內(nèi)源性一氧化碳對心肌缺血再灌注損傷的影響*

周 振，張 昱，紀(jì)巧榮，劉 杰，曹成珠，高 翔，張 偉

(青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心；青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室，青海 西寧 810001)

內(nèi)源性一氧化碳對心肌缺血再灌注損傷的影響*

周 振，張 昱，紀(jì)巧榮，劉 杰，曹成珠，高 翔，張 偉△

(青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心；青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室，青海 西寧 810001)

目的 研究內(nèi)源性一氧化碳對大鼠離體心臟心肌缺血再灌注損傷的影響。方法 大鼠經(jīng)內(nèi)源性一氧化碳激動藥物原卟啉氯化鈷(CoPP)處理后，采用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)制作心肌缺血再灌注實驗?zāi)Ｐ?，采集記錄離體心臟穩(wěn)定期和缺血30 min再灌注時的左室收縮終末壓(LVESP)、左心室舒張終末壓(LVEDP)、心率(HR)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室最大收縮速率(+dP/dtmax)和左室最大舒張速率(-dP/dtmax)等心功能指標(biāo)，探討內(nèi)源性一氧化碳對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。結(jié)果 在停灌前穩(wěn)定期，對照組和藥物組心臟各項指標(biāo)均保持平穩(wěn)，兩組間指標(biāo)無顯著性差異；停灌30 min后復(fù)灌，對照組較未停灌前心功能各項指標(biāo)明顯下降，且變化較大，對心臟的舒縮功能影響較大，該組比停灌前LVESP下降了19.8%，+dP/dtmax下降了28.5%，-dP/dtmax的絕對值下降了33.6%，差異均具有顯著性(P<0.05)。而藥物組復(fù)灌后各項心功能指標(biāo)變化較小，仍保持著停灌前的平穩(wěn)水平，對心臟的舒縮功能影響較小，且復(fù)灌后達(dá)到穩(wěn)定所用的時間較對照組明顯縮短(P<0.05)。結(jié)論 內(nèi)源性一氧化碳對正常情況下心室的舒縮功能影響不大，但對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

內(nèi)源性一氧化碳 缺血再灌注損傷 Langendoreff心臟離體灌流 心臟舒縮功能

一氧化碳(Carbon Monoxide，CO)被認(rèn)為是一種能高度結(jié)合血紅蛋白從而使機(jī)體嚴(yán)重缺氧的高毒性物質(zhì)[1]，然而近些年的研究發(fā)現(xiàn)，一氧化碳在體內(nèi)又是一種重要的內(nèi)源性氣體分子，調(diào)節(jié)著眾多生理和病理生理過程，并且在心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等許多系統(tǒng)中起著重要的作用。[2-3]體內(nèi)的一氧化碳是血紅素氧合酶(Heme Oxygenase，HO)分解血紅素得到的產(chǎn)物，已經(jīng)有許多研究發(fā)現(xiàn)血紅素通過血紅素氧和酶分解之后能產(chǎn)生許多對機(jī)體有益的物質(zhì)[4]，內(nèi)源性一氧化碳(Endogenous Carbon Monoxide)就是其中之一，其對于機(jī)體具有的保護(hù)作用也已被證實[5]，但對心肌發(fā)生的缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用尚未證實。本研究利用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)觀察內(nèi)源性一氧化碳激動劑CoPP干預(yù)下心肌缺血再灌注損傷模型的各項心功能指標(biāo)，探討內(nèi)源性一氧化碳對心肌缺血再灌注損傷的影響，為心肌的缺血性保護(hù)提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用SPF級Wistar雄性成年大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK(京)2012-0001，NO.11400700064575]。每組9只，體重251±9.4 g，大鼠置于23 ℃、晝/夜交替、自由采水和食物的條件下飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥品和試劑

