慢性功能性便秘患者的腸道菌群分析

黃林生 高仁元 嚴(yán)雪冰 祝琦 潘成 尹明明 李豪孔程 張鵬 沈通一 秦環(huán)龍

慢性功能性便秘患者的腸道菌群分析

黃林生1，2，3高仁元2，3嚴(yán)雪冰2，3祝琦2，3潘成2，3尹明明2，3李豪2，3孔程2，3張鵬2，3沈通一2，3秦環(huán)龍1，2，3

目的 探討慢性功能性便秘患者與健康對(duì)照組之間腸道菌群的差異。方法 選取便秘組和健康對(duì)照組共計(jì)20人，留取新鮮糞便樣本，冰塊運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室并存放于-80度冰箱。采用16S rRNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)V4區(qū)鑒定菌群。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)兩組人群的菌群豐富度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），菌群多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。便秘患者與健康對(duì)照組之間的腸道細(xì)菌組成在門和屬水平差異均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在門水平，便秘患者腸道中放線菌門（Actinobacteria）豐度顯著增加（Z=-3.10，P＜0.05），而變形菌門（Proteobacteria）豐度顯著降低（Z=-2.42，P＜0.05），在屬水平發(fā)現(xiàn)20個(gè)菌屬差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，Coprobacillus（Z=-2.10，P＜0.05）、Hungatella（Z=-2.31，P＜0.05）、Holdemanella（Z=-2.32，P＜0.05）、Anaerostipes（Z=-3.78，P＜0.01）、Bacteroidales_S24-7_group_norank（Z=-2.15，P＜0.05）、Bacteroides（Z=-3.78，P＜0.01）、Blautia（Z=-3.78，P＜0.05）、Collinsella（Z=-3.02，P＜0.05）、Dorea（Z=-2.95，P＜0.05）、［Eubacterium］_ruminantium_group（Z=-2.70，P＜0.05）、Erysipelotrichaceae_UCG-003（Z=-3.10，P＜0.05）、Ruminococcaceae_uncultured（Z=-2.50，P＜0.05）、Parabacteroides（Z=-2.87，P＜0.05）菌屬在便秘患者的腸道中豐度明顯增多，而Megasphaera（Z=-2.31，P＜0.05）、Paraprevotella（Z=-2.94，P＜0.05）、Prevotella_2（Z=-3.10，P＜0.05）、Prevotella_9（Z=-3.68，P＜0.01）、Enterococcus（Z=-2.27，P＜0.05）、Catenibacterium（Z=-2.48，P＜0.05）、Clostridium_sensu_stricto_1（Z=-2.50，P＜0.05）菌屬在健康對(duì)照組的腸道中豐度明顯增多。結(jié)論 慢性功能性便秘患者的腸道菌群與健康人群的菌群存在較大差異，通過改變腸道菌群可能成為治療慢性功能性便秘的新策略。

便秘； 腸道菌群失調(diào)； 菌群豐度； 16S rRNA

隨著生活節(jié)奏的加快以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，便秘已經(jīng)成為一種常見的腸道疾病。Mugie等［1］對(duì)涉及便秘的58篇流行病學(xué)文章進(jìn)行系統(tǒng)性回顧發(fā)現(xiàn)，成人中便秘的平均患病率為16%，而在60歲以上的老年人中患病率高達(dá)33.5%，且女性患病率比男性高，約為1.5：1。便秘是一種以排便次數(shù)減少、排便困難和費(fèi)力以及排便不盡感為主要臨床表現(xiàn)的腸道疾病。而慢性功能性便秘是指排除腸道器質(zhì)性病變和全身系統(tǒng)性的疾病以及藥物作用因素所致的便秘。長期的便秘不僅影響個(gè)體的正常生活，還會(huì)增加心腦血管疾病、大腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)［2］。針對(duì)便秘的治療方法有很多，傳統(tǒng)的瀉劑治療方式存在諸多的局限性，不能從根本上解決便秘的病因。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明慢性功能性便秘患者腸道菌群往往存在不同程度的比例失調(diào)。本研究旨在對(duì)慢性功能性便秘患者和健康人群的腸道菌群進(jìn)行比較，以期發(fā)現(xiàn)一些具有疾病特征性的菌群，從而為便秘相關(guān)的菌群研究提供基礎(chǔ)，也為便秘的微生態(tài)治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

