利用大腸桿菌全細(xì)胞催化賴氨酸發(fā)酵液生產(chǎn)1,5-戊二胺

齊雁斌，馬偉超，陳可泉

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816）

利用大腸桿菌全細(xì)胞催化賴氨酸發(fā)酵液生產(chǎn)1,5-戊二胺

齊雁斌，馬偉超，陳可泉

（南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816）

1,5-戊二胺是一種具有生物活性的生物胺。賴氨酸脫羧酶可以催化L-賴氨酸生產(chǎn)1,5-戊二胺。為了減少生產(chǎn)成本，本文利用大腸桿菌AST1以賴氨酸發(fā)酵液作為底物進(jìn)行全細(xì)胞催化生產(chǎn)1,5-戊二胺。研究轉(zhuǎn)化pH、菌體濃度、轉(zhuǎn)化溫度、磷酸吡哆醛（PLP）添加量以及不同酸種類對轉(zhuǎn)化的影響，并對菌體的重復(fù)利用性進(jìn)行了研究。在最優(yōu)條件下：pH6.8、轉(zhuǎn)化溫度37℃、PLP添加量0.1mmol/L、菌體濃度（DCW）2.5g/L，用乙酸來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化過程pH，可以轉(zhuǎn)化含有賴氨酸123.8g/L的發(fā)酵液，得到含有86.18g/L戊二胺的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到99.61%。并且菌體在賴氨酸發(fā)酵液中重復(fù)利用5次的情況下轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到50%以上，重復(fù)利用性明顯比在賴氨酸溶液中轉(zhuǎn)化時強(qiáng)，這極大程度地節(jié)約了生產(chǎn)成本，為1,5-戊二胺連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。

1,5-戊二胺；賴氨酸發(fā)酵液；全細(xì)胞轉(zhuǎn)化；工業(yè)化生產(chǎn)

1,5-戊二胺（1,5-pentanediamine，簡稱戊二胺），即尸胺，是生物體內(nèi)廣泛存在的具有生物活性的含氮堿，為蛋白質(zhì)腐敗時賴氨酸在脫羧酶作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)時生成的產(chǎn)物。在工業(yè)上是一種極為重要的化工原料，與己二酸、琥珀酸和癸二酸等二元酸聚合可分別形成新型材料聚酰胺5.6、聚酰胺5.4和聚酰胺5.10[1-3]。由于1,5-戊二胺具有多種生物活性及工業(yè)用途，所以具有較高的市場價值。

目前合成戊二胺的方法有化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法、微生物發(fā)酵生產(chǎn)法等[4-6]?；瘜W(xué)合成法條件苛刻、污染環(huán)境；酶轉(zhuǎn)化法過程復(fù)雜、成本較高；微生物直接發(fā)酵生產(chǎn)法雖相對生產(chǎn)原料成本較低，但直接發(fā)酵生產(chǎn)的戊二胺含量較低，且發(fā)酵液成分復(fù)雜，副產(chǎn)物多，產(chǎn)物的分離純化比較困難。全細(xì)胞催化是介于發(fā)酵法和酶法之間的一種生物催化技術(shù)[7]。它結(jié)合發(fā)酵法和酶法的優(yōu)勢，利用這些優(yōu)勢，全細(xì)胞催化已應(yīng)用于戊二胺等有毒物質(zhì)生產(chǎn)中。MA等[8]在大腸桿菌中過表達(dá)PelB、CadB、CadA基因，通過對表達(dá)方式和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，最終使尸胺濃度達(dá)到221 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到92 %；OH等[9]利用全細(xì)胞催化生產(chǎn)戊二胺，通過轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.9%。

本文利用大腸桿菌AST1進(jìn)行全細(xì)胞催化賴氨酸發(fā)酵液生產(chǎn)1,5-戊二胺，通過對轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，提高了轉(zhuǎn)化率，并篩選能夠多次重復(fù)利用的菌株，在減少賴氨酸加入的同時也為1,5-戊二胺的連續(xù)生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

