傳統(tǒng)藏藥渣馴丸對(duì)四氯化碳引起小鼠急性盯損傷的保護(hù)作用

索南鄧登　童麗　熱增才旦等

摘要：目的探討渣馴丸對(duì)CCl4引起小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法將60只昆明種雄性小鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組、渣馴丸高、中、低劑量組（1.00g/kg）、（0.50g/kg）、（0.25/kg）。給藥組給予渣馴丸灌胃，每天灌胃兩次，連續(xù)6 d，正常對(duì)照組和CCl4模型組給予等體積生理鹽水灌胃。在第6 d灌胃末次給藥兩小時(shí)后，除正常對(duì)照組外，其余組均腹腔注射0.1%CCl4石蠟油溶液并在24 h后取材，檢測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活力以及肝組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）的活力及含量。結(jié)果渣馴丸小劑量組與CCl4模型組相比，血清中ALT、AST的含量明顯降低（P

關(guān)鍵詞：藏藥；渣馴丸；急性肝損傷；抗氧化；四氯化碳

隨著社會(huì)的發(fā)展，肝臟的功能受多種因素的影響，容易造成酒精肝、脂肪肝、肝臟纖維化、肝硬化、甚至肝癌等嚴(yán)重疾病。所以肝保護(hù)成了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中急需解決的課題。四氯化碳在多項(xiàng)誘導(dǎo)藥物中是最為經(jīng)典的一種。研究表明，小鼠CCl4急性肝損傷動(dòng)物模型是經(jīng)典的氧化性肝損傷動(dòng)物模型之一。傳統(tǒng)藏藥渣馴丸，為常用藏藥制劑，收藏于藏醫(yī)典籍和文獻(xiàn)資料，其應(yīng)用已有1300多年歷史的，具有廣泛的民間用藥基礎(chǔ)。渣馴丸由渣馴膏、紅花、木香、訶子（去核）、甘青青蘭藥味組成，具有清肝熱的功效，主要用于慢性肝炎、乙型肝炎等。本實(shí)驗(yàn)研究根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及傳統(tǒng)醫(yī)藥在肝損傷中研究進(jìn)展作為其立題依據(jù)，探討渣馴丸對(duì)四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的的影響。建立正確而有效的動(dòng)物模型，以ALT，AST，MDA，SOD等指標(biāo)來觀察，從而進(jìn)一步了解機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供可靠的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.資料與方法

1.1一般資料 藏藥渣馴丸：購自青海省藏醫(yī)院（批號(hào)：20070126）；超氧化物岐化酶（SOD，批號(hào)：FGDJ2014071556）；丙二醛（MDA，批號(hào)：GDJ2014071009）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，批號(hào)：EXCl4070992）門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST，批號(hào)：ECTl4070992）；考馬斯亮蘭總蛋白定量（批號(hào)：BXCl4070112）均購自南京建成生物研究；

1.2儀器 SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司），DZF-150型恒溫真空干燥箱（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），DNM-9602酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），R2060旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司），HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱（金壇市科技儀器有限公司），4-M-4型超聲振蕩器（昆山市超聲儀器有限公司），SUNRISE分光光度計(jì)（日本日立株式會(huì)社），HHHS-65型電熱恒溫水浴箱（上海衡平器儀表廠），HITACHI U-1900離心機(jī)（金壇市科析儀器有限公司），BT224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

1.3動(dòng)物 8 w齡昆明種小鼠70只，雄性，體重（20_+2）g，購自甘肅蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院（合格證號(hào)；SCXK-（甘）2013-0002）。分籠飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：光照明暗12 h交替，自由飲水，溫度：（23±2）℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.4方法

1.4.1藥物提取 取100 g渣馴丸研磨成粉末，加入1000 ml的蒸餾水，煎煮15 min，過濾，連續(xù)兩次，合并濾液、濃縮濾液至100 ml，得到渣馴丸提取液（含生藥1 g/ml），4℃保存。

1.4.2動(dòng)物分組 小鼠70只，隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、陽性組（聯(lián)苯雙酯，150 mg/kg）、渣馴丸高（1.00 g/kg）、中（0.50g/ks）、低（0.25 g/kg）劑量組，每組10只，雌雄各半。