資料與方法

一、臨床資料

選取2016年1月至2016年12月在上海市第十人民醫(yī)院微生態(tài)門診收治的10名便秘患者和在社區(qū)招募的10例健康人群為研究對(duì)象。本研究通過了上海市第十人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，所有參與研究的患者均簽署了知情同意書。

（一）便秘病人納入標(biāo)準(zhǔn)

1.符合便秘羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］：（1）在就診之前三個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)2種或2種以上的情況：a.至少25%的排便感到費(fèi)力；b.至少25%的排便為干球糞或硬糞；c.至少25%的排便有不盡感；d.至少25%的排便有肛門直腸梗阻感和（或） 堵塞感；e.至少25%的排便需手法輔助（如用手指協(xié)助排便、盆底支持）；f.每周排便少于3次。（2）在未使用瀉劑的情況下很少能出現(xiàn)稀便。（3）沒有達(dá)到腸易激綜合征（IBS）的標(biāo)準(zhǔn)；2.在確診之前至少有6個(gè)月的臨床癥狀；3.近三個(gè)月未使用抗生素、益生菌和導(dǎo)致便秘的藥物；4.近3個(gè)月經(jīng)腸鏡檢查或在入組前加做腸鏡檢查排除了腸道器質(zhì)性的病變；5.經(jīng)直腸指檢和結(jié)腸傳輸試驗(yàn)符合便秘輔助檢查要求的。

（二）健康組的人群納入標(biāo)準(zhǔn)

1.沒有便秘的疾?。?.近三個(gè)月沒有服用抗生素、藥物和益生菌制劑。

二、方法

在門診對(duì)便秘組人群和健康對(duì)照組人群分別留取新鮮糞便樣本，并放在-80度冰箱保存，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分裝后送檢，采用16S rRNA細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)鑒定腸道菌群，并對(duì)兩組樣本進(jìn)行菌群差異分析。

（一）16 RNA細(xì)菌檢測(cè)方法

（1）首先對(duì)樣本進(jìn)行基因組DNA抽提，完成后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA；（2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)；（3）參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor? -ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合；（4）Illumina平臺(tái)文庫構(gòu)建與Illumina平臺(tái)測(cè)序。

（二）生物學(xué)信息學(xué)分析

分析前先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理，得到優(yōu)化序列。然后在去除嵌合體序列后進(jìn)行OTU聚類分析，對(duì)OTU的代表序列作分類學(xué)分析?；贠TU聚類分析結(jié)果，再對(duì)OTU進(jìn)行豐度（Ace和Chao指數(shù)）和多樣性（Shannon和Simpson指數(shù)）分析以及對(duì)測(cè)序深度的檢測(cè)；基于分類學(xué)信息，再對(duì)各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPa rism7.0軟件分析。計(jì)量資料（兩組人群的身高、體重、BMI指數(shù)、平均每周排便次數(shù)、平均便秘時(shí)間指標(biāo)）均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本比較采用t檢驗(yàn)。兩組樣本的菌群差異性比較（門、屬水平）均采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、人群基本信息

本研究中便秘組納入男性7例，女性3例，年齡38～85歲，平均年齡（71.00±4.89）歲；平均身高（168.70±2.30）cm，平均體重（63.20±3.24）千克，BMI指數(shù)（22.13±0.82）kg/m2，平均每周排便次數(shù)為（1.80±0.21）次，平均便秘時(shí)間（105.60± 35.95）個(gè)月。健康對(duì)照組中男性8例，女性2例，年齡60～75歲，平均（71.40±0.67）歲，平均身高（166.40±2.01）cm，平均體重（68.30±2.42）千克，BMI指數(shù)為（24.64±0.65）kg/m2，平均每周排便（6.70±0.15）次，均無便秘病史。兩組在年齡、身高、體重方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.08，P=0.93；t=0.74，P=0.45；t=1.26，P=0.22），但是兩組在BMI指數(shù)、每周排便次數(shù)、排便時(shí)間上差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.40，P=0.03；t=5.6，P＜0.0001；t=2.90，P=0.01）（表1）。