賴氨酸大腸桿菌工程菌株（E. coli NT1003），該菌株保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（No. M 2013239）。賴氨酸脫羧酶大腸桿菌工程菌株（Escherichia coli AST1）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉5，瓊脂15，氨芐青霉素0.1，氯霉素0.068。

種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉5，氨芐青霉素0.1，氯霉素0.068。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 2，氯化銨 1，十二水合磷酸氫二鈉17.1，磷酸二氫鉀 3，氯化鈉0.5，硫酸鎂0.12，七水合硫酸亞鐵 0.00028，氯化鈣 0.011，乳糖 3，氨芐青霉素 0.1，氯霉素 0.068，微量元素混合液0.1%（體積比）。

微量元素混合液：(NH4)6Mo7O243×10–9mol/L，H3BO34×10–7mol/L，CoCl2·6H2O 3×10–8mol/L，CuSO4·5H2O 1×10–8mol/L，MnCl2·4H2O 8×10–8mol/L，ZnSO4·7H2O 1×10–8mol/L。

1.3 試劑與儀器

戊二胺純品購于梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；丹磺酰氯購于Sigma公司；氨芐青霉素和氯霉素購于上海生工生物有限公司；NaCl、蛋白胨、酵母粉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉等購于南京晚晴化玻有限公司。

1.4 L級聯(lián)發(fā)酵罐Mulitifor HT；高速冷凍離心機(jī)eppendorf 5810R；SBA-40E雙通道生物傳感儀；戊二胺濃度測定采用安捷倫1290液相色譜系統(tǒng)和安捷倫TC-C18色譜柱（4.6×250 mm）。

1.4 賴氨酸發(fā)酵液的制備

以大腸桿菌E. coli NT1003作為出發(fā)菌株，在7.5L發(fā)酵罐做補(bǔ)料分批發(fā)酵，發(fā)酵72h得到賴氨酸含量為123.8g/L的賴氨酸發(fā)酵液。詳細(xì)步驟見參考文獻(xiàn)[10]。

1.5 重組大腸桿菌 AST1產(chǎn)賴氨酸脫羧酶發(fā)酵培養(yǎng)

1.5.1 種子培養(yǎng)

從凍存甘油管里吸取菌液接種于液體種子培養(yǎng)基，37℃，200r/min培養(yǎng)6h。

1.5.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

按10%接種量將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至終體積為4L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，待OD600約為4～5時加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后收集菌體。

1.6 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,5-戊二胺

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法參考文獻(xiàn)[11]。

1.7 L-賴氨酸和1,5-戊二胺的測定

使用SBA-40E雙通道生物傳感儀測定L-賴氨酸濃度，戊二胺濃度測定采用安捷倫1290液相色譜系統(tǒng)和安捷倫TC-C18色譜柱（4.6×250mm）。柱溫(40±1)℃，流速1.0mL/min; 進(jìn)樣量10μL；熒光激發(fā)波長為350nm，發(fā)射波長為520nm。紫外檢測器波長250nm[12]。

1.8 轉(zhuǎn)化條件對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1,5-戊二胺的影響

在1.4L級聯(lián)發(fā)酵罐上以賴氨酸發(fā)酵液作為底物進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體系為500mL，首先選擇適合在發(fā)酵液轉(zhuǎn)化的宿主菌，然后分別考察轉(zhuǎn)化溫度、轉(zhuǎn)化pH、菌體濃度、磷酸吡哆醛（PLP）添加量以及不同酸種類對轉(zhuǎn)化的影響，并比較了菌株在發(fā)酵液中和賴氨酸溶液中的重復(fù)利用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 分別以賴氨酸發(fā)酵液和賴氨酸溶液作為底物轉(zhuǎn)化

