向日葵分枝和株高性狀的關(guān)聯(lián)分析定位研究

劉勝利,段 維,王 鵬,柳延濤,王沛政

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院,新疆 石河子 832000; 2.海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院,海南 三亞 572022；3.新疆康地種業(yè)科技股份有限公司,烏魯木齊 830011)

向日葵分枝和株高性狀的關(guān)聯(lián)分析定位研究

劉勝利1,段 維3,王 鵬1,柳延濤1,王沛政2

(1.新疆農(nóng)墾科學(xué)院,新疆 石河子 832000; 2.海南熱帶海洋學(xué)院 生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院,海南 三亞 572022；3.新疆康地種業(yè)科技股份有限公司,烏魯木齊 830011)

經(jīng)過(guò)structure軟件分析,128份向日葵自交系材料基因型依據(jù)△K的變化,可分為2大類群.標(biāo)記間的連鎖不平衡分析顯示,SSR標(biāo)記間的r2值范圍在0-1之間,平均為0.02；在選用D′來(lái)計(jì)算標(biāo)記位點(diǎn)間的連鎖不平衡時(shí), 25%的成對(duì)位點(diǎn)組合標(biāo)記中存在較高水平的連鎖不平衡(D′>0.4).關(guān)聯(lián)分析定位到 8個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)與向日葵分枝性狀相關(guān)聯(lián),其中有6個(gè)位點(diǎn)p<0.001,分別是ORS679、ORS 227-1、ORS16、 ORS22、 ORS33和ORS38；解釋表型變異8%-16%不等,2個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)p<0.01,分別是標(biāo)記ORS803和ORS 227-2；在株高性狀中,定位到3個(gè)位點(diǎn)與其顯著關(guān)聯(lián)(p<0.01),分別是ORS679,ORS9、ORS22,解釋表型變異4%-6%不等.該研究成果將會(huì)為今后利用分子標(biāo)記技術(shù)在向日葵新品種選育方法上提供支持.

向日葵;群體結(jié)構(gòu); 關(guān)聯(lián)分析

0 引言

向日葵(Helianthus annuus L.)是特別適合于我國(guó)西北部干旱地區(qū)種植,具有耐鹽堿、耐瘠薄、抗旱、適應(yīng)性強(qiáng)的農(nóng)作物[1].油用向日葵籽實(shí)含油率較高,亞油酸含量在60%以上,目前為世界第4大油料作物[2].當(dāng)前國(guó)內(nèi)向日葵品種與國(guó)外品種綜合農(nóng)藝性狀相比還有一定差距,主要原因是當(dāng)前我國(guó)向日葵品種科研育種基礎(chǔ)研究還比較薄弱[3].我國(guó)向日葵育種主要采用常規(guī)育種,向日葵常規(guī)育種方法存在著盲目性大、周期長(zhǎng)、效率低的問(wèn)題,尤其當(dāng)對(duì)多基因控制的數(shù)量性狀進(jìn)行育種時(shí),容易導(dǎo)致偏離預(yù)期的育種目標(biāo).近幾年,分子標(biāo)記技術(shù)已發(fā)展成為提高向日葵育種工作效率的強(qiáng)有力武器,成為當(dāng)前向日葵生物學(xué)研究的熱點(diǎn).

向日葵的分枝農(nóng)藝性狀是在向日葵生長(zhǎng)初期,由向日葵葉腋處的腋芽萌發(fā),形成分枝.向日葵多頭分枝性狀主要由單顯性基因控制、單隱性基因控制和雙隱性基因控制,在不同材料中,多頭分枝性狀可能受到不同基因的調(diào)控[4].向日葵株高主要是基因加性遺傳效應(yīng)控制,也受非加性效應(yīng)影響,屬于較復(fù)雜的數(shù)量性狀遺傳,受多基因調(diào)控外,環(huán)境條件一定程度影響遺傳表達(dá)[5-7].

在向日葵多頭和分枝定位研究方面,文獻(xiàn)[8]報(bào)道了利用RFLP標(biāo)記,在F2群體中將向日葵多頭基因b1定位在LG 7上.文獻(xiàn)[9]利用了重組自交系群體將向日葵多頭基因定位于兩個(gè)SSR標(biāo)記(ORS1088, ORS930)之間.文獻(xiàn)[10]則利用F2群體將多頭基因定位在標(biāo)記TBR11-107和TBR4-720/TBRB-555 之間.文獻(xiàn)[11]指出了向日葵矮化突變基因由半顯性等位基因Rht1所控制,并將其定位到連鎖群12上.