二、兩組腸道菌群豐度和多樣性比較

Chao指數(shù)和Ace指數(shù)是估計(jì)樣品中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，常用于評(píng)估菌群的豐富度。對(duì)兩組的腸道菌群在進(jìn)行統(tǒng)一聚類和抽平后進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩組在豐富度（Ace指數(shù)和Chao指數(shù)）上差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，健康組的腸道菌群豐度明顯增高，而慢性功能性便秘患者的腸道菌群豐度顯著降低。兩組在多樣性上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）（表2，圖1）。

三、菌群在門、屬水平的差異性比較

在門水平，兩組在變形菌門（Z=-2.42，P＜0.05）和放線菌門（Z=-3.10，P＜0.05）差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。在便秘人群中Actinobacteria水平較高，但在健康人群中Proteobacteria水平較高（圖2）。在屬水平，Coprobacillus、Hungatella、Holdemanella、Anaerostipes、Bacteroidales_S24-7_group_ norank、Bacteroides、Blautia、Collinsella、Dorea、［Eubacterium］_ruminantium_group、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Ruminococcaceae_ uncultured、Parabacteroides菌屬在便秘病人的腸道中明顯增多，Megasphaera、Paraprevotella、Prevotella_2、Prevotella_9、Enterococcus、Catenibacterium、Clostridium_sensu_stricto_1菌屬在正常人群的腸道菌群中明顯增高群中明顯增高，20個(gè)菌屬差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。取菌屬所占比＞0.01為有閾值水平，共計(jì)3個(gè)菌屬存在差異（圖3）。

表1 人群的基本信息（±s）

表1 人群的基本信息（±s）

組別例數(shù)年齡（歲）身高（cm）體重（Kg）BMI指數(shù)（Kg/m2）每周排便次數(shù)（次）便秘時(shí)間（月）便秘組1071.00±4.89168.70±2.3163.20±3.2422.13±0.821.80±0.21105.6 0±35.95健康組1071.40±0.67166.40±2.0668.30±2.4224.64±0.656.70±0.150.00 Z值t=0.08t=0.74t=1.26t=2.40t=5.60t=2.90 P值P=0.93P=0.45P=0.22P=0.03P＜0.01P=0.01

