腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子啟動子區(qū)甲基化與孤獨癥譜系障礙關系初探☆

周家秀丁明崔冬張琳琳周甄會秦尚夠廖汝琴王艷何福生楊峰王明幫

·論 著·

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子啟動子區(qū)甲基化與孤獨癥譜系障礙關系初探☆

周家秀*丁明**崔冬***張琳琳*周甄會*秦尚夠*廖汝琴*王艷△何福生△楊峰****王明幫△

目的 通過比較孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD）患者和正常對照腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）基因啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)各CpG單元甲基化率，探討ASD可能的發(fā)病機制。 方法 選取ASD患者12例及正常對照12名，利用飛行時間質(zhì)譜法檢測全血中BDNF基因啟動子Ⅰ和Ⅳ區(qū)各CpG單元甲基化率，并分析其相關性距離、進化關系，比較兩組各單元甲基化率。 結(jié)果 在BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)分別檢測到17個和8個CpG單元的甲基化率。ASD患者組BDNF啟動子Ⅰ區(qū)中CpG單元4、7、10、35，以及BDNF啟動子Ⅳ區(qū)CpG單元11.12、14相關性距離較近，聚類成比較小的分支。ASD患者BDNF啟動子Ⅰ區(qū)CpG單元5.6甲基化率低于對照組（P＜0.05），Ⅳ區(qū)CpG單元3和15甲基化率高于對照組（P＜0.05）。 結(jié)論 ASD患者BDNF啟動子Ⅰ區(qū)CpG單元5.6和Ⅳ區(qū)CpG單元3和15甲基化率在ASD患者組和對照組差異顯著，提示BDNF啟動子甲基化可作為ASD潛在的生物標志物深入研究。

孤獨癥譜系障礙 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 啟動子 甲基化

遺傳因素和非遺傳因素在抑郁癥、精神分裂癥和雙相情感障礙等精神疾病的發(fā)生發(fā)展中均扮演重要角色[1-3]。非遺傳因素目前研究較多的是表觀遺傳，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控等。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）可調(diào)節(jié)軸/樹突發(fā)生、突觸形成等[4]，研究顯示，它在精神疾病發(fā)病中起重要作用[5]。環(huán)境應激會引起DNA異常甲基化，從而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中BDNF基因的表達，并影響突觸可塑性和記憶的形成，可能對精神疾病的發(fā)生有一定影響[6]。目前，關于孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD）BDNF基因表達的研究較多，如ZHENG等[7]對14篇文獻進行meta分析，發(fā)現(xiàn)ASD患者外周血清和血漿中BDNF的表達水平明顯高于正常對照。但直接研究ASD患者BDNF基因啟動子的報道較少。BDNF甲基化異常與精神性疾病相關[8]，并且血液BDNF DNA甲基化可反映大腦BDNF DNA甲基化情況[9]。本研究通過檢測ASD患者外周血中BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)各CpG單元的甲基化水平，比較其與正常對照間的差異，探討ASD可能的發(fā)病機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 患者組來自深圳市兒童醫(yī)院心理科及言語治療科門診ASD患兒，收集時間為2015 年7～12月。納入標準：①根據(jù)國際最新診斷標準，即《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第5版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,5th Edition，DSM-5），診斷為ASD“需要非常多支持”的患兒；②年齡＜14歲；③性別不限。排除標準：①患有其他精神疾?。ㄈ缇穹至寻Y等）；②患有其他神經(jīng)發(fā)育障礙疾?。虎刍加羞z傳代謝性疾??；④患有嚴重神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及顱腦損傷史等重大軀體疾病史。共收集12例患兒，男7例，女5例；年齡2～6歲，平均（3.3±1.4）歲。

對照組來自深圳市兒童醫(yī)院兒保科體檢兒童。納入標準：①無精神疾病，身體健康；②與患者組年齡及性別匹配。排除標準同患者組。共收集12名對照兒童，男7名，女5名；年齡1～6歲，平均（3.1±2.3）歲。

兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。所有入組兒童家長對本研究知情并簽署知情同意書。本研究經(jīng)深圳市兒童醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 血液采集和DNA提取 患者組和對照組兒童均于清晨抽取空腹靜脈血3 mL于EDTA抗凝管（BD公司，美國）中，保存于-80℃冰箱，然后使用血液DNA提取試劑盒OMEGA D3392（Omega Bio-Tek公司，美國）提取全血中的DNA。