綜上所述,以上向日葵分枝和株高性狀的基因定位研究均使用單一親本的雜交分離群體,研究所用標(biāo)記也不盡相同,缺乏對(duì)向日葵整個(gè)群體資源材料進(jìn)行數(shù)量性狀的篩選定位研究,因此研究所得出的結(jié)果有較大的局限性.由于不同研究者使用的分子標(biāo)記不同,所得的研究結(jié)論在不同實(shí)驗(yàn)室間也較難進(jìn)行比較,限制了其在向日葵育種中的有效應(yīng)用.利用關(guān)聯(lián)分析方法進(jìn)行數(shù)量性狀基因定位研究周期短、分辨率高,可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行篩選,確定不同種質(zhì)資源中所具有的等位基因及其對(duì)目標(biāo)的貢獻(xiàn),是目前研究復(fù)雜數(shù)量性狀基因變異的常用方法.影響向日葵分枝和株高性狀的等位基因變異在其基因組中廣泛分布,因此利用關(guān)聯(lián)分析方法可以有效地鑒定出這些功能等位基因的位點(diǎn).本研究利用向日葵自交系為材料,利用隨機(jī)篩選的向日葵分子標(biāo)記,分析向日葵資源材料自交系的遺傳結(jié)構(gòu).在此向日葵遺傳結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,對(duì)向日葵多頭分枝和株高性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析定位.該研究結(jié)果將為今后向日葵親本選育提供可靠的分子標(biāo)記,加速向日葵自交系的培育,節(jié)約育種時(shí)間.同時(shí)也可以為今后該基因的圖位克隆打下良好的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

向日葵不同自交系種子材料由新疆農(nóng)墾科學(xué)院作物所提供.為了盡可能使研究的向日葵品系具有較高的遺傳多樣性,我們收集了128份向日葵油葵和食葵各種自交系(見(jiàn)表1),包括油葵保持系30份和恢復(fù)系43份；食葵保持系20份和恢復(fù)系35份.田間種植試驗(yàn)株距 25 cm,行距 70 cm,栽培密度 1.4×104株/hm2.小區(qū)行長(zhǎng) 6 m,4 行區(qū),采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),3 次重復(fù),生育期田間管理同當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn).開(kāi)花期調(diào)查材料的分枝情況,收獲期測(cè)量株高.

表1 向日葵自交系材料

續(xù)表1

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳

DNA提取：供試材料種植于海南三亞農(nóng)墾科學(xué)院試驗(yàn)田.取新鮮葉片,當(dāng)天取樣后直接提取基因組DNA.DNA提取采用百泰克新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型),最后得到的DNA樣品用TE(Tris-EDTA)緩沖液溶解,放在-20℃的冰箱內(nèi)保存.

TaqDNA聚合酶、dNTPs、Marker ladder、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺和TEMED等主要生化試劑購(gòu)自海南相關(guān)生物銷售商,為國(guó)產(chǎn)分析純.

SSR引物：SSR引物見(jiàn)文獻(xiàn)[12].在該文報(bào)道的向日葵序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence tagged site)序列中,隨機(jī)選取500對(duì)SSR引物,由上海生物工程公司合成引物,首先對(duì)16份向日葵自交系材料進(jìn)行擴(kuò)增篩選多態(tài).

PCR 擴(kuò)增、PCR反應(yīng)程序以及變性聚丙烯酰胺凝膠參照有關(guān)文獻(xiàn)[13].

1.3 群體結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用STRUCTRE軟件,對(duì)供試群體進(jìn)行基于數(shù)學(xué)模型的類群劃分.先設(shè)定群體數(shù)目(K)為2-10,5次重復(fù),將MCMC設(shè)為100000次,其參數(shù)設(shè)定參見(jiàn)已發(fā)表文獻(xiàn)[14].