由于賴氨酸發(fā)酵液中成分比較復(fù)雜，里面的組成成分在一定程度上會對賴氨酸脫羧酶的酶活產(chǎn)生影響，因此本實(shí)驗(yàn)利用含有相同濃度的賴氨酸發(fā)酵液和賴氨酸溶液作為底物進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)戊二胺，對比其轉(zhuǎn)化效果，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，在含有相同濃度賴氨酸的情況下，利用賴氨酸發(fā)酵液來作為底物生產(chǎn)戊二胺的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化速率比利用賴氨酸溶液為底物要快，這可能是由于賴氨酸發(fā)酵液中的一些物質(zhì)可以提高賴氨酸脫羧酶的酶活。由此可以看出利用賴氨酸發(fā)酵液代替賴氨酸溶液作為底物進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)戊二胺是可行的。

圖1 賴氨酸發(fā)酵液和賴氨酸溶液在發(fā)酵過程中的濃度變化

2.2 轉(zhuǎn)化溫度對全細(xì)胞催化的影響

全細(xì)胞催化其本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的酶參與催化反應(yīng)。溫度對酶活性的影響很大，溫度過低會降低轉(zhuǎn)化效率，而溫度過高則可能會破壞酶的結(jié)構(gòu)，使酶失活。因此，本實(shí)驗(yàn)考察不同溫度對轉(zhuǎn)化過程的影響，結(jié)果圖2。

圖2 溫度對轉(zhuǎn)化過程的影響

由圖2可以看出，在25～37℃時，隨著溫度升高，戊二胺的濃度呈現(xiàn)出由低到高趨勢，溫度超過37℃時，1,5-戊二胺產(chǎn)量呈現(xiàn)出降低的趨勢；而當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度為37℃時，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化速率快，轉(zhuǎn)化3h后轉(zhuǎn)化液中1,5-戊二胺的含量為42.06g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.08%。這是由于溫度在酶反應(yīng)最適溫度附近變化時酶的活性也隨之發(fā)生變化，但溫度高于最適溫度，酶的高級結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致酶的活性降低[13]。因此，選擇最適轉(zhuǎn)化溫度為37℃。

2.3 pH對全細(xì)胞催化的影響

酶促反應(yīng)會受到pH的影響，酶在反應(yīng)條件下，都有其最適的pH，在最適pH條件下，酶活性最高，低于或者高于最適pH，酶的活力都會出現(xiàn)一定程度下降。另外pH還會改變底物的解離狀態(tài)，影響底物與酶的特異性結(jié)合[14]。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的pH梯度為2.0、3.0、4.0、5.0、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0，考察了轉(zhuǎn)化過程中不同pH對轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果如圖3。

圖3 pH對轉(zhuǎn)化的影響

從圖3中可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)化pH在5以下時催化效率非常低，戊二胺濃度不高；當(dāng)pH超過6.8時戊二胺濃度開始降低，這說明過酸過堿都會對轉(zhuǎn)化造成影響。當(dāng)pH在5～6.8之間時催化效率較高，戊二胺濃度也較高，說明酶在此pH區(qū)間活性較高；這與文獻(xiàn)[15-16]中報道的適宜pH相符，其中當(dāng)pH值為6.8時戊二胺產(chǎn)量最高，在轉(zhuǎn)化3h后轉(zhuǎn)化液中戊二胺的含量可以達(dá)到54.76g/L，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到63.28%，因此本實(shí)驗(yàn)確定最佳初始pH為6.8。

2.4 菌體濃度對全細(xì)胞催化的影響

由于本實(shí)驗(yàn)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化所用的賴氨酸脫羧酶屬于胞內(nèi)酶，故菌體量與酶量具有正相關(guān)，由于在酶促反應(yīng)過程中酶量較少會造成底物抑制，酶量過多則會造成浪費(fèi)，因此在反應(yīng)中選擇合適的酶量具有很大意義。本實(shí)驗(yàn)考察菌體濃度對轉(zhuǎn)化過程的影響，結(jié)果如圖4。

由圖4可知，當(dāng)菌體濃度（DCW）在1～2.5g/L之間時隨著菌體濃度的增大，轉(zhuǎn)化液中戊二胺的含量也在不斷增加。當(dāng)菌體濃度（DCW）為3g/L時，酶的催化速率較高，但與菌體濃度（DCW）2.5g/L相比單位時間內(nèi)產(chǎn)物增加量不是很明顯。因此本實(shí)驗(yàn)確定最適菌體濃度（DCW）為2.5g/L。轉(zhuǎn)化3h后轉(zhuǎn)化液中戊二胺的含量為73.19g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到86.23%。

