腸易安湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠潰瘍組織中NF-κB p65及IL-10表達(dá)的影響

馬春花 羅京藝 朱東華 荊淑娟 尚毅

腸易安湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠潰瘍組織中NF-κB p65及IL-10表達(dá)的影響

馬春花 羅京藝 朱東華 荊淑娟 尚毅

目的 觀察中藥方“腸易安湯”對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸粘膜組織NF-κB p65、白細(xì)胞介素-10（IL-10）表達(dá)的影響。方法 采用2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）加免疫誘導(dǎo)法復(fù)制UC大鼠模型，39只大鼠，隨機(jī)分組為模型組，腸易安湯組，柳氮磺胺吡啶（SASP）組。治療21 d后觀察大鼠結(jié)腸組織黏膜的病理改變（CMDI）、NF-κB p65、IL-10表達(dá)水平的變化。結(jié)果 治療21 d后，腸易安湯組大鼠CMDI評(píng)分和NF-κB p65表達(dá)明顯低于模型組（t=58.28，P=0.003；t=6.01，P=0.016）和SASP組（t=-22.10，P=0.026；t=-2.80，P=0.038），腸易安湯組IL-10表達(dá)明顯高于模型組和SASP組（t=-403.56，P=0.022；t=35.76，P=0.036）。結(jié)論 腸易安湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織黏膜有良好的修復(fù)作用，其作用機(jī)理可能與降低NF-κB p65表達(dá)和提高IL-I0水平有關(guān)。

結(jié)腸炎，潰瘍性； 白介素-10； 核因子κB p65； 腸易安湯

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativ olitis，UC）是一種慢性非特異性炎癥性腸病，主要累及直腸、結(jié)腸黏膜，以腹痛、腹瀉、黏液血便及里急后重為主要臨床表現(xiàn)，病程遷延不愈，長(zhǎng)達(dá)十幾年甚至幾十年，并存在著高于正常人群5～8倍的癌變率。該病發(fā)病率在歐美國(guó)家約為5～12/10萬(wàn)，在我國(guó)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且癌變率在2～5%［1］。該病發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和炎性細(xì)胞因子等密切相關(guān)［2］。研究發(fā)現(xiàn)［3］潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病與促炎因子和抗炎因子平衡失調(diào)關(guān)系密切。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)NF-κB p65及其介導(dǎo)的炎癥通路在UC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［4］。而IL-10可以抑制其他相關(guān)細(xì)胞因子的分泌、遷移。西藥治療UC遠(yuǎn)期療效較差，且容易產(chǎn)生藥物依賴及毒副作用［5］。本研究主要觀察中藥方腸易安湯對(duì)UC大鼠癥狀、大鼠潰瘍組織中IL-10、NF-κB p65表達(dá)水平的影響，從而探討腸易安湯治療UC的作用機(jī)制。

資料與方法

一、一般資料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只Wistar健康大鼠，4～6周齡，雌雄各半，體重（200±30）g，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

（二）模型制備

參考段征等［6］的2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-TNBS）誘導(dǎo)聯(lián)合免疫復(fù)合法。用4只大鼠結(jié)腸黏膜制成組織勻漿，以10000 r/min速度離心5～10分鐘，提取上清液提純，用考馬斯藍(lán)染色法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量（濃度為16 mg/ml），與等量完全佛式佐劑配成抗原乳化液備用。39只大鼠在禁食24小時(shí)后開(kāi)始造模。用100 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，將直徑2 mm，長(zhǎng)15 cm的硅膠管輕輕插入肛門(mén)8 cm，注入100 mg 0.5% TNBS/kg＋50%乙醇0.65 ml，14天后在大鼠腹股溝、足跖處注射抗原乳化液（含抗原8 mg）2次。造模后，隨機(jī)選取2只模型大鼠處死，截取部分結(jié)腸組織，用10%中性福爾馬林固定，以作病理檢測(cè)（造模及灌胃過(guò)程中死亡5只大鼠），驗(yàn)證模型制備成功后將大鼠隨機(jī)分為模型組、腸易安湯組及柳氮磺吡啶組各13只大鼠。

（三）主要試劑與儀器

濃度為5%的2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-TNBS）（試劑編號(hào)：P22970，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品）；弗氏完全佐劑（試劑編號(hào)：F5506，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品）；0.1%鹽酸氯胺酮44 mL（產(chǎn)品批號(hào)：100817，福建古田藥業(yè)有限公司產(chǎn)品）；勻漿機(jī)（型號(hào)：985-370）。