實驗用K-H液配制如下，NaCl 6.966 g/L，KCl 0.3653 g/L，CaCl20.2725 g/L，KH2PO40.1633 g/L，MgSO4·7H2O 0.2958 g/L，NaHCO32.1003 g/L，葡萄糖2.199 g/L，調(diào)節(jié)pH于7.3～7.4之間，藥品均購自Sigma公司，由超純水配制而成。麻醉劑選用烏拉坦(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號T20090811)，用生理鹽水配制成20%的溶液，即配即用(0.08ml/100g)。原卟啉氯化鈷(CoPP)購自Sigma公司(C1900，MW：655.03)，用1N NaOH溶液溶解后稀鹽酸調(diào)至pH 7.4，再用生理鹽水稀釋到目標(biāo)體積。

1.3 實驗儀器

選用澳大利亞AD公司Langendorff心臟灌流系統(tǒng)(AD Instrument，Australia)，包括Powerlab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)、壓力傳感器、蠕動泵、聚乙烯導(dǎo)管及乳膠球囊等全套裝備。

1.4 Langendorff離體心臟灌流模型

藥物組大鼠在實驗進(jìn)行前24 h腹腔注射內(nèi)源性一氧化碳的激動劑CoPP(5mg/kg)[6]，24 h后腹腔注射20%烏拉坦(40mg/kg，i.p)，開胸取出心臟，置于4 ℃ K-H液中，分離出升主動脈后清除干凈心臟內(nèi)殘留血液，將灌注針固定到升主動脈后迅速懸掛固定于Langendorff離體灌注裝置上，持續(xù)通入95% O2和5% CO2混合氣體的K-H液行常規(guī)恒壓(40～60mmHg)灌流。剪開左心耳，將連接有壓力傳感器的心室球囊通過左心耳置入左心室，并將球囊內(nèi)壓力維持在5～9 mmHg[7]，連接Powerlab信號采集器，采集記錄離體心臟左室收縮終末壓(1eft ventricularend-systolic pressure，LVESP)、左心室舒張終末壓(1eft ventricularend-diastolic pressure，LVEDP)、心率(heart rate，HR)、左室發(fā)展壓(1eft ventricular developed pressure，LVDP)、左室最大收縮速率(+dP/dtmax)和左室最大舒張速率(-dP/dtmax)[8]。

對照組取心臟前不做處理，麻醉后進(jìn)行離體心臟灌注，步驟同上。

1.5 離體心臟缺血再灌注損傷模型

待心臟搏動穩(wěn)定后記錄停灌前穩(wěn)定期30 min各項數(shù)據(jù)，停止灌流30 min即刻復(fù)灌，待心臟恢復(fù)跳動記錄30 min的復(fù)灌后各項指標(biāo)[9]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用t檢驗，組內(nèi)不同時間點比較選用LSD法，灌注前后比較選用配對t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 離體心臟各時期心室生理學(xué)指標(biāo)的變化情況(圖1～3，表1～3)

圖1 缺血再灌注時心室各生理學(xué)指標(biāo)的變化描記圖
Figure 1 The representative recordings of the ventricular function index in ischemic reperfusion

圖2 停灌前各生理學(xué)指標(biāo)的變化趨勢圖Figure 2 The summary of the changes in mean cardiac function index before ischemic reperfusion

圖3 復(fù)灌后各生理學(xué)指標(biāo)的變化趨勢圖Figure 3 The summary of the changes in mean cardiac function index after ischemic reperfusion

表1 停灌前不同時間段各生理學(xué)指標(biāo)的變化情況±s)Table 1 The changes in mean cardiac function index fromdifferenttimesbefore ischemic ±s)

續(xù)表：

表2 復(fù)灌后不同時間段各生理學(xué)指標(biāo)的變化情況±s)Table 2 the changes in mean cardiac function index fromdifferenttimesafterischemic ±s)

*：表示與對照組比較，P<0.05；#：表示與起始點比較，P<0.05.