1.3 甲基化檢測及質(zhì)控 通過UCSC網(wǎng)站（http:// genome.ucsc.edu/）查詢BDNF基因啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)的序列，其中Ⅰ區(qū)位置為chr11:27 744 025-27 744 279，共計255 bp，Ⅳ區(qū)位置為chr11:27 723 096-27 723 467，共計 372 bp。然后利用 Epi－Designer軟件（Sequenom公司，美國）設計引物，BDNF基因啟動子Ⅰ區(qū)正向和反向引物分別為5’-TGGGTTATGGTTTTTTAAATGTGAG-3’和5’-CC CTCTATTAAACACTCCAAAAAAA-3’，Ⅳ區(qū)正向和反向引物分別為5’-GGTAGAGGTAGGGAGATTTTATGTT-3’和5’-CCTACCCCCACTCTAATTAAAA CAA-3’，確定可檢測的區(qū)段，并進行引物合成（Thermo Fisher公司，美國）。甲基化檢測之前，先利用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Thermo Fisher公司，美國）進行DNA定量檢測，并統(tǒng)一將DNA稀釋至 50 ng/μL，加入 96孔板。利用 EZ DNA Methylation Gold Kit（Zymo Research公司，美國），參照試劑盒說明對待測DNA樣本進行亞硫酸氫鹽（bisulfite）處理和PCR擴增。PCR為5 μL反應體系，包括ddH2O 1.42 μL，配有20 mmol/L MgCl2的10×PCRBuffer0.50μL，dNTP0.040μL，酶0.04μL，正反向引物2 μL，待檢測DNA 1 μL。反應條件為95℃預變性4 min；95℃變性20 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共45個循環(huán)；72℃保持3 min；25℃靜置。得到的PCR產(chǎn)物通過Mass ARRAY（Sequenome公司，美國）進行DNA甲基化定量檢測，其原理是基于基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）反應，檢測CpG位點甲基化發(fā)生情況，然后通過MassARRAY系統(tǒng)自帶的Epi－Typer軟件v1.2得到甲基化率數(shù)據(jù)。具體過程：首先，EpiTyper軟件會根據(jù)該區(qū)域的CpG數(shù)量，分別編號，即得到CpG位點CpG_1,_2,…，如果多個CpG位點不能被檢測到，或者檢測到的CpG位點是連續(xù)的，即編號為CpG單元，如CpG_1.2，然后根據(jù)質(zhì)譜峰圖判斷CpG單元甲基化率。能檢測出CpG單元甲基化率的樣本占所有樣本的比例為檢出率。質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)控利用EpiTyper軟件v1.2（Sequenome公司，美國）完成，檢出率低于90%的CpG單元為低質(zhì)量CpG單元，不納入后續(xù)統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用R語言包進行統(tǒng)計分析。針對ASD患者組和對照組檢測到的BDNF基因啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)各CpG單元甲基化率水平，利用兩獨立樣本單邊秩和檢驗（Wilcoxon檢驗）進行組間比較。參考患者和對照BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)CpG單元的甲基化率數(shù)值，利用Heatmap函數(shù)繪制BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)CpG單元甲基化模式熱圖。所有被試BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)CpG單元甲基化率數(shù)據(jù)的相關性距離分析采用Pearson相關分析，具體過程是，先通過（1-甲基化單元之間的Pearson相關系數(shù)）做轉(zhuǎn)換，然后用R 的dist函數(shù)計算距離，即dist(1-cor)，其中cor為甲基化單元之間的Pearson相關系數(shù)，然后進行Heatmap展示，BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)各CpG單元的進化關系通過所有樣本的相關性距離數(shù)值進行聚類分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)CpG單元檢測率BDNF基因啟動子Ⅰ區(qū)90%以上檢出率的CpG單元數(shù)為17個；BDNF啟動子Ⅳ區(qū)90%以上檢出率的CpG單元數(shù)為8個。甲基化率情況見表1。

2.2 BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)各CpG單元甲基化率相關性距離分析 BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)各CpG單元甲基化率相關性分析結(jié)果見圖1。BDNF啟動子Ⅰ區(qū)中，CpG單元4、7、10、35相關性距離較近，CpG單元3、11相關性距離也較近；BDNF啟動子Ⅳ區(qū)中，CpG單元1.2，11.12相關性距離較近，CpG單元11.12和5.6相關性距離較近。

圖1 BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)各CpG單元相關性距離熱圖 A為BDNF啟動子Ⅰ區(qū)各CpG單元甲基化率相關性距離，B為BDNF啟動子Ⅳ區(qū)各CpG單元甲基化率相關性距離。各圖左上為相關性距離變量的Z尺度標準化；熱圖中紅色代表近的相關性距離，藍色代表遠的相關性距離；一個方格代表一個相關性距離數(shù)值。