IL-10抗體IgG rabbit（產(chǎn)品編號(hào)：BA1201，武漢博士德生物工程有限公司）；goat Anti-Mouse IgG（產(chǎn)品編號(hào)：HRP-10004302，美國(guó)Jackson公司產(chǎn)品）；goat Anti-Rabbit IgC（產(chǎn)品編號(hào)：SC-2004，美國(guó)Jackson公司產(chǎn)品）；NF-κB p65磷酸化檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20130125，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；免疫組化試劑盒（晶美生物工程有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：DEC 022005）；BH2系統(tǒng)顯微鏡（日本Olympus公司產(chǎn)品）；I Leica QWin圖像分析軟件（上海申騰信息技術(shù)有限公司）；攝像機(jī)（PANASONIC公司，型號(hào)：MV-CP410）；切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品 型號(hào)：RM2145）。

（四）實(shí)驗(yàn)藥物

腸易安湯：黨參30 g，黃芪45 g，白術(shù)15 g，山藥15 g，薏苡仁15 g，芡實(shí)15 g，馬齒莧15 g，紫草9 g，川芎9 g，將腸易安湯方中藥物水煎高濃度梯度（75%、95%）乙醇提純有效成分，制成使其含生藥濃度為3.75 g/mL中藥制劑；柳氮磺吡啶（SASP）制劑：將SASP藥片碾成細(xì)末，溶于蒸餾水中制備懸濁液，使其含SASP濃度為0.093 g/mL。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）給藥方法

模型復(fù)制成功后第1天開(kāi)始給藥，連續(xù)給藥21天。（二）標(biāo)本采集

在給藥第2l天將大鼠用脫頸椎法處死，解剖腹腔，取下距肛門(mén)約6～8 cm處長(zhǎng)度3～5 cm的結(jié)腸組織，并對(duì)大鼠結(jié)腸組織進(jìn)行CMDI（colon macroscopi amag ndex）評(píng)分，用冰生理鹽水反復(fù)沖洗后，置于10%甲醛中保存?zhèn)溆?。CMDI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 CMDI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（分）

（三）檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.免疫組化實(shí)驗(yàn)操作

采用免疫組化PAP二步法：將組織切片脫蠟反復(fù)洗滌后，用Ph 6.0的CB檸檬三鈉緩沖液熱誘導(dǎo)修復(fù)抗原。室溫下，20%正常羊血清室溫孵育后，滴加上述抗體，次日加羊抗免IgG-HRP（羊抗小鼠IgG-HRP）。洗滌后用DAB～H2O2底物顯色，蘇木素液復(fù)染。每個(gè)步驟間用0．01 MPBS反復(fù)洗滌2～3次。

2.NF-κB p65表達(dá)結(jié)果判斷

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，正常大鼠結(jié)腸織僅可見(jiàn)少量陽(yáng)性細(xì)胞，且染色淺淡；UC大鼠結(jié)腸組織可見(jiàn)大量NF-κB p65陽(yáng)性細(xì)胞，主要為核著色或胞質(zhì)著色。

3.免疫組化陽(yáng)性著色定量分析

染色結(jié)果應(yīng)用LeicaQWin圖象分析軟件在250倍顯微鏡下，隨機(jī)選取3個(gè)視野，計(jì)算區(qū)域的陽(yáng)性面積（μm2），求出3個(gè)視野平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，三組計(jì)量資料均進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，均服從正態(tài)分布，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）方式表達(dá)，三組計(jì)量資料組間兩兩比較均采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

三組UC大鼠CMDI評(píng)分、NF-κB p65、IL-10表達(dá)的數(shù)據(jù)列示于表2，整體比較（單因素方差分析）知：3組間整體比較均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），腸易安湯組、SASP組與模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=58.28，P=0.003；t=-38.11，P=0.002），腸易安湯組與SASP組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-22.10，P=0.026），與模型組相比，腸易安湯組、SASP組大鼠結(jié)腸組織NF-κB p65表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.01，P=0.016；t=-1.27，P=0.008），腸易安湯組與SASP組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-2.80，P=0.038）。與模型組比較，腸易安湯組、SASP組IL-10水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-403.56，P=0.022；t=41.70，P=0.018），腸易安湯組與SASP組比較，IL-10水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.76，P=0.036）。

表2 三組UC大鼠CMDI評(píng)分、NF-κB p65、IL-10表達(dá)的比較（s）

表2 三組UC大鼠CMDI評(píng)分、NF-κB p65、IL-10表達(dá)的比較（s）

組別例數(shù)CMDI評(píng)分NF-κB p65表達(dá)IL-10表達(dá)腸易安湯組130.88±0.120.17±0.38*73744.49±348.88*模型組133.60±0.120.40±0.1334673.11±11.65 SASP組131.86±0.110.32±0.19*55529.49±1803.25*整體比較：F/P7.63，＜0.0015.28，＜0.00134.28，＜0.001多重比較：LSD—t/P腸易安湯組vs模型組58.28，0.0036.01，0.016-403.56，0.022腸易安湯組vs SASP組-22.10，0.026-2.80，0.03835.76，0.036模型組vs SASP組 -38.11，0.002-1.27，0.00841.70，0.018

