jīng)石蠟包埋、冠狀切片（片厚5 μm）、HE染色。參照文獻[5]在有測微尺的光學(xué)顯微鏡（400×）下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化；應(yīng)用Motic-6.0圖像采集和分析系統(tǒng)計算每個視野的死亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量（每只動物取5張海馬區(qū)切片，每張切片選取4個不重復(fù)的視野，即每組各100個視野），以視野下神經(jīng)細(xì)胞平均死亡百分率（CA1區(qū)死亡細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量比值百分?jǐn)?shù)）表示。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測 ERK1/2、Be

clin-1、LC3mRNA各組各時間點取5只大鼠，動物按照規(guī)定的時間點處死，快速斷頭取腦，用冰箱中預(yù)冷的器械在冰上分離出雙側(cè)海馬組織，稱量0.6 g，加入1mL RNAiso Plus溶液后勻漿，室溫（26℃）靜置5min后，12000r/min 4℃離心5min，取上清移至新的1.5mL離心管內(nèi)，加入1/5RNAiso Plus溶液體積的氯仿，震蕩混勻后室溫靜置5min，12000 r/min4℃離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入0.5～1倍RNAiso Plus溶液體積的異丙醇，室溫靜置10min，12000 r/min4℃離心10min，棄掉上清液，用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀，7500 r/min4℃離心5min，棄上清保留沉淀，干燥（不可加熱），溶解于30μL DEPC處理水中，測量OD260/280值，根據(jù)OD260計算RNA濃度，-80℃保存。

ERK1/2序列：5’-GCCGCCGCCGCCGCCAT-3’；ERK1 Forward primer：5’-TACACGCAGTTGCA GTACATCG-3’；ERK1 Reverse primer：5’-CGCAG GATCTGGTAGAGGAAGT-3’；ERK2Forwardprimer：5’-GGAGCTTGTGGAAATACCTTGG -3’；ERK2 Reverse primer：GACGCAGTGTGGAAATACCTTGG-3’；Beclin1序列：Forward primer：CTCTCGTCAAGGCGTCACTTC；Reverse primer：CCTTAGACCCCTCCATTCCTCA。 LC3序 列 ：Forward primer：ACCCTCTACGATGCTGGTGA Reverse primer：GCTGTCCTCAATGTCCTTCTG（上海生工生物技術(shù)有限公司合成）。進行Real Time One Step實時熒光定量PCR反應(yīng)：Satge 1、2（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），Reps，1，42℃5min，95℃10s；Stage3（PCR反應(yīng)），Reps，40，95℃5s，60℃31s；Stage4（融解曲線分析），Dissociation Protocol。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測磷酸化ERK1/2、Beclin-1、LC3-II陽性表達(dá) 標(biāo)本采集同HE染色，切片常規(guī)脫蠟至去離子水、滴加復(fù)合消化液、37℃溫箱孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min，用3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，PBS洗滌、滴加兔抗鼠p-ERK1/2、Beclin-1和LC3-II多克隆抗體（1:200，1：250，1：250），置于冰箱保鮮層4℃過夜；37℃復(fù)溫45 min，PBS洗滌、滴加生物素化二抗，37℃孵育40 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染、脫水透明、封片。陽性率的定量分析:每只動物取5張海馬區(qū)切片，將每張切片的CA1區(qū)平均分為3個等份，每個等份選取一個相同部位的4個視野（100個視野），應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)分析各組陽性細(xì)胞進行吸光度(absorbance，A)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理，組間分析采用單因素方差分析，兩組間比較的SNK-q(Student-Newman-keuls)檢驗，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)結(jié)果 Sham組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,神經(jīng)元胞體較大，胞核大而圓，核仁清晰。SAH組海馬區(qū)可見神經(jīng)細(xì)胞變性水腫,細(xì)胞輪廓模糊;亦可見死亡神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞出現(xiàn)核溶解、核碎裂或核消失結(jié)構(gòu)不清。多組間神經(jīng)細(xì)胞死亡率有統(tǒng)計學(xué)意義（各時間點 F為 156.60、193.50、151.13，均 P＜0.05）。與Sham組比較，SAH組各時間點神經(jīng)細(xì)胞死亡率均明顯增加（q值依次為27.56、35.65、44.81；均P＜0.05）；U0126組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷進一步加重，視野中死亡神經(jīng)細(xì)胞增多，與SAH組比較，各時間點神經(jīng)細(xì)胞死亡率均明顯增多（q值依次為9.59、10.43、14.66；均P＜0.05）；Rap組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷減輕，視野中死亡的神經(jīng)細(xì)胞減少，與SAH組比較，各時間點神經(jīng)細(xì)胞死亡率均明顯降低（q值依次為11.86、12.54、16.74；均P＜0.05）。見圖2、表1。