2.3 BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)CpG單元甲基化進化關系圖 BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)各CpG單元聚類分析結(jié)果見圖2。BDNF啟動子Ⅰ區(qū)中CpG單元聚成3個大的分支，如CpG單元4、7、10、35聚為一個分支，CpG單元22.23.24、5.6、11和3聚為一個大的分支，CpG單元 8.9、31、25、26、16、28.29.30、33.34、1.2和27聚為另一個大的分支。而BDNF啟動子Ⅳ區(qū)中各CpG單元沒有聚類成大的分支，但可以看出，CpG單元11.12與1.2聚為一個小的分支，CpG單元9.10與14聚為一個小的分支，CpG單元11.12與1.2聚為一個小的分支，CpG單元15與18聚為一個小的分支。

2.4 患者組和對照組BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)CpG單元甲基化差異 BDNF啟動子Ⅰ區(qū)CpG單元5.6甲基化率患者組低于對照組（W=43，P= 0.049），其他各CpG單元在患者組和對照組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；BDNF啟動子Ⅳ區(qū)中，CpG單元3（W=103，P=0.039）和CpG單元15（W=102，P=0.041）在ASD患者組和對照組間差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

圖2 BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)CpG各單元甲基化進化關系圖 A為BDNF啟動子Ⅰ區(qū)各CpG單元甲基化率進化關系，3種不同的顏色代表3個大的分支；B為BDNF啟動子Ⅳ區(qū)各CpG單元甲基化率進化關系，未發(fā)現(xiàn)明顯大的分支，只標注為黑色。

表1 患者組和對照組BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)各CpG單元甲基化率（±s）

表1 患者組和對照組BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)各CpG單元甲基化率（±s）

1）與對照組比較，經(jīng)兩獨立樣本單邊秩和檢驗（Wilcoxon檢驗），P＜0.05

BDNF啟動子Ⅰ區(qū)組別 n患者組對照組12 12 CpG_1.2 0.164±0.060 0.138±0.032 CpG_3 0.059±0.025 0.053±0.033 CpG_4 0.049±0.038 0.068±0.048 CpG_5.6 0.052±0.0371)0.078±0.026 CpG_7 0.049±0.038 0.068±0.048 CpG_8.9 0.098±0.041 0.110±0.040 CpG_10 0.049±0.038 0.068±0.048 CpG_11 0.059±0.025 0.053±0.033 BDNF啟動子Ⅰ區(qū)組別患者組對照組CpG_16 0.058±0.034 0.057±0.029 CpG_22.23.24 0.016±0.018 0.015±0.018 CpG_25 0.041±0.030 0.050±0.019 CpG_26 0.051±0.026 0.053±0.029 CpG_27 0.047±0.030 0.031±0.027 CpG_28.29.30 0.109±0.042 0.125±0.051 CpG_31 0.055±0.025 0.060±0.028 CpG_33.34 0.060±0.018 0.063±0.021 BDNF啟動子Ⅳ區(qū)組別BDNF啟動子Ⅰ區(qū)患者組對照組CpG_35 0.049±0.038 0.068±0.048 CpG_1.2 0.069±0.012 0.072±0.019 CpG_3 0.205±0.0771)0.160±0.046 CpG_5.6 0.123±0.026 0.114±0.038 CpG_8 0.032±0.021 0.027±0.009 CpG_9.10 0.038±0.013 0.038±0.013 CpG_11.12 0.108±0.022 0.162±0.124 CpG_14 0.000±0.000 0.011±0.021 CpG_15 0.057±0.0211)0.043±0.012