1.4 關(guān)聯(lián)分析

在預(yù)估群體的 K 值范圍,獲得穩(wěn)定可靠的群體分類結(jié)果.在此基礎(chǔ)上以各個(gè)體 Q 值作為協(xié)變量進(jìn)行群體矯正,將向日葵分枝和株高性狀的表型數(shù)據(jù)分別對(duì)標(biāo)記變異進(jìn)行回歸分析,評(píng)價(jià)標(biāo)記等位變異的平均效應(yīng),依據(jù)顯著水平(p<0.05和p< 0.01) ,選取貢獻(xiàn)率高的主要位點(diǎn)[15].

2 結(jié)果分析

圖1 利用△K對(duì)向日葵群體結(jié)構(gòu)的優(yōu)化的雙邊圖表

2.1 向日葵資源材料的群體結(jié)構(gòu)分析

128份向日葵資源材料群體基因型經(jīng)過(guò)structure軟件運(yùn)行后,結(jié)果表明供試群體的等位變異頻率特征類型數(shù)K=2時(shí)ΔK值最大(見(jiàn)圖1),而且差異顯著.在K為3-9之間,其△K基本降低到0附近,近似一條直線.因此依據(jù)△K的變化,向日葵自交系材料群體可以分為2大類群.

2.2 向日葵群體標(biāo)記間的連鎖不平衡分析

向日葵群體標(biāo)記間的連鎖不平衡分析顯示,對(duì)于全部群體SSR標(biāo)記間的r2值的范圍在0-1之間,平均為0.02；而D′值在0-1之間,D′平均值達(dá)0.26.在選用D′來(lái)計(jì)算標(biāo)記位點(diǎn)間的連鎖不平衡時(shí),共有1320個(gè)SSR標(biāo)記成對(duì)位點(diǎn)組合中存在連鎖不平衡,占所有標(biāo)記可能成對(duì)位點(diǎn)組合的99%.其中25%的標(biāo)記成對(duì)位點(diǎn)組合中存在較高水平的連鎖不平衡(D′>0.4),其中統(tǒng)計(jì)概率p<0.01的組合有67對(duì),占5%.

2.3 向日葵群體分枝和株高性狀關(guān)聯(lián)分析及其等位變異表型效應(yīng)

向日葵開(kāi)花期調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,所研究的向日葵群體共有84份材料表現(xiàn)為不分枝,44份材料具有分枝性狀.收獲期向日株高性狀統(tǒng)計(jì)表明,株高為0.4米的有8份材料,0.5米的有6份材料,0.6米的有5份材料,0.7米的有2份材料, 0.8米的有26份材料, 0.9米的有6份材料, 1米的有49份材料, 1.1米的有15份材料, 1.2米的有7份材料, 1.3米的有4份材料,所有株高性狀呈現(xiàn)極端株高類型數(shù)目少,中等株高類型的材料占多數(shù).

利用structure軟件中得到的各向日葵個(gè)體相應(yīng)的Q值作為協(xié)變量,分別對(duì)向日葵分枝和株高性狀的表型值和標(biāo)記變異進(jìn)行回歸性分析,計(jì)算其相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)及其等位變異.結(jié)果顯示：在所檢測(cè)的利用62對(duì)ORS標(biāo)記位點(diǎn)中,共有9個(gè)位點(diǎn)與性狀相關(guān)(見(jiàn)表2).其中8個(gè)位點(diǎn)與向日葵分枝性狀相關(guān)聯(lián),其中有6個(gè)位點(diǎn)顯著關(guān)聯(lián)(p<0.001),分別是ORS679、ORS 227-1、ORS16、 ORS22、 ORS33和ORS38；解釋表型變異8%-16%不等,6個(gè)位點(diǎn)顯著關(guān)聯(lián)(p<0.01),分別是ORS803、ORS 227-2；在株高性狀狀中,有3個(gè)位點(diǎn)顯著關(guān)聯(lián)(p<0.01),分別是ORS679,ORS9、ORS22,解釋表型變異4%-6%不等.