討 論

目前慢性功能性便秘微生態(tài)研究正不斷受到研究人員的關(guān)注。目前研究發(fā)現(xiàn)慢性便秘不僅與機(jī)體解剖、腸道動(dòng)力以及其他生理功能改變有關(guān)，而且與腸道微生態(tài)的改變密切相關(guān)。由于飲食結(jié)構(gòu)、生活方式和遺傳的差異性，使腸道菌群具有較大的個(gè)體差異，因此需要找出便秘人群具有特征性的可能致病菌群具有十分重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)便秘患者的排便頻率顯著少于正常組，通過16S rRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，便秘組的腸道菌群豐度顯著低于健康組，而多樣性無明顯差異。這與Tim等［4］在兒童中研究的結(jié)論一致。在門水平，本研究發(fā)現(xiàn)放線菌門相對(duì)豐度在便秘組中顯著增高，而變形菌門相對(duì)豐度在便秘組中顯著降低。在屬水平，本研究發(fā)現(xiàn)20種菌屬在兩組之間存在顯著差異，按照相對(duì)豐度大于1%進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Paracteroides和Bacteroides在便秘組中顯著富集，而Prevotella_9在便秘組中顯著降低。既往的研究中發(fā)現(xiàn)便秘人群與健康人群有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的細(xì)菌也各有不同，Gopanandan等［5］在研究中發(fā)現(xiàn)患有結(jié)腸慢傳輸?shù)谋忝夭∪四c粘膜菌群與其他便秘病人和健康對(duì)照組有顯著差異，擬桿菌屬在便秘病人的結(jié)腸粘膜中顯著增高，F(xiàn)irmicutes（Faecalibacterium，Lactococcus和Roseburia）能夠促進(jìn)結(jié)腸傳輸，糞便中的甲烷代謝產(chǎn)物影響了糞便的菌群構(gòu)成，但不會(huì)影響結(jié)腸的傳輸。在本研究中Firmicutes在便秘組與健康組中卻未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Attaluri在對(duì)48例慢性傳輸性便秘（slow transi onstipation，ST）和48例非慢性傳輸型便秘 （norma ransi onstipation，NT） 和非便秘的人群進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)慢性傳輸型便秘的腸道內(nèi)產(chǎn)甲烷梭菌（Methanogenus）的量明顯增高，甲烷等代謝產(chǎn)物在ST的患者中是最高的，NT其次，在正常人中最低［6-7］。Zoppi等［8］在研究中發(fā)現(xiàn)便秘兒童中clostridia和bif i dobacteria菌屬含量是增高的，在本次研究中未發(fā)現(xiàn)相似的改變。Tim等［4］在對(duì)76名便秘兒童的菌群與健康組進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，兩組在擬桿菌屬（脆弱擬桿菌、卵形擬桿菌）、長雙岐桿菌、Parabacteroides、Alistipe i negoldii差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Parthasarathy等［5］在對(duì)25名便秘成人和25名健康人的結(jié)腸粘膜的菌群分析中發(fā)現(xiàn)Bacteriodetes菌屬在便秘患者中是增高的。而在本次研究中發(fā)現(xiàn)Parabacteroides和擬桿菌屬也在便秘人群的腸道中顯著增加，說明本研究結(jié)果具有較好的可信度。

圖1 圖示便秘組和健康對(duì)照組之間豐度（Ace和Chao指數(shù)）和多樣性（Shannon和Simpson指數(shù)）差異*P＜0.05

Dan等［9］在對(duì)便秘病人服用合生元的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)合生元能夠顯著改善病人的排便情況，使AGACHAN評(píng)分明顯增高。Veronica等［10］在研究中通過對(duì)便秘病人使用Lactobacillu euteri菌發(fā)現(xiàn)益生菌能夠顯著改善便秘病人的排便狀況。糞菌移植也逐漸成為便秘的另一種治療方法，Tian等［11］在對(duì)24例慢性結(jié)腸傳輸型便秘的患者進(jìn)行3天的鼻胃管灌注法糞菌移植后觀察到在12周后，臨床效果得到提高和緩解的比例分別達(dá)到50%和37.5%。可見針對(duì)便秘患者進(jìn)行基于腸道菌群的療法也具有一定的有效性。

圖2 便秘組和健康對(duì)照組之間放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）的豐度差異*P＜0.05

圖3 便秘組和健康組菌群在屬水平的Heatmap圖

表2 CFC和HC在屬水平顯著差異菌群的相對(duì)豐度（%）

表3 CFC和HC在門水平菌群的相對(duì)豐度比較（%）

關(guān)于腸道菌群和胃腸道蠕動(dòng)之間的關(guān)系，很多無菌老鼠的實(shí)驗(yàn)中揭示了胃腸道缺乏菌群定植與腸道運(yùn)動(dòng)障礙有緊密的聯(lián)系［12-14］，但是具體的病理機(jī)制仍然不明確，一種解釋是細(xì)菌能夠調(diào)控控制腸道蠕動(dòng)相關(guān)基因的表達(dá)［15］，另一種解釋為腸道的蠕動(dòng)依賴發(fā)酵產(chǎn)物形成的PH環(huán)境、菌群代謝產(chǎn)物形成的滲透作用、腸腔內(nèi)的氣體（二氧化碳，氫類，甲烷）增多反射性引起腸道平滑肌的收縮作用［16］。一些動(dòng)物研究還發(fā)現(xiàn)了特定的菌群與腸道動(dòng)力之間的關(guān)系，Bifidobacteriu ifidum、Lactobacillu euterii和Lactobacillu ci-dophilus菌群能夠促進(jìn)腸道的蠕動(dòng)，Escherichia卻對(duì)腸道蠕動(dòng)有抑制作用［17-19］。

