苦刺總生物堿對LPS誘導小鼠急性肺損傷的保護作用※

趙鵬飛，劉紹能，馬繼征

(1.青海省第四人民醫(yī)院 西寧 810000；2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京 100053)

苦刺總生物堿對LPS誘導小鼠急性肺損傷的保護作用※

趙鵬飛1，劉紹能2，馬繼征2

(1.青海省第四人民醫(yī)院 西寧 810000；2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京 100053)

目的 探討苦刺總生物堿對LPS所致急性肺損傷(ALI)模型小鼠的保護作用。方法 將小鼠分為空白組、模型對照組、地塞米松組、苦刺總生物堿低劑量組(46.65mg·kg-1)、苦刺總生物堿中劑量組(93.30mg·kg-1)、苦刺總生物堿高劑量組(186.60mg·kg-1)。各0受試藥物組按體重灌胃給予相應藥物(0.2mL·10g-1)，空白對照組與模型對照組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥7天。各組實驗動物禁食不禁水12小時，實驗當日，地塞米松組按體重腹腔注射給藥(0.1mL·10g-1)1次，末次給藥1小時后，除空白對照組小鼠腹腔注射等體積無菌生理鹽水外，其余各組均按體重腹腔注射LPS(0.1ml ·10g-1)制備小鼠ALI模型。12小時后各組均取血，分離血清，收集肺泡灌洗液(BALF)。檢測小鼠全血白細胞(WBC)計數及分類計數；肺指數；BALF中總蛋白含量；肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性；血清白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α( TNF-α) 含量，BALF中白介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量。計算小鼠肺濕/干重(W/D)。結果 苦刺總生物堿明顯降低ALI模型小鼠全血WBC水平，顯著升高小鼠淋巴細胞(LY)計數；顯著降低肺指數、肺W/D；明顯降低BALF中總蛋白的含量、肺組織 MPO活性，顯著降低血清IL-6、TNF-α含量及BALF中IL-1β、IL-10、MDA和NO的表達水平。結論 本研究結果顯示，苦刺總生物堿對LPS所致ALI小鼠急性肺損傷具有明顯保護作用，作用機制與抗氧化、抑制促炎因子的釋放有關。

苦刺 總生物堿 脂多糖 急性 肺 損傷 保護

前期研究表明，苦刺(Sphora vieiifolia Hance)總生物堿抗炎活性良好，主要表現為其可顯著降低二甲苯致小鼠耳腫脹度，降低醋酸致小鼠腹腔毛細血管的通透性。為進一步探討其對急性肺損傷是否存在影響及可能影響機制，本研究應用苦刺總生物堿對LPS所致急性肺損傷(ALI)模型小鼠開展相關研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物

苦刺經馬繼征博士鑒定為豆科槐屬植物苦刺(Sphora vieiifolia Hance)的干燥根，其質量符合《云南省中藥材標準(2005年版)》“白刺花根”項下相關標準。

1.1.2 實驗儀器、試劑

旋轉蒸發(fā)儀(型號：RE5203)，購自上海亞榮生化試劑廠；臺式循環(huán)水式多用真空泵(型號：SHB-Ⅲ)，購自鄭州長城有限公司；全波長多功能讀數儀(型號：Varioskan Flash)，購自美國Thermo公司；全自動血液分析儀(型號：MEK-8222K)，購自日本Nihon Kohden公司。冰醋酸(批號：20150304)、二甲苯(批號：20150907)，均購自重慶茂業(yè)化學試劑有限公司。地塞米松磷酸鈉注射劑(批號：1608042111)，購自福建南少林藥業(yè)有限公司；LPS(E.col：055：B5)(批號：L-2880)，購自Sigma公司。小鼠 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA 試劑盒(批號分別為：20151123、20151126、20151127、20151129)，均購自北京科盈美科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號：P0010S)，購于碧云天生物技術研究所；髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(批號：20150421)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號：20151225)、一氧化氮(NO)試劑盒(批號：20151207)，均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 實驗動物

昆明種小鼠，SPF級，雌雄各半，體重18～22 g，購于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，合格證號：SCXX(軍)2013-14。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦刺總生物堿的制備