1.4.3給藥方法 給藥組每日灌胃給藥，空白組與模型組給予等體積生理鹽水，劑量0.2 ml/10 g，2次，d，連續(xù)14 d。

1.4.4動(dòng)物造模 在給藥2 h后，除正常對(duì)照組外，其余各組均腹腔注射0.1%CCl4石蠟油溶液（5 ml/kg）。

1.4.5血清中AST和ALT的檢測(cè) 在腹腔注射0.1%CCl4石蠟油溶液24 h后，摘眼球取血，得到的血液離心10 min，2500 r/min，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中的AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）和ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）的含量。

1.4.6肝臟組織中抗氧化酶活力檢測(cè) 在摘眼球取血完成后，脊椎脫臼處死動(dòng)物，剖取小鼠肝臟，制備20%肝組織勻漿，2500 r/min，離心15 min。參照試劑盒方法檢測(cè)上清中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的活力及含量。

1.4.7肝組織形態(tài)學(xué)檢查 在摘眼球取血完成后，脊椎脫臼處死動(dòng)物，剖取小鼠肝臟，取右外側(cè)葉用生理鹽水沖洗干凈，立即放入10%中性甲醛溶液固定。進(jìn)行包埋處理，切片厚度為4um，HE染色，顯微鏡觀察肝組織形態(tài)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，若方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2.結(jié)果

2.1渣馴丸對(duì)CCl4引起急性肝損傷小鼠血清ALT、AST含量的影響 結(jié)果顯示，渣馴丸小劑量組能降低CCl4引起急性肝損傷小鼠血清ALT的含量（P<0.05），渣馴丸小劑量與中劑量組能夠升高AST的含量（P<0.05），見表1。

2.2渣馴丸對(duì)CCl4引起急性肝損傷小鼠血清抗氧化酶活力的影響 結(jié)果顯示，模型組SOD活力降低，說明造模成功，渣馴丸小劑量組對(duì)SOD的活力升高（P<0.05），但渣馴丸大劑量組能夠降低肝損傷小鼠MDA含量（P<0.05），見表2。

2.3渣馴丸對(duì)CCl4引起急性肝損傷小鼠肝臟及腎臟形態(tài)學(xué)觀察，肝臟形態(tài)學(xué)觀察，見圖1、圖2、圖5、圖6；腎臟形態(tài)學(xué)觀察，見圖3、圖4、圖7、圖8。

3.討論

本實(shí)驗(yàn)研究了藏藥渣馴丸對(duì)CCl4引起急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用，CCl4是經(jīng)典的誘導(dǎo)肝損傷的方法之一，CCl4經(jīng)肝臟中的代謝酶CYP450代謝后產(chǎn)生一系列的氧自由基，加劇脂質(zhì)代謝，產(chǎn)生大量MDA。所以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化活性是保護(hù)肝臟的重要途徑之一，倪琳嗍等人分離測(cè)定了渣馴丸中主要的成分羥基紅花黃素A、沒食子酸、馬兜鈴酸A的含量。這幾種有效成分具有抑制細(xì)胞凋亡、抗腫瘤等作用，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了肝損傷小鼠的SOD活力和MDA含量，SOD與MDA是反應(yīng)機(jī)體抗氧化能力的經(jīng)典指標(biāo)，SOD能夠減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，維持自由基平衡。MDA引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變釋放出大量的AST及ALT，因此測(cè)定血清中兩者的含量有重要意義。藏藥渣馴丸小劑量組能夠增強(qiáng)SOD的活力（P<0.05）。降低了ALT的含量，大劑量組能夠降低MDA的含量（P<0.05）。電鏡觀察顯示渣馴丸對(duì)CCl4引起急性肝損傷小鼠肝臟及腎臟形態(tài)學(xué)觀察，應(yīng)用CCl4后，小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯受損，渣馴丸各劑量組對(duì)肝細(xì)胞均有不同程度的保護(hù)作用。

藏藥復(fù)方成分不明，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以確定是藏藥發(fā)展的瓶頸，實(shí)驗(yàn)中大小劑量組所反映的指標(biāo)說明藏藥渣馴丸對(duì)肝損傷具有一定的量效關(guān)系，其機(jī)制不明，值得進(jìn)一步研究。