HCV感染引起Hsp72的過度表達Hsp72在感染HCV肝癌細胞增殖中的作用

王 曦， 周 巍， 陳 林

(1.上海市食品藥品檢驗所, 上海 2012032.上海五色石醫(yī)學研究有限公司， 上海 2012033.上?；瞪锛夹g有限公司， 上海 201203)

基礎醫(yī)學

HCV感染引起Hsp72的過度表達Hsp72在感染HCV肝癌細胞增殖中的作用

王 曦1， 周 巍2， 陳 林3

(1.上海市食品藥品檢驗所, 上海 2012032.上海五色石醫(yī)學研究有限公司， 上海 2012033.上?；瞪锛夹g有限公司， 上海 201203)

目的：評價感染丙型肝炎病毒(HCV)后熱激蛋白72(Hsp72)的表達和其在肝癌細胞的增殖和生長過程中的作用。方法：選取感染基因型為1a/1b的HCV慢性肝炎患者32例，HBV和HCV檢測為陽性患者20例，感染慢性肝炎病毒C的患者8例和未感染HBV、HCV或者HIV的肝轉移瘤作為對照組肝3例，活組織檢查樣本來自感染慢性HCV的患者，通過ELISA、定量PCR和免疫組化的方法分析Hsp72的表達。運用培養(yǎng)感染HCV/JFH1的肝細胞，通過siRNA和細胞增值的方法來評價Hsp72過度表達對肝癌細胞增殖的作用。結果：①感染HCV后，細胞內的Hsp72蛋白表達顯著上調。②HCV通過誘導NFAT5增加Hsp72的表達。③感染HCV后，Hsp72能促進人肝癌細胞的增殖。④MEK抑制劑PD98095可以抑制Hsp72對MAPK/MEK活化和細胞增殖。結論：Hsp72在HCV感染的HCC中過度表達通過激活MEK/ERk1/2而促進細胞增殖。應該重視Hsp72在治療HCV感染的HCC患者中的作用及其重要性。

肝炎病毒C； 熱激蛋白72； 肝癌細胞； 增 殖

肝炎病毒C(HCV)通?？梢猿掷m(xù)感染患者而引起慢性肝炎，慢性間質性肝炎和肝癌是全球性的健康問題。然而，HCV引起肝細胞致癌的詳細機制和病毒感染腫瘤的過程依然不清楚。熱激蛋白(Hsp)家族是細胞內高度保守的蛋白質分子，是細胞凋亡和蛋白平衡過程中主要的分子伴侶和生化調節(jié)劑[1]。HSPs廣泛的在人類腫瘤包括乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、肺癌和前列腺癌中過量表達[2]。研究顯示，Hsp72在腫瘤組織中表達強烈，并可作為檢測腫瘤的生物標志物，尤其是肝癌[3～7]。體外研究揭示，HCV編碼的蛋白和Hsp72相互作用能增加HCV擾亂細胞增殖或者損害DNA損傷后細胞的反應[8,9]。本研究中，我們檢測了經病毒感染后的細胞系和HCV感染的肝活組織檢查樣本中的Hsp72的表達，研究Hsp72對感染HCV的肝癌細胞系的生長和增殖的影響,并闡明其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 患者材料及檢測指標

1.1.1 肝炎患者材料：本實驗使用的血清樣本來32例感染基因型為1a/1b的HCV慢性肝炎患者。這些患者均未接受過化療。另外20例血樣樣本來自上海長征醫(yī)院的志愿者，并且HCV檢測為陽性。肝臟樣本來自福州軍區(qū)總醫(yī)院2010年至2013年間接受過肝臟活組織檢查的感染慢性肝炎病毒C的患者(n=8)。未感染HBV、HCV或者HIV的肝轉移瘤作為對照組(n=3)。臨床和病理檢查結果信息來自患者體格檢查和病理報告(表1)。所有研究均獲得患者同意并且簽字。正常肝組織樣本取自有轉移腫瘤肝葉周圍的正常組織。實驗方案由長征醫(yī)院和福州軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準。

表1 感染HCV患者臨床和病毒學參數(shù)

注：M,男性;F,女性。正常范圍:ALT,5-50U/L;AST,8-40U/L

1.1.2 檢測指標及方法：用免疫吸收劑分析試劑盒(ELISA)(Xinfan Biotechnology, 上海)檢測HCV感染患者血清中Hsp72的表達。用多克隆抗體對Hsp72進行免疫組織化學染色。肝組織片段切成4μm厚度，用濃度遞減的乙醇進行脫水。微波加熱20min回收10nM檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)中的抗原。組織片段用3%過氧化氫孵化阻斷內源性過氧化酶的活性，然后用1%BSA/PBS稀釋的一抗孵化。一抗孵化后，使用生物素標記的二抗孵育，接著用ABC(抗生物素-生物素-過氧化酶復合物技術)方法進行檢測。

1.2 細胞系及檢測指標

1.2.1 細胞系：Huh7.5.1是Huh7細胞HCV高感染的亞克隆細胞系，培養(yǎng)條件為：含10%胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱下培養(yǎng)。