討 論

目前，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為免疫反應(yīng)異常是造成UC發(fā)病的重要因素，而相關(guān)細(xì)胞因子失衡在這個(gè)免疫調(diào)節(jié)和炎癥過(guò)程中充當(dāng)重要角色［7］。參與早期免疫反應(yīng)和各階段炎癥反應(yīng)的許多分子都受NF-κB 通路的調(diào)控，通過(guò)抑制腸組織NF-κB的活性、減輕UC炎癥反應(yīng)，可能是中西醫(yī)藥物治療UC的重要機(jī)制之一［8-9］。NF-κB家族由5個(gè)成員構(gòu)成，包括NF-κB1（p50/p105），NF-κB2（p52/p100），p65（ReIA），ReIB及C-Rel等，其中p65（ReIA）具有顯著的促炎活性［10］。NF-κB在核內(nèi)與κB序列結(jié)合促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子如IL-1β，IL-2，IL-6，IL-8，TNF-α及TNF-β等的基因轉(zhuǎn)錄，所以NF-κB活化可能是UC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵點(diǎn)［11］。有研究發(fā)現(xiàn)［12］NF-κB在UC大鼠結(jié)腸中表達(dá)明顯升高，還有研究發(fā)現(xiàn)［13-14］NF-κB在UC患者結(jié)腸黏膜中處較高的表達(dá)水平，參與了UC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，檢測(cè)其變化對(duì)疾病活動(dòng)度的評(píng)價(jià)具有重要的臨床意義。張夏夢(mèng)等［15］研究顯示清熱燥濕涼血方能促進(jìn)UC大鼠結(jié)腸組織上皮修復(fù)和結(jié)腸微血管生成，抑制結(jié)腸組織NF-κB的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腸易安湯能夠抑制UC大鼠模型過(guò)度表達(dá)NF-κB p65，控制炎癥反應(yīng)，減輕腸道損傷。

IL-10為細(xì)胞因子合成抑制因子，對(duì)激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞及T細(xì)胞等有抑制作用，可下調(diào)IL-2、IL-3、γ干擾素等促炎因子水平，具有廣泛的免疫抑制活性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［16］補(bǔ)充IL-10能夠減緩UC的發(fā)生與發(fā)展，表明IL-10對(duì)調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫系統(tǒng)的平衡，保護(hù)腸黏膜具有重要作用。而剔除大鼠IL-10基因（IL-10-/-）能誘發(fā)大鼠結(jié)腸炎［17］。其他研究結(jié)果也顯示［18］，健脾中藥能有效對(duì)抗UC模型大鼠IL-10的降低。

本研究表明，腸易安湯能有效降低大鼠結(jié)腸組織CMDI評(píng)分，同時(shí)降低NF-κB的表達(dá)水平，增加IL-10表達(dá)水平，表明腸易安湯可調(diào)節(jié)UC大鼠促炎因子NF-κB p65與抗炎因子IL-10的平衡，從而抑制大鼠UC的炎性反應(yīng)。因此，免疫調(diào)節(jié)可能是腸易安湯有效促進(jìn)UC結(jié)腸黏膜修復(fù)的作用機(jī)制之一，但其更深入的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

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Effect of Changyian on the expression of nuclear factor kappa B and interleukin-10 in ulcerative colitis rats

Ma Chunhua, Luo Jingyi, Zhu Donghua, Jing Shujuan, Shang Yi.
Department of Anorectal Surgery, Liaocheng Second People′s Hospital, Shandong 252600, China

Ma Chunhua, Email: mahuaqinghe@163.com

Objective T bserv h ffec f Changyia h xpressio f NF-κB p65 and interleukin-10 i lcerativ oliti ats. Methods Ulcerativ oliti a ode a opie y 2, 4, 6-TNBS. Thirty-nin at er andoml ivide nto 3 groups：mode roup, Changyia rou n alazosulfapyridine (SASP) group. After 21 days′ treatment, th hange oloni ucosa amag ndex (CMDI) , level f NF-κB p65 and IL-10 wer bserved. Results After 21 days′ treatment, the CMDI an h xpressio f NF-κB p65 of Changyia rou a ignif i cantl owe ha h ode roup (t=58.28, P=0.003; t=6.01, P=0.016) and SASP group (t=-22.10, P=0.026; t=-2.80, P=0.038) . Th xpressio nterleukin-10 wa bviously highe ha ha ode rou nd SASP group (t=-403.56, P=0.022; t=35.76, P=0.036) . Conclusion Changyia a oo epai ffec lcerativ oliti at olo ucosa. It echanis a elate o reduc h xpressio f NF-κB p65an mprov h eve f IL-I0.

Colitis, ulcerative; IL-I0; Nuclea acto appa B p65; Changyian

2016-09-22）

（本文編輯：楊明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.02.007

252600 山東省聊城市第二人民醫(yī)院肛腸科

馬春花，Email：mahuaqinghe@163.com