取苦刺藥材，適當破碎，加8倍量70%乙醇加熱回流提取二次，每次50分鐘，合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，得粗浸膏，加入3倍體積量的2%鹽酸溶液，充分攪拌，靜置過夜，過濾，收集水溶液，加入氨試液調pH至10，用等量氯仿振搖提取三次，收集氯仿層，無水Na2SO4脫水，減壓回收氯仿，得脂溶性總生物堿；水相繼續(xù)加入等量水飽和的正丁醇振搖提取三次，減壓回收正丁醇，得水溶性總生物堿。脂溶性總生物堿和水溶性總生物堿之和即為總生物堿的量。經計算，總生物堿得率為3.11%。

供試藥物采用0.50%吐溫溶液配制，苦刺按成人(60kg)臨床日用量15 g計，實驗動物給藥劑量分別按人用臨床劑量的6、12、24倍，結合總生物堿出膏率進行換算，即為46.65、93.30、186.60 mg ·kg-1(提取物/體重)。

1.2.2 苦刺總生物堿對LPS所致小鼠急性肺損傷(ALI)模型的影響

1.2.2.1 實驗動物分組、給藥及ALI模型的建立

實驗動物按體重分層，隨機分為空白對照組、模型對照組、地塞米松組、苦刺總生物堿高劑量組(186.60mg·kg-1)、苦刺總生物堿中劑量組(93.30mg·kg-1)、苦刺總生物堿低劑量組(46.65mg·kg-1)，每組12只。各受試藥物組按體重灌胃給予相應藥物(0.2mL·10g-1)，空白對照組與模型對照組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥7天。各組實驗動物禁食不禁水12小時，實驗當日，地塞米松組按體重腹腔注射給藥(0.1mL·10g-1)1次，末次給藥1小時后，除空白對照組小鼠腹腔注射等體積無菌生理鹽水外，其余各組均按體重腹腔注射LPS(0.1mL·10g-1)制備小鼠ALI模型。

1.2.2.2 實驗指標

1.2.2.2.1 苦刺總堿對ALI小鼠全血白細胞計數及分類計數的影響：眼底靜脈叢取血法取小鼠全血20 μL，至預先分裝2 mL 稀釋液的EP管中，充分混勻，通過全自動血細胞分析儀測定小鼠外周血白細胞總數，并對淋巴細胞(LY)、單核細胞(MO)分類計數進行考察。

1.2.2.2.2 苦刺總堿對ALI小鼠血清炎癥細胞因子IL-6、TNF-α水平的影響：摘眼球法收集小鼠血液，離心(4℃，3500r/min)10 min，分取血清，ELISA法測定血清IL-6、TNF-α水平。

1.2.2.2.3 苦刺總堿對ALI小鼠BALF中總蛋白含量及IL-1β、IL-10、MDA、NO含量的影響：取血完成后，脫頸處死實驗動物，剖開胸腔，暴露氣管，結扎右肺，用4 ℃無菌PBS溶液灌洗左肺，16號針自口腔插入氣管，固定后每次注入0.4 mL，注入后停留1 min，重復灌洗3次，收集BALF，離心(4℃，1000r/min)5 min，取上清液，BCA法測定BALF中蛋白含量，另按試劑盒說明書分別測定BALF中IL-1β、IL-10、MDA、NO含量。

1.2.2.2.4 苦刺總堿對ALI小鼠肺濕重(W)/干重(D)、肺指數及肺組織MPO活性的影響：迅速剖取已處死小鼠肺臟，稱全肺濕重，計算肺指數；然后準確分取部分肺組織，稱重(W)，放入60 ℃烘箱中干燥60小時，稱取干重(D)，計算W/D值，反映肺組織的水腫程度；另取部分肺組織充分勻漿，制備10%肺組織勻漿液，按照MPO試劑盒說明書測定MPO活性。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 苦刺總生物堿對ALI小鼠外周血白細胞及其分類計數的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠外周血WBC水平顯著增高、LY計數顯著降低，MO計數無顯著改變，提示ALI小鼠炎癥活動明顯。與模型對照組比較，苦刺總生物堿各劑量均能明顯降低ALI小鼠WBC水平和LY計數(P<0.01，P<0.05)；與地塞米松組比較，苦刺總生物堿各劑量組小鼠WBC水平顯著升高(P<0.01)；與苦刺總生物堿186.60 mg·kg-1組相比，苦刺總生物堿93.30 mg·kg-1組實驗動物外周血WBC水平顯著降低(P<0.01)；與苦刺總生物堿93.30 mg·kg-1組相比，苦刺總生物堿46.65 mg·kg-1組小鼠外周血LY計數顯著下降(P<0.05)，結果見表1。