表1 各組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡率比較（n=15，±s）

表1 各組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡率比較（n=15，±s）

1）與Sham組比較，P＜0.05；2）與SAH比較，P＜0.05

組別Sham組SAH組U0126組Rap組6h 1.4%±0.3% 14.9%±5.7%1）19.6%±6.5%2）9.1%±4.6%2）24h 1.3%±0.4% 28.3%±9.8%1）36.2%±7.7%2）18.8%±8.6%2）72h 1.4%±0.4% 44.2%±10.9%1）58.2%±12.7%2）28.2%±9.2%2）

2.2 實時熒光定量PCR法檢測結(jié)果 用實時定量PCR檢測ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參基因，以Sham 組ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA表達(dá)為1，計算各組ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA的Ct值（公式（△Ct=目的基因平均Ct值‐管家基因平均Ct值，△△Ct=實驗組△Ct‐對照組△Ct，相對表達(dá)量=2-△△Ct）。與Sham組比較，SAH組各時間點ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和 LC3 mRNA水平上調(diào) (q值依次為42.99、60.66、48.08，71.26、72.46、49.50，48.49、82.40、41.18；均P＜0.05）；與SAH組比較，U0126組中各時間ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA持續(xù)減少 (q值依次為75.66、65.35、31.11，37.18、26.70、15.56，16.79、51.85、22.58；P＜0.05）；與SAH組比較，Rap組中ERK1/2 mRNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (q值依次為2.63、2.65、2.83，P＞0.05）；Beclin-1 mRNA和LC3mRNA水平顯著上調(diào) (q值依次為49.57、48.63、72.12、41.96、38.88、71.73；P＜0.05），見表2。

圖2 各組大鼠72 h海馬區(qū)組織病理形態(tài)的變化。A～D分別為sham組、SAH模型組、U0126組、Rap組海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（H E染色，40×10）

表2 各組海馬區(qū)ERK1/2、Beclin-1、LC3-ⅡmRNA表達(dá)水平比較（n=15，±s）數(shù)

表2 各組海馬區(qū)ERK1/2、Beclin-1、LC3-ⅡmRNA表達(dá)水平比較（n=15，±s）數(shù)

1）與Sham組比較，P＜0.05；2）與SAH比較，P＜0.05

組別Sham組SAH組U0126組Rap組6h 1.00±0.00 1.83±0.011）1.23±0.022）1.82±0.011）ERK1/2 mRNA Beclin-1 mRNA LC3 mRNA 24h 1.00±0.00 2.82±0.061）1.40±0.022）2.79±0.061）72h 1.00±0.00 1.34±0.041）1.12±0.022）1.32±0.031）6h 1.00±0.00 1.46±0.021）1.22±0.042）1.78±0.022）24h 1.00±0.00 1.76±0.021）1.48±0.062）2.27±0.052）72h 1.00±0.00 1.35±0.02 1.24±0.032）1.86±0.042）6h 1.00±0.00 1.52±0.041）1.34±0.042）1.97±0.062）24h 1.00±0.00 1.89±0.011）1.33±0.022）2.31±0.082）72h 1.00±0.00 1.31±0.04 1.14±0.042）1.85±0.002）

表3 各組海馬區(qū)p-ERK1/2、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較（n=15，±s）

表3 各組海馬區(qū)p-ERK1/2、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較（n=15，±s）

與Sham組比較，P＜0.05；2）與SAH比較，P＜0.05

組別Sham組SAH組U0126組Rap組p-ERK1/2 Beclin-1 LC3-II 6h 2.48±0.49 9.48±2.561）6.33±2.112）8.96±2.631）24h 2.52±0.55 16.68±4.561）8.52±2.232）15.72±4.701）72h 2.48±0.52 14.60±2.291）7.44±2.112）14.06±2.411）6h 2.49±0.70 9.41±2.581）5.08±2.152）11.24±3.882）24h 2.50±0.67 18.98±3.721）7.44±2.222）22.89±4.552）72h 2.52±0.69 14.22±4.441）10.36±2.962）17.12±4.322）6h 2.44±0.69 7.82±2.331）4.88±1.842）11.88±3.012）24h 2.33±0.63 15.39±4.221）5.77±2.112）19.12±4.442）72h 2.44±0.65 12.25±3.991）9.22±2.772）17.01±3.992）

2.3 各組免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 磷酸化ERK1/2、Beclin-1、LC3-II陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞的胞核可見細(xì)小的棕黃色顆粒（圖3）。與Sham組比較，SAH組各時間點p-ERK1/2、Beclin-1和LC3-II水平上調(diào) (q值依次為32.85、40.81、61.03，26.72、52.17、33.91，25.12、40.13、31.05，均P＜0.05）；與 SAH組比較，U0126組中各時間 p-ERK1/2、Beclin-1和LC3-II持續(xù)減少(q值依次為14.78、23.52、36.05、16.72、36.53、11.19、13.73、29.56、9.59，P＜0.05）；與SAH組比較，Rap組中p-ERK1/ 2差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q值依次為2.44、2.77、2.72，P＞0.05）；Beclin-1和LC3-II水平顯著上調(diào) (q值依次為 7.07、12.38、8.41，18.96、11.46、15.06，P＜0.05）,見表3。