圖4 菌體濃度對轉(zhuǎn)化過程的影響

2.5 磷酸吡哆醛的添加量對全細(xì)胞催化的影響

磷酸吡哆醛（PLP）可以參與氨基酸的轉(zhuǎn)氨和脫酸反應(yīng)，是氨基酸代謝過程的輔酶，在脫羧反應(yīng)中添加PLP可以促進(jìn)酶的催化速率。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了添加不同濃度的PLP對戊二胺生產(chǎn)的影響，結(jié)果如圖5。

圖5 PLP濃度對戊二胺生產(chǎn)的影響

由圖5可以看出，添加磷酸吡哆醛（PLP）可以明顯地提高轉(zhuǎn)化效率，當(dāng)PLP添加量在0～0.1mmol/L之間時隨著PLP添加量的加大，轉(zhuǎn)化液中戊二胺的含量也在逐漸增加，當(dāng)PLP添加量高于0.1mmol/L時轉(zhuǎn)化液中戊二胺含量并沒有明顯增加，因此本實(shí)驗(yàn)確定PLP最適添加量為0.1mmol/L，在此添加量下戊二胺濃度可達(dá)到81.26g/L，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到93.9%。

2.6 不同酸種類對全細(xì)胞催化的影響

由于戊二胺呈堿性，因此在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)戊二胺的過程中需要加入大量的酸來中和，從而保證賴氨酸脫羧酶在適宜的pH下進(jìn)行催化反應(yīng)。由于不同酸對細(xì)胞的損傷程度不同，且一些酸揮發(fā)性較強(qiáng)，不易于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。因此本實(shí)驗(yàn)通過利用不同酸來中和生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的戊二胺，考察不同種類的酸對細(xì)胞損傷程度以及對轉(zhuǎn)化效率的影響。

由圖6可以看出，當(dāng)選擇乙酸、丁二酸和己二酸來中和戊二胺時，轉(zhuǎn)化液中戊二胺的含量較高且轉(zhuǎn)化后菌體損失較少，但是由于丁二酸和己二酸溶解度較低，故在實(shí)驗(yàn)中需要加入固體顆粒，這使得操作變得復(fù)雜，不利于生產(chǎn)的進(jìn)行。而在使用甲酸進(jìn)行中和時，轉(zhuǎn)化液中戊二胺的含量與前三種有機(jī)酸相比較低，且菌體量損失相對較多，這可能是由于甲酸具有強(qiáng)氧化性和腐蝕性，對菌體傷害較重。而在使用無機(jī)酸中和戊二胺的過程中，濃鹽酸揮發(fā)性較強(qiáng)，不利于實(shí)驗(yàn)操作；而硫酸腐蝕性較強(qiáng)對菌體傷害較大且易腐蝕容器；磷酸相對與濃鹽酸和濃硫酸更有利于戊二胺的生產(chǎn)。綜合來看在轉(zhuǎn)化過程中利用乙酸來調(diào)節(jié)pH較為合適，轉(zhuǎn)化3h后轉(zhuǎn)化液中戊二胺的含量可達(dá)到86.18g/L，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到99.61%。

圖6 不同種類的酸對細(xì)胞損傷程度以及對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.7 菌株重復(fù)利用性的考察

由于全細(xì)胞催化是與菌體量有關(guān)的生物催化技術(shù)，因此在生產(chǎn)過程中需要收集菌體。如果菌體可以重復(fù)利用且保持很高的轉(zhuǎn)化效率，那么生產(chǎn)工藝將得到簡化，也能在一定程度上節(jié)約生產(chǎn)成本。因此本次實(shí)驗(yàn)在上述最優(yōu)條件下利用同一批菌體分別以賴氨酸發(fā)酵液和賴氨酸溶液為底物連續(xù)轉(zhuǎn)化6次，對比其重復(fù)利用的性能。