Table 1 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on the contents of WBC and differential blood count in peripheral blood of ±s)

*：與模型對照組比較P<0.05，**：P<0.01；#：與地塞米松組比較P<0.05，##：P<0.01；#：與苦刺總生物堿中劑量組比較P<0.05，##：P<0.01.

2.2 苦刺總生物堿對ALI小鼠血清IL-6、TNF-α水平及BALF總蛋白含量的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α水平及BALF總蛋白含量顯著升高(P<0.01，P<0.05)，表明模型組小鼠炎癥模型復制成功；與模型對照組比較，苦刺總生物堿各劑量組均能顯著降低ALI小鼠血清IL-6、TNF-α水平及BALF總蛋白含量，且隨著劑量的增加，藥效強度有增強的趨勢(P<0.01)；與空白組相比，苦刺總生物堿93.30、46.65 mg·kg-1組實驗動物血清TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，結果見表2。

Table 2 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on IL-6，TNF-α in serum and the total protein concentration in BALF of ±s)

*與：模型對照組比較P<0.05，**：P<0.01；★：與地塞米松組比較P<0.05，★★：P<0.01；#：與苦刺總生物堿中劑量組比較P<0.05，##：P<0.01.

2.3 苦刺總生物堿對ALI小鼠BALF中炎癥細胞因子IL-1β、IL-10、MDA、NO水平的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠BALF中IL-1β、IL-10、MDA、NO水平顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與模型對照組比較，苦刺總生物堿各劑量組均能明顯降低ALI小鼠BALF中IL-1β、IL-10水平(P<0.01)，苦刺總生物堿93.30、186.60 mg·kg-1能明顯下降MDA、NO的表達水平(P<0.01)；與地塞米松組相比，苦刺總生物堿實驗動物BALF中IL-1β、MDA、NO水平顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與苦刺總生物堿46.65 mg·kg-1組相比，苦刺總生物堿93.30、186.60 mg·kg-1組能顯著降低MDA、NO含量(P<0.01，P<0.05)，結果見表3。

Table 3 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on the level of IL-1β，IL-10，

*：與模型對照組比較P<0.05，**：P<0.01；#：與地塞米松組比較P<0.05，##：P<0.01；#：與苦刺總生物堿中劑量組比較P<0.05，##：P<0.01.

2.4 苦刺總生物堿對ALI小鼠肺濕重(W)/干重(D)、肺指數及肺組織MPO活性的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠肺W/D值、肺指數及MPO活性顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與模型對照組比較，苦刺總生物堿93.30、186.60 mg·kg-1能明顯降低ALI小鼠W/D值及肺指數(P<0.01，P<0.05)，各劑量均能明顯降低ALI小鼠肺組織MPO活性(P<0.01)；與地塞米松組比較，苦刺總生物堿46.65、186.60 mg·kg-1組實驗小鼠肺組織MPO活性顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與苦刺總生物堿46.65 mg·kg-1組比較，苦刺總生物堿93.30 mg·kg-1組小鼠肺組織MPO活性顯著降低(P<0.05)，結果見表4。

Table 4 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on the W/D，lung index and MPO activity of ±s)

*：與模型對照組比較P<0.05，**：P<0.01；#：與地塞米松組比較P<0.05，##：P<0.01；#：與苦刺總生物堿低劑量組比較P<0.05，##：P<0.01.