3 討論

腦損傷狀態(tài)下，適度自噬激活能夠清除細(xì)胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)及受損細(xì)胞器，調(diào)節(jié)能量代謝，減輕細(xì)胞損傷程度，降低神經(jīng)細(xì)胞死亡的發(fā)生率；但過度的自噬可以促進Caspase-3裂解，加重神經(jīng)細(xì)胞死亡[5]。ZHAO等[6]通過改良的顱內(nèi)動脈穿刺法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤進行預(yù)處理處理，發(fā)現(xiàn)腦組織含水量和血腦屏障滲透率進一步加劇及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，神經(jīng)功能評分下降。本研究應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑Rap進行預(yù)處理，結(jié)果顯示該組自噬蛋白分子Beclin-1、LC3-II表達(dá)顯著增加，同時該組神經(jīng)細(xì)胞死亡率顯著降低，提示SAH早期自噬激活有利于神經(jīng)細(xì)胞的存活，與目前報道結(jié)果相似。

ERK1/2信號激活在腦損傷中的作用一直存有爭議。Zhao[7]等在糖尿病大鼠腦缺血模型中觀察到，ERK1/2活性降低伴隨DNA依賴蛋白激酶Ku70表達(dá)持續(xù)減少，神經(jīng)細(xì)胞死亡增多現(xiàn)象，有學(xué)者指出，ERK1/2活化是神經(jīng)細(xì)胞耐受缺血缺氧應(yīng)激損傷的核心。但亦有研究指出ERK1/2活化可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控炎癥因子如腫瘤壞死因子-α，白細(xì)胞介素1β表達(dá)水平，加重腦缺血缺氧造成的炎癥反應(yīng)和腦水腫[8]。本研究結(jié)果顯示與SAH組比較，U0126組ERK1/2mRNA、Beclin-1mRNA、LC3mRNA減少、磷酸化ERK1/2、Beclin-1、LC3-II免疫陽性染色降低，神經(jīng)細(xì)胞死亡率增加；而Rap組ERK1/2變化不明顯，這一方面說明SAH早期ERK1/2活化對神經(jīng)細(xì)胞具有保護作用，同時也提示作為自噬激活的上游通路，ERK1/2活化可調(diào)控自噬的激活，ERK1/2活性降低導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞自噬不足，而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞丟失嚴(yán)重。目前關(guān)于ERK1/ 2信號和自噬關(guān)系的研究主要來自體外的實驗研究，如用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑VK3誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬，ERK1/2激活，U0126可阻斷該過程中LC3-II的表達(dá)[9]。近期李冉[10]等采用非開顱血管內(nèi)穿線法制備小鼠SAH模型，觀察到代謝型谷氨酸受體1選擇性拮抗劑可降低海馬區(qū)Beclin-1、LC3-II表達(dá)，且這種變化過程中伴隨ERK1/2活性的改變，亦從側(cè)面提示SAH后ERK1/2信號激活與神經(jīng)細(xì)胞自噬有關(guān)。

圖3 各組大鼠24h海馬磷酸化ERK1/2、Becl i n-1和LC3-II免疫組織化學(xué)結(jié)果。A1～D1：分別為sham組、SAH組、U0126組、Rap組海馬區(qū)磷酸化ERK1/2免疫組織化學(xué)結(jié)果（40×10）；A2～D2：分別為sham組、SAH組、U0126組、Rap組海馬區(qū)Becl i n-1免疫組織化學(xué)結(jié)果（40×10）；A3～D3：分別為sham組、SAH組、U0126組、Rap組海馬區(qū)LC3-II免疫組織化學(xué)結(jié)果（40×10）

綜上所述，SAH后ERK1/2信號通路激活，激活的ERK1/2可通過誘導(dǎo)Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)從而參與神經(jīng)細(xì)胞丟失。ERK1/2信號通路是連接大多數(shù)細(xì)胞外信號與膜受體、轉(zhuǎn)錄因子和各基因調(diào)節(jié)的中央信號通路之一，本研究從神經(jīng)細(xì)胞自噬的角度闡明了其在SAH后EBI神經(jīng)細(xì)胞丟失的關(guān)鍵作用，為SAH后EBI的早期干預(yù)提供了一定的理論依據(jù)。

[1]石曉勇,王中,陳罡,等.自噬在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中作用的實驗研究 [J].臨床神經(jīng)外科雜志,2015,12 (6):449-452.