表2 與性狀相關(guān)聯(lián)(p<0.01和p<0.001)的標(biāo)記位點(diǎn)及其表型變異解釋率

3 討論

向日葵多頭植株花期較長(zhǎng),在向日葵雜交種制種過(guò)程中常作為父本,可以解決單頭親本間花期難于相遇的問(wèn)題,顯著提高向日葵雜交制種的產(chǎn)量.因此在向日葵種質(zhì)資源研究中向日葵多頭分枝性狀是很重要的農(nóng)藝性狀.文獻(xiàn)[9]將多頭性狀定位到第10號(hào)染色體上的ORS1088和ORS908之間.本研究定位到8個(gè)位點(diǎn)與向日葵分枝性狀相關(guān)聯(lián),分別是ORS679、ORS 227-1、ORS16、ORS22、ORS33、ORS38、ORS803、ORS 227-2,解釋表型變異8%-16%不等,和已發(fā)表的向日葵圖譜比對(duì)只有ORS679位于17號(hào)染色體,ORS803定位于16號(hào)染色體,其它標(biāo)記未能與向日葵已知的連鎖群比對(duì)上.本研究中的關(guān)聯(lián)分析表明在所研究的向日葵資源材料中,向日葵分枝性狀由多數(shù)基因位點(diǎn)控制,一些定位到的向日葵分枝位點(diǎn)可能是以前文獻(xiàn)所沒(méi)報(bào)道過(guò).向日葵莖干倒伏給向日葵生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失.然而降低植株高度將有助于增強(qiáng)莖干強(qiáng)度,減少倒伏,從而提高產(chǎn)量,因此現(xiàn)在育種的策略就是開(kāi)發(fā)矮桿的種質(zhì)資源,以利于其在育種中應(yīng)用.本研究在株高性狀狀態(tài)中,有3個(gè)位點(diǎn)顯著關(guān)聯(lián)(p<0.01),分別是標(biāo)記ORS679,ORS9、ORS22,解釋表型變異4%-6%不等.本研究檢測(cè)到的株高關(guān)聯(lián)位點(diǎn)不多,主要原因可能還是株高是由復(fù)雜數(shù)量性狀基因控制,同時(shí)所研究的分子標(biāo)記數(shù)量還不夠多,因此在今后研究工作當(dāng)中應(yīng)繼續(xù)增加標(biāo)記數(shù)量.

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(編校：李由明)

Correlation Analysis on the Branches and Plant Height of the Sunflower

LIU Sheng-li1, DUAN Wei1, WANG Peng1,LIU Yan-Tao1,WANG Pei-zheng2

(1.Xinjiang Academy of Agricultural Reclamation Science, Shihezi Xinjiang 832000, China;2.School of Life Science and Ecology, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022, China;3.Xinjiang Kangdi Seed Science & Technology Co.Ltd, Urumqi 830011, China)

According to the variety of △K, 128 sunflower inbred lines, analyzed by using the structure software, were divided into 2 groups.The Linkage disequilibrium between the markers shows that r2value is in the range of 0-1 with an average of 0.02.When D′ was applied to calculate the linkage disequilibrium between loci, 25% of the marker paired point combination has a high level of linkage disequilibrium (D′>0.4).Result of the correlation analysis showed that 8 marker loci were found to correlate with branch traits, of which, 6 loci—ORS679, ORS 227-1,ORS16, ORS22, ORS33 and ORS38 with phenotypic variation ranging from 8%-16%—arep<0.001, 2 loci—ORS 803 and 227-2 arep<0.01, 3 loci—ORS679, ORS9, ORS22—are signif-icantly associated with the traits of plant height withp<0.01, with their phenotypic variation ranging from 4%-6%.The collection of the identified candidate loci provides a pool of promising for the future application of molecular marker technology in the sunflower breeding.

sunflower; population structure; correlation analysis

格式：劉勝利，段維，王鵬，等.向日葵分枝和株高性狀的關(guān)聯(lián)分析定位研究[J].海南熱帶海洋學(xué)院學(xué)報(bào),2017，24(2)：80-84+95.

2016-09-15

新疆兵團(tuán)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2016AC024,2016AC027)；三亞市院地科技合作項(xiàng)目(2013YD41)

劉勝利(1967-),男,山東寧津人, 新疆農(nóng)墾科學(xué)院研究員,研究方向?yàn)橄蛉湛缕贩N選育與栽培推廣.

王沛政(1972-),男,陜西長(zhǎng)安人,海南熱帶海洋學(xué)院熱帶生物與農(nóng)學(xué)院副教授,博士,研究方向?yàn)榉肿舆z傳育種.

S565.5

A

2096-3122(2017) 02-0080-05

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.02.16