3 討論

有研究顯示，苦刺具有明顯的抗炎作用[1]，課題組前期通過采用二甲苯致小鼠耳腫脹以及醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增高兩種急性炎癥動物模型，觀察苦刺不同提取部位的抗炎效應，結果發(fā)現苦刺總生物堿對兩種急性炎癥模型抑制效果明顯，表明總生物堿是苦刺發(fā)揮抗炎效應的有效部位。

內毒素性急性肺損傷發(fā)病機理錯綜復雜，迄今尚未完全闡明，目前認為發(fā)病機理主要是致病因子對肺血管內皮細胞的直接損傷和全身炎癥反應[2]。ALI的主要致病因子之一是LPS，LPS誘導的ALI動物模型可表現肺泡毛細血管和肺泡上皮彌漫性損傷、中性粒細胞浸潤，并伴有肺水腫、甚至肺出血等病理癥狀[3]。本研究以LPS誘導的ALI小鼠模型為載體，觀察苦刺總生物堿對模型小鼠的保護作用，可為苦刺藥理作用的挖掘及其臨床拓展應用提供實驗依據。結果顯示，腹腔注射LPS制備的ALI模型小鼠炎癥活動明顯，具體表現為：肺水腫明顯，肺指數升高，外周血WBC水平增加，肺組織MPO活性、血清及BALF中炎癥細胞因子水平均顯著升高?？啻炭偵飰A對ALI模型小鼠則有顯著保護作用：減輕實驗動物肺水腫癥狀，降低肺指數及外周血WBC水平，還可顯著降低肺組織MPO活性及血清、BALF中IL-1β、IL-10、MDA、NO等促炎因子水平，進而顯著減輕實驗動物機體的炎性活動。實驗結果證實了苦刺總生物堿為其主要抗炎物質基礎之一，同時初步揭示了苦刺總生物堿抗炎作用機制與抗氧化、抑制促炎因子的釋放有關。

[1]張明發(fā)，沈雅琴.苦刺總生物堿的抗腹瀉和抗炎作用[J].中國藥學雜志，1991，26(1)：20-23.

[2]吳岳，趙海龍，張偉，等.肺泡Ⅱ型細胞凋亡在急進高原大鼠早期肺損傷中的作用[J].青海醫(yī)學院學報，2013，34(4)：233-236.

[3]張廣梅，李福安，童麗.熱痛方對大鼠急性肺損傷保護作用的實驗研究[J].青海醫(yī)學院學報，2006，27(2)：104-106.

Protection effects of total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance on Lipopoly saccharide-induced Acute Lung Injury in Mice

ZHAO Peng-fei1，LIU Shao-neng2，MA Ji-zheng2

(1.The fourth people′s hospital of Qinghai Province，Xining 810000； 2.Guang An Men hospital，China academy of Chinese Medical sciences Beijing 100053)

Objective To investigate the protection effects of total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance on Lipopolysaccharide(LPS)-induced acute lung injury(ALI)in mice.Method Mice were randomly divided into six groups，which including normal control group，ALI model group，ALI model+dexamethasone group，ALI model+total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance(46.65mg·kg-1、93.30mg·kg-1、186.60mg·kg-1)groups.Except the dexamethasone group′s mice were given the drugs once time by i.p before experiment，other group′s were given drugs by intragastric administration once a day for 7 days.Then，the ALI model was established by intraperitoneal injection of LPS(10mg·kg-1)in mice after 1h of the last administration.12h after LPS injection，the blood，serum，bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were collected.White blood cell(WBC)content of blood，lung index，myeloperoxidase(MPO)activity in lung tissue，total protein concentration in BALF，and the level of IL-6，TNF-α in serum，IL-1β，IL-10，MDA，NO in BALF were measured respectively.Measure the ratio of wet lung to dry lung weight(W/D).Result The total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance significantly decreased the WBC content in blood，increased lymphocyte(LY)count，as well as decreased the lung index，the value of W/D，MPO activity in lung tissue，the level of IL-6，TNF-α in serum and contents of IL-1β，IL-10，MDA and NO in BALF.Conclusion The results reveal that the total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance show a protective action against the inflammatory pathological changes of lung tissue in ALI mice，and mechanisms underlying the action may be related to anti-oxidation and inhibiting the release of pro-inflammatory cytokines.

SphoravieiifoliaHance Total alkaloids Lipopolysaccharide Acute Lung Injury Protection

※：“西部之光”訪問學者項目資助(2016) 趙鵬飛(1984～ )，男，漢族，陜西籍，主治醫(yī)師

R774.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.012

2016-11-09