[2]YU X,GUAN PP,GUO JW,et al.By suppressing the expression of anterior pharynx-defective-1α and-1β and inhibiting the aggregation of β-amyloid protein,magnesium ions inhibit the cognitive decline of amyloid precursor protein/presenilin 1 transgenic mice[J].FASEB J,2015,29(12):5044-5058.

[3]FU P,HU Q.3,4-Dihydroxyphenylethanol alleviates early brain injury by modulating oxidative stress and Akt and nuclear factor-κB pathways in a rat model of subarachnoid hemorrhage [J].Exp Ther Med,2016,11(5):1999-2004.

[4]黃偉,朱繼,熊海兵,等.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子經(jīng)Akt／eNOS通路在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的表達(dá)[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2013,39(5):300-303.

[5]CAO J,XIE H,SUN Y,et al.Sevoflurane post-conditioning reduces rat myocardial ischemia reperfusion injury through an increase in NOS and a decrease in phopshorylated NHE1 levels [J].Int J Mol Med,2015,36(6):1529-1537.

[6]ZHAO H,JI Z,TANG D,et al.Role of autophagy in early brain injury after subarachnoid hemorrhage in rats[J].Mol Biol Rep, 2013,40(2):819-827.

[7]ZHAO Y,LI J,TANG Q,et al.Regulation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 influences hippocampal neuronal survival in a rat[J].Neural Regen Res,2014,9(7):749-756.

[8]KONG L,LIU J,WANG J,et al.Icariin inhibits TNF-α/IFN-γ induced inflammatory response via inhibition of the substance P and p38-MAPK signaling pathway in human keratinocytes[J]. Int Immunopharmacol,2015,29(2):401-407.

[9]于春艷,劉希,于春榮,等.維生素K3誘導(dǎo)氧化應(yīng)激經(jīng)ERK信號途徑介導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生自噬[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2014,40(2):229-232.

[10]李冉,劉江,徐愛軍,等.小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后海馬CA1區(qū)mGluR1和ERK1/2的表達(dá)變化[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2012,28 (1):49-54.

The activation of extracellular regulated protein kinase 1/2 induces neuron autophagy in the hippocampousin a rat model of subarachnoid hemorrhage.

ZHAO Yaning,SUN Zhumei，LIU Junjie，LI Janmin,XUE Chengjing，CHEN Changxiang.The North China University of science and technology,college of Nursing and Rehabilitation,Hebei 063000,China.Tel:0315-3725385

Objective To investigate the relationship of extracellular regulated protein kinases activation and neural cells autophagy in rats after subarachnoid hemorrhage.Methods One hundred twenty male SD rats were ran-domly divided into sham operated group,SAH group,ERK1/2 inhibitor U0126 group,autophagy inducer rapamycin (Rap)group.The animal models were established by injecting the autologous blood into cisterna magna twice.U0126 (5μg/μL)and Rap (10nmol/μL)were injected into lateral ventricles in U0126 group and Rap group 30min before SAH.The morphology of hippocampal nerve cells were examined by using light microscopy.The expression levels of phosphorylated ERK1/2（p-ERK1/2），ERK1/2mRNA and autophagy markers(Beclin-1and Beclin-1 mRNA、LC3-Ⅱand LC3mRNA)in the hippocampus were detected by using immunohistochemistry and real-time fluorescence quantitative PCR.Result Compared with sham group,the rate of dead nerve cells,the mRNA levels of ERK1/2,Beclin-1 and LC3 as well as the levels of the p-ERK1/2,Beclin-1 and LC3-II increased in SAH group（P＜0.05）.Compared with SAH group,the rate of dead nerve cells increased（P＜0.05）,the ERK1/2 mRNA,Beclin-1 mRNA and LC3 mRNA,and p-ERK1/2,Beclin-1andLC3-II in U0126 group decreased（P＜0.05）;the rate of dead nerve cells decreased （P＜0.05）,the Beclin-1 mRNA and LC3 mRNA,the Beclin-1and LC3-II level increased in Rap group（P＜0.05）,but ERK1/2 mRNA and p-ERK1/2 remained unchanged（P＞0.05）.Conclusion Activation of the ERK1/2 signaling pathway after SAH,can induce nerve cells death by increasing Beclin-1 and LC3-II expressions.

Subarachnoid hemorrhage Extracellular regulated protein kinases Autophagy Microtubule-associated protein 1

R651.1

A

2016-11-16)

(責(zé)任編輯：甘章平)

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.02.010

☆河北省衛(wèi)生廳重點醫(yī)學(xué)項目（編號：zd2013087）；唐山市科技局課題（編號：14130220B）

* 華北理工大學(xué)護理與康復(fù)學(xué)院（唐山 063000）

△華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科