圖1～2和表1顯示，停灌前穩(wěn)定期對照組和藥物組心臟LVESP、LVEDP、LVDP、左室±dP/dtmax變化趨勢一致，每一時間段之間差異不顯著，HR和FP始終保持穩(wěn)定。

圖1、3和表2顯示，缺血再灌注后，對照組心臟各舒縮指標(biāo)明顯下降，和停灌前相比LVESP下降了19.8%，+dP/dtmax下降了28.5%，-dP/dtmax的絕對值下降了33.6%，均有顯著性差異(P<0.05)，但隨時間的變化舒縮指標(biāo)也呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，10 min后的上述指標(biāo)較復(fù)灌起始點出現(xiàn)明顯差異(P<0.05)，HR波動較大，尤其在15 min后，差異顯著(P<0.05)，F(xiàn)P始終保持穩(wěn)定、變化不明顯。與對照組相比，藥物組各項心臟指標(biāo)在缺血再灌注前后相對平穩(wěn)，能保持不變，尤其在缺血再灌注后心臟能保持較穩(wěn)定的搏動狀態(tài)。

2.2 心臟生理學(xué)指標(biāo)變化結(jié)果(表3)

表3 心臟在灌注前后各生理學(xué)指標(biāo)的變化情況±s)Table 3 Changes in cardiac perfusion and reperfusion process in various physiological ±s)

▲：表示與對照組比較，P<0.05.

表3顯示，對照組停灌前后各項心臟功能指標(biāo)均具有顯著差異(P<0.05)，而藥物組停灌前后各項指標(biāo)沒有顯著性差異。與對照組相比，藥物組在停灌前后HR均較低，其他指標(biāo)沒有顯著性差異；由于藥物組在缺血再灌注后各項心功能指標(biāo)未出現(xiàn)明顯改變，所以與對照組相比，除FP外其他指標(biāo)均有顯著性差異(P<0.05)；缺血再灌注后，對照組灌注壓明顯上升，說明缺血再灌注影響了對照組心臟的順應(yīng)性。

2.3 復(fù)灌恢復(fù)穩(wěn)定時間

在缺血再灌注損傷發(fā)生后，心肌或多或少地出現(xiàn)了功能上的障礙，而復(fù)灌后恢復(fù)穩(wěn)定所需要的時間是衡量心臟受損的一個重要指標(biāo)。與對照組相比，藥物組復(fù)灌恢復(fù)穩(wěn)定時間為4.2±1.0 min，比對照組的8.1±1.4 min明顯縮短，差異有顯著性(t=4.26，P<0.05)，藥物組在復(fù)灌時能更快的進(jìn)入穩(wěn)定期。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是冠心病、溶栓治療，器官再植等疾病治療中常見的臨床現(xiàn)象，但是缺少有效治療和預(yù)防手段。內(nèi)源性一氧化碳作為一種重要的氣體信號分子，可通過血紅素氧和酶-1產(chǎn)生，同時內(nèi)源性一氧化碳還能減少細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，并且具有抗氧化活性[10]。故研究內(nèi)源性一氧化碳和血紅素代謝產(chǎn)物是否對心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用具有重要的意義，也可為今后心肌缺血再灌注損傷的治療提供切實、有效的理論依據(jù)。

本實驗采用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)建立心肌缺血再灌注模型，討論內(nèi)源性一氧化碳對心肌缺血再灌注損傷的影響。其中，離體心臟灌流能使心臟脫離體內(nèi)神經(jīng)及體液因素的干擾，一方面能單純地反映藥物對心肌舒縮的直接影響，另一方面還能較好地反映心臟在受到缺血再灌注損傷后各個時段舒縮功能的變化[11]。因此，Langendorff灌流裝置能夠較好體現(xiàn)內(nèi)源性一氧化碳對心肌缺血再灌注前后心臟舒縮功能的影響與調(diào)節(jié)作用，并且通過左心室放置的球囊能同步檢測心臟各項指標(biāo)的變化情況。LVESP、±dP/dtmax、LVDP等是反映Langendorff離體心臟左心室舒縮功能的主要指標(biāo)，這四項指標(biāo)的數(shù)值高低反映了左心室的舒縮功能強(qiáng)弱，在發(fā)生心肌缺血再灌注之后，上述心功能指標(biāo)的變化說明了心室舒縮功能受影響的高低[12]。