3 討論

BDNF是一個重要的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育調(diào)控因子，其表達異常與多種神經(jīng)和精神性疾病相關[10]。大量的研究表明，ASD患者BDNF水平較高[11]。本研究通過MassArray檢測12例ASD患者和12名對照BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)的甲基化率，發(fā)現(xiàn)BDNF啟動子Ⅰ區(qū)CpG單元4、7、10、35，及BDNF啟動子Ⅳ區(qū)中CpG單元1.2、11.12甲基化率相關性距離較近，同時也能很好地聚類到一個小的分支，說明可能其接受比較相似的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)ASD患者BDNF啟動子Ⅰ區(qū)CpG單元5.6甲基化率顯著低于對照組，Ⅳ區(qū)CpG單元3和15甲基化率顯著高于對照組。ZHENG等[7]大規(guī)模的meta分析發(fā)現(xiàn)ASD患者血清或者血漿中存在較低的BDNF表達水平，本研究很好地支持了該結(jié)果。BDNF基因啟動子區(qū)甲基化水平，是抑郁癥診斷的標志物，如FUCHIKAMI等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者外周血BDNF啟動子Ⅰ區(qū)的35個CpG單元中有29個甲基化水平顯著低于正常對照。同時，BDNF啟動子區(qū)甲基化水平與精神疾病治療效果相關，D'ADDARIO等[13]研究發(fā)現(xiàn)重性抑郁障礙患者BDNF啟動子Ⅰ甲基化水平高于正常對照，當患者使用心境穩(wěn)定劑后，其BDNF啟動子Ⅰ甲基化水平則顯著降低。但是關于ASD患者BDNF啟動子甲基化研究不多，本研究發(fā)現(xiàn)在ASD患者和對照BDNF啟動子區(qū)中也存在差異顯著的CpG單元，說明ASD患者和對照組可能BDNF基因表達有差異，并且提示可以深入評估如BDNF啟動子Ⅰ區(qū)CpG單元5.6及Ⅳ區(qū)CpG單元3和15是否可作為ASD潛在的標志物。

本研究采用的MassArray技術能進行單堿基水平甲基化檢測，有很高的精度性和準確性。但本研究也有一定的局限性，如樣本量較小，這個主要是由于MassArray甲基化檢測技術成本相對較高所致。下一步可以對發(fā)現(xiàn)差異的甲基化單元，如將BDNF啟動子Ⅰ區(qū)CpG單元5.6甲及Ⅳ區(qū)CpG單元3和15在大樣本中進行驗證，或者進行功能研究，如利用細胞模型或者動物模型來研究BDNF啟動子Ⅰ區(qū)和Ⅳ區(qū)甲基化是否影響B(tài)DNF基因的表達，以探索BDNF甲基化參與ASD發(fā)病的具體機制。

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The study on the association of the methylation in the promoter region of brain derived neurotrophic factor with autism spectrum disorders.

ZHOU Jiaxiu,DING Ming,CUI Dong,ZHANG Linlin,ZHOU Zhenhui,QIN Shanggou, LIAO Ruqin,WANG Yan,HE Fusheng,YANG Feng,WANG Mingbang.Autism Genome Research Center,Shenzhen Following Precision Medical Research Institute,Guangdong,518001,China.Tel:0755-82636223.

Objective The aim of present study was to detect methylation rate of CpG unit of brain derived neurotrophic factor (BDNF)promoter and to study the epigenetic mechanism of autism spectrum disorders(ASD). Methods Total of 12 ASD patients and 12 healthy controls were recruited.The methylation rate of CpG unit in BDNF promoterⅠandⅣwere detected using Sequenom MassArray method.The methylation model,correlationship,evolutionary relationship of CpG units in BDNF promoterⅠandⅣwere detected and compared between ASD patients and healthy controls.Results The methylation rate was identified in 17 and 8 CpG units in BDNF promoterⅠand BDNF promoter Ⅳ.A close correlation distance was detected in BDNF promoterⅠCpG units 4,7,10,35,and BDNF promoterⅣCpG units 11.12,14.BDNF promoterⅠ CpG units 4,7,10,35,and BDNF promoterⅣ CpG units 11.12,14 could beclustered.ASD patients had a significant lower methylation rate in BDNF promoterⅠCpG unit 5.6 andⅣCpG units 3 and 15 compare with healthy controls(P＜0.05).Conclusions The DNA methylation rate in BDNF promoterⅠCpG unit 5.6 andⅣCpG units 3 and 15 may be used as potential biomarkers of ASD.

Autism Spectrum Disordersbrain derived neurotrophic factorPromoterMethylation rate

R749.93

A

2016-10-23)

(責任編輯：肖雅妮)

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.02.008

☆深圳市科創(chuàng)委基礎研究項目（編號：JCYJ20130401114111453）；深圳市科技創(chuàng)新委員會基礎研究項目（編號：JCYJ20140416141331555）

* 廣東省深圳市兒童醫(yī)院心理科（深圳518038）

** 廣東省深圳市兒童醫(yī)院科教科

*** 廣東省深圳市兒童醫(yī)院兒科研究所

**** 廣東省深圳市兒童醫(yī)院言語治療科

△ 深圳市眾循精準醫(yī)學研究院，自閉癥基因組研究所