本研究仍存在一定的局限性，首先只選取了10例便秘病人和10例健康人群進(jìn)行比較，樣本的數(shù)量較少，其次本研究未能將地域、飲食習(xí)慣、生活方式的差異性等因素納入研究。在本研究的基礎(chǔ)上，針對(duì)便秘人群與健康人群存在的菌群差異，采用微生態(tài)治療以改善慢性功能性便秘的癥狀和腸道菌群譜已經(jīng)成為便秘治療的一個(gè)重要方向。

總之，本研究初步發(fā)現(xiàn)在便秘人群和健康人群中存在顯著差異的菌群，為便秘的進(jìn)一步微生態(tài)研究提供實(shí)踐支持。因此，針對(duì)有差異的菌群的研究基礎(chǔ)，重新恢復(fù)便秘人群的腸道微生態(tài)有望未來成為便秘治療一個(gè)重要方向。

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Structure analysis of the gut microbiota in chronic functional constipation patients

Huang Linsheng1,2,3,Gao Renyuan2,3, Yan Xuebing2,3, Zhu Qi2,3, Pan Cheng2,3, Yin Mingming2,3, Li Hao2,3, Kong Cheng2,3, Zhang Peng2,3, Shen Tongyi2,3, Qin Huanlong1,2,3.1Shanghai Tenth People′s Hospital Clinical College of Anhui Medical University;
2Department of General Surgery, Shanghai Tenth People′s Hospital, Tongji University School of Medicine;3Research Institute for Intestinal Diseases of Tongji University School of Medicine, Shanghai 200072, China
Correspondence author: Qin Huanlong, Email: qinhuanlong@126.com

Objective T nvestigat h ifference u icrobiot etwee atient ith chroni unctiona onstipation (CFC) an ealt ontrols (HC). Methods 16S rRNA highthroughout pyrosequencin n V4 regio a mploye xamin h ifferenc u icrobiot rof i le etween 10 CFC patient nd 10 HCs. Th btaine at er nalyze sin ioinformatics. Results Th ichness analysi uggeste hat HC av iche u icrobiot han CFC patients (all P＜0.05), whil ignif i cant differenc a bserve h iversit nalysis.Ther a signif i can tructur ifferenc u icrobiota between CFC patient nd HC ot h hylu n enu evels (all P＜0.05). A h hylu evel,Actinobacteri n CFC patient iche ha ha n HCs, but Proteobacteri pposite (all P＜0.05). A he genu evel, 20 gu icrobiot er oun av change elativ bundanc etween CFC patient nd HCs, i hich Coprobacillus, Hungatella, Holdemanella, Anaerostipes, Bacteroidales_S24-7_group_norank, Bacteroides, Blautia, [Eubacterium]_ruminantium_group, Collinsella, Dorea, Erysipelotrichaceae_UCG-003, Parabacteroide nd Ruminococcaceae_unculture er ncrease n CFC patient hile Megasphaera, Paraprevotella, Prevotella_2, Prevotella_9, Enterococcus, Catenibacteriu nd Clostridium_sensu_stricto_1 were increase n HCs. Conclusion Ther a signif i can tructur ifferenc u icrobiot etween CFC patient nd HCs. Therefore, targetin h u icrobiot ysbiosi a promisin herapeuti trategy for CFC patients.

Constipation; Intestina lor ysregulation; Bacteri bundance; 16S rRNA, richness

2016-12-19）

（本文編輯：趙志勛）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.02.008

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81230057；No.81472262；No.81302066）；上海新興前沿技術(shù)聯(lián)合攻關(guān)項(xiàng)目（No.SHDC12012106）

200072 上海，安徽醫(yī)科大學(xué)上海十院臨床學(xué)院1；200072 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院普外科2；200072 上海，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院腸道疾病研究所3

秦環(huán)龍，Email：qinhuanlong@126.com