通過本次實驗結(jié)果可以看出，對照組和藥物組在缺血再灌注前穩(wěn)定期的主要心臟功能指標(biāo)沒有大的差異，說明內(nèi)源性一氧化碳對正常情況下心室的舒縮功能影響較小，而在缺血再灌注后兩組之間的心臟舒縮功能發(fā)生了明顯的差異，對照組LVESP、±dP/dtmax和LVDP等心功能指標(biāo)均下降，而藥物組仍然保持了停灌前的平穩(wěn)水平，這說明內(nèi)源性一氧化碳能維持穩(wěn)定停灌后心臟舒縮功能，其對心肌的缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。與此同時，對照組的FP在復(fù)灌后高于停灌注前的水平，這可能是由于心肌缺血再灌注損傷發(fā)生后影響了心臟內(nèi)的微循環(huán)和組織結(jié)構(gòu)，使得心臟的順應(yīng)性降低、僵硬度增加，其FP升高勢必會影響心室的舒縮功能。另外，在復(fù)灌的最初階段，藥物組復(fù)灌穩(wěn)定所需要的時間明顯低于對照組，這也可說明內(nèi)源性的一氧化碳能保護(hù)停灌后處于缺血、缺氧的心肌組織，能較好地維持心臟的微循環(huán)和組織細(xì)胞，改善心臟的組織結(jié)構(gòu)和順應(yīng)性，表現(xiàn)出復(fù)灌后心臟舒縮功能的快速恢復(fù)和FP的穩(wěn)定。

本研究應(yīng)用了內(nèi)源性一氧化碳激動劑CoPP，這種藥物可以促進(jìn)HO-1分解血紅素產(chǎn)生一氧化碳，從而使得體內(nèi)內(nèi)源性一氧化碳含量增加，尤其是在肝臟和心臟[13]等血液供應(yīng)充足的器官。通過實驗結(jié)果可以看出，使用內(nèi)源性一氧化碳激動劑的大鼠離體心臟舒縮功能均可保持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，即使發(fā)生缺血再灌注損傷后仍保持了停灌前的穩(wěn)定狀態(tài)，無論是停灌前還是復(fù)灌后，藥物組心臟的舒縮功能指標(biāo)始終保持在一個較平穩(wěn)的水平，這可能與內(nèi)源性一氧化碳能降低心肌細(xì)胞Ca2+內(nèi)流、減少鈣超載等作用[14]有關(guān)。另外，藥物組停灌前后的HR雖保持平穩(wěn)，但始終低于對照組，這也可能是因為內(nèi)源性一氧化碳可通過心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的減少[15]使心室舒張延緩；而對照組在復(fù)灌后心率升高，這說明心肌在發(fā)生缺血再灌注損傷后出現(xiàn)了心肌細(xì)胞的鈣超載。心肌細(xì)胞短時間內(nèi)一定濃度的Ca2+異常增多，會使心臟二期平臺期縮短，從而使心動周期縮短、心率加快[16]。這也說明了增加體內(nèi)內(nèi)源性的一氧化碳對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，一氧化碳作為一種內(nèi)源性氣體分子，除了調(diào)節(jié)正常的生理活動外，其對心臟缺血性疾病可能具有至關(guān)重要的臨床作用。通過內(nèi)源性一氧化碳激動劑CoPP增加內(nèi)源性一氧化碳，能對心臟的收縮功能起到維持穩(wěn)定的作用，其具體的保護(hù)機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究闡明。

[1]潘曉雯.一氧化碳中毒與缺氧[J].中國實用內(nèi)科雜志，2001，21(3)：135-137.

[2]Brouard S，Otterbein L E，Anrather J，et al.Carbon Monoxide Generated by HemeOxygenase 1 Suppresses Endothelial Cell Apoptosis[J].Journal of Experimental Medicine，2000，192(7)：1015-1026.

[3]Motterlini R，Otterbein L E.The therapeutic potential of carbon monoxide[J].Nature Reviews Drug Discovery，2010，9(9)：728.

[4]肖鵬，高洪，嚴(yán)玉霖，等.內(nèi)源性一氧化碳研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30(5)：94-98.

[5]Ryter S W，Alam J，Choi A M.Heme Oxygenase-1/Carbon Monoxide：From Basic Science to Therapeutic Applications[J].Physiological Reviews，2006，86(2)：583.