由圖7可以看出，菌體在兩種溶液中進(jìn)行1次轉(zhuǎn)化時均能得到較高的底物轉(zhuǎn)化率，其中在賴氨酸發(fā)酵液中其底物轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到99.61%，在賴氨酸溶液中其底物轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到99.52%。但是隨著轉(zhuǎn)化次數(shù)的增加，菌體在兩種溶液中的底物轉(zhuǎn)化率都在降低。而當(dāng)以賴氨酸溶液作為底物時，其底物轉(zhuǎn)化率降低的比較快，在經(jīng)過3次重復(fù)利用后底物轉(zhuǎn)化率就降到了50%以下。而當(dāng)以賴氨酸發(fā)酵液為底物進(jìn)行時，其重復(fù)利用性能明顯增強(qiáng)，在經(jīng)過5次重復(fù)利用時其轉(zhuǎn)化效率還能夠達(dá)到52%。這可能是賴氨酸發(fā)酵液中含有甜菜堿等物質(zhì)，可以保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的蛋白和酶的活性[17]。

圖7 菌株的重復(fù)利用性

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用大腸桿菌全細(xì)胞催化賴氨酸發(fā)酵液生產(chǎn)1,5-戊二胺，通過對其催化條件進(jìn)行優(yōu)化，在最優(yōu)條件：轉(zhuǎn)化pH6.8、轉(zhuǎn)化溫度37℃、PLP添加量0.1mmol/L、菌體濃度（DCW）2.5g/L；用乙酸來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化過程pH，可以轉(zhuǎn)化含有賴氨酸123.8g/L的發(fā)酵液，得到含有86.18g/L戊二胺的轉(zhuǎn)化液，底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)到99.61%。并且菌體在發(fā)酵液中重復(fù)利用5次的情況下底物轉(zhuǎn)化率依然可以達(dá)到50%以上，重復(fù)利用性明顯比在賴氨酸溶液中轉(zhuǎn)化時強(qiáng)，這極大地節(jié)約了生產(chǎn)成本，為1,5-戊二胺連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。

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1,5-pentanediamine production by using Escherichia coli whole-cell biocatalysis lysine fermentation liquid

QI Yanbin，MA Weicao，CHEN Kequan
（Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211816，Jiangsu，China）

1,5-pentanediamine is a bioactive biogenic amine. L-lysine decarboxylase can catalyze with L-lysine to produce 1,5-pentanediamine. To reduce the production cost，whole cell catalytic production of 1,5-pentanediamine was outperformed using Escherichia coli AST1 and with lysine fermentation broth as the substrate. The effects of transformation pH，cell concentration，transformation temperature，PLP addition amount，and different kinds of acid on the transformation and the reusability of the cells were investigated. At the optimal condition，0.1mmol/L PLP，2.5g/L DCW and pH as 6.8，37℃，86.18g/L of 1,5-pentanediamine was obtained by transforming the fermentation broth containing 123.8 g/L L-lysine，and adjusting the pH using the acetic acid during conversion process. Furthermore，the cells can be reused five times and the substrate conversion rate maintained above 50% in the lysine fermentation broth. The reusability was better than that in the lysine solution，which greatly reduces the production cost and lays a foundation for 1,5-pentanediamine commercial production.

1,5-pentanediamine；lysine fermentation liquid；whole-cell biocatalysis；commercial process

TQ033

：A

：1000–6613（2017）05–1843–05

10.16085/j.issn.1000-6613.2017.05.036

2016-10-11；修改稿日期：2016-12-21。

國家自然科學(xué)基金（21390200，31440024）、國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2011CBA00807）及國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2014AA021703）項(xiàng)目 。

齊雁斌（1993—），男，碩士研究生，主要研究微生物代謝與發(fā)酵。E-mail：18260037163@163.com。聯(lián)系人：陳可泉，博士，副教授，主要從事生物過程工程與系統(tǒng)工程領(lǐng)域的研究工作。E-mail：kqchen@njtech.edu.cn。