[6]汪洋，杜友愛，徐和靖，等.HO-1在保護(hù)缺氧-復(fù)氧心臟中的作用及其機(jī)制研究[J].中國病理生理雜志，2006，22(6)：1087-1091.

[7]梁偉濤，Rusinkevich，Vitali，等.離體心臟Langendorff灌流模型穩(wěn)定性的探討[J].國際心血管病雜志，2011，38(1)：44-47.

[8]劉顯妮，劉永年，張偉.高原慢性低氧對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的影響[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014，35(1)：31-35.

[9]陳嬋娟，潘昡，趙明鏡，等.大鼠Langendroff離體心臟局部缺血再灌注模型建立及功能評價[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，23(12)：21-26.

[10]宮麗敏，杜軍保，趙衛(wèi)紅，等.內(nèi)源性一氧化碳調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[J].中國藥理學(xué)通報，2004，20(1)：28-32.

[11]王小曉，王幼平，余海濱，等.大鼠Langendorff離體心臟灌流模型的制備經(jīng)驗及其影響因素分析[J].中藥藥理與臨床，2014(6)：184-186.

[12]顏麗.紅景天甙對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究[D].南華大學(xué)，2007.

[13]劉璐，曹劍，黃鑫，等.上調(diào)血紅素氧合酶1對代謝綜合征大鼠心功能的影響及可能機(jī)制[J].中華老年心腦血管病雜志，2016，18(1)：67-70.

[14]Zhao S，Lin Q，Li H，et al.Carbon monoxide releasing molecule 2 attenuated ischemia/reperfusion induced apoptosis in cardiomyocytes via a mitochondrial pathway[J].Molecular Medicine Reports，2014，9(2)：754.

[15]梅迪森，杜友愛，汪洋，等.外源性一氧化碳分子釋放劑CORM-2對抗大鼠離體心臟缺血復(fù)灌損傷及其作用機(jī)制[J].浙江大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版，2007，36(3)：291-297.

[16]吳曉燕，苗琳，鄭蕊，等.心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2016，32(11)：1043-1045.

The effect of endogenous carbon monoxide on myocardial ischemia reperfusion injury*

ZHOU Zhen，ZHANG Yu，JI Qiao-rong，LUI Jie，CAO Cheng-zhu，GAO Xiang，ZHANG Wei△

(High altitude medical research center of Qinghai University； The Key Laboratory of high altitude medical application of Qinghai Province，Xining，Qinghai 810001)

Objective To explore the effect endogenous carbon monoxide on myocardial ischemia reperfusion injuryafter Cobalt Protoporphyrin(CoPP)treatment.Method The rats were treated with CoPP(Agonist of endogenous carbon monoxide).The myocardial ischemia reperfusion model was established by Langendorff isolated cardiac perfusion system.The 1eft ventricular systolicpressure(LVESP)，1eft ventricular end-diastolic pressure(LVEDP)，1eft ventricular developed pressure(LVDP)，the maximum rate of left ventricular pressure(±dP/dtmax)were obtained.Result Before reperfusion，all parameters remained stable in control group and CoPP group，and no significant difference between the two groups.After reperfusion，the control group’s cardiac function decreased significantly(P<0.05)，the LVESP decreased 19%，+dP/dtmaxdecreased 28.5% and -dP/dtmaxdecreased 33.6%.Compared with the control group，the CoPP group’s cardiac function did not change significantly，while still maintaining a relatively stable level.Conclusion The endogenous carbon monoxide has no effect on normal cardiac function，but it has positive effect on the cardiac abnormaldiastolic and systolic function，that protect the cardiac function from myocardial ischemia reperfusion injury.

Endogenous carbon monoxide Ischemia reperfusion injury Langendorff isolated cardiac perfusion system Cardiac diastolic and systolic function

*：國家自然基金項目(81560301；81160012)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才項目(NCET-12-1022)；△：通信作者，博導(dǎo)，教授，zw0228@sina.com 周振(1991～)，男，漢族，陜西籍，碩士研究生；

R363

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.006

2017-02-20