1.2.2 檢測指標及方法

1.2.2.1 Huh7.5.1細胞感染：感染HCV的Huh7細胞(HCVcc)培養(yǎng)過程參照先前研究描述[10]。將含有全長嵌合基因組cDNA的HCV J6和JFH1的pFLJ6/JFH1質粒線性化，并作為模板用MEGAscript試劑盒(Promega)體外進行轉錄。用電穿孔的方法將體外轉錄的RNA轉到Huh7.5.1細胞中。通過收集轉染后8和18d的上清獲取病毒并且分裝保存在-80℃。參照先前研究中免疫染色的方法檢測Huh7.5.1細胞中的病毒滴度。Huh7.5.1細胞種植到24-孔板中，過夜培養(yǎng)，每孔加入50μL 5×105ffu/mL 的HCVcc上清，培養(yǎng)5h后除去上清，并用培養(yǎng)基清洗5次，最后用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。siRNA處理組，經HCVcc感染后第1天，細胞中分別加入20 nM目標siRNA和陽性對照siRNA進行細胞轉染。

1.2.2.2 siRNA的準備和轉染：Hsp72siRNA，NFAT5 siRNA和陽性對照siRNA (si NC )購自Santa Cluz 生物技術 (Santa Cruz, CA, USA)。用FUGeneHD轉染試劑(Roche, Indianapolis, IN, USA)按照說明書進行轉染。

1.2.2.3 實時定量PCR：用Trizol 試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)按照說明書操作分離得到總RNA。PCR得到RNA質量的最低要求為A260 nm/A280 nm比值為1.9，28S/18S 比值為1.8。將2 μg總RNA用SuperScript Ⅲ 第一鏈合成系統(tǒng)帶有特異性反向引物或者Oligo (dT) (Invitrogen)進行反轉錄。用SYBR RT-PCR試劑盒 (Takara, Shiga, Japan)進行擴增。在96孔板中95℃孵育反應5 min，接著95℃15 s 和 60℃1 min循環(huán)40次。在StepOne Plus 實時定量PCR儀 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)中進行PCR反應，用SDS v2.3軟件收集數(shù)據(jù)。β-actin作為內標。

1.2.2.4 Western蛋白印跡：在蛋白酶抑制劑cocktail (Complete mini, Roche)中加入含0.5%SDS的改良緩沖液用于提取Huh7.5.1細胞蛋白，將25mg細胞蛋白加入SDS-PAGE凝膠中進行電泳，轉移到PVDF膜上。用5%非脂牛奶進行封閉，將膜放入一抗中4℃條件下過夜孵育，然后用HRP-偶聯(lián)羊抗兔或者羊抗鼠抗體 (1:10000 稀釋, KPL, Gaithersburg, MA,USA)室溫孵育1h。最后用Super Signal West Pico 化學發(fā)光底物 (Pierce)激發(fā)信號，在Gene Gnome HR 圖像撲捉系統(tǒng) (Syngene, Frederick, MD, USA)進行觀察， Gene tools (Syngene) 進行分析。一抗是：Hsp72, NFAT5, HSF1, RAF, phosphor-RAF(p-RAF), MEK, p-MEK, ERK1/2 和 p-ERK1/2 多克隆抗體 (Abcam, MA) 和 β-actin 單克隆抗體 (ImmunoGen, 上海，中國)。

1.2.2.5 細胞增殖分析：siRNA在6-孔板中轉染細胞24h后，細胞重懸并接種到96-孔板，每孔1×104個，然后每孔加入10 μL 5mg/mL的MTT，37℃培養(yǎng)4 h后除去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，孵育10min，用微板閱讀儀(Model 550, Bio-Rad, Richmond, CA)讀取每孔細胞的吸光率。用重組Hsp72(Sigma)評價Hsp72對細胞增殖的影響和相關是信號通路。PD98095(Sigma)是MAP激活酶選擇抑制劑，用于抑制MEK/ERK信號通路。細胞用20μM PD98095預處理，然后用5μg/mL rHsp72孵育。

1.2.2.6 傷口愈合分析：將感染HCV J6/JFH1的Huh7.5.1 細胞接種到6-孔板中(2×105/孔)培養(yǎng)2d。確認細胞鋪滿板底后，用塑料片在培養(yǎng)板上劃痕，立刻清洗掉殘渣，顯微鏡下觀察并拍照。然后37℃培養(yǎng)48 h，觀察細胞并顯微鏡下拍照[11]并計算細胞運動的距離。傷口愈合計算方法：(劃痕寬度的平均值-剩下寬度的平均值)/劃痕寬度的平均值

1.2.2.7 細胞周期分析：處理48h后，用胰酶消化細胞后，每組收集2×106細胞用PBS洗2次，用冷70%乙醇在4℃下過夜固定。然后用PBS清洗細胞一次，用200μL RNase (1 mg/mL) 37℃消化30 min，在用800 μL碘化丙啶(50 μg/mL)室溫下染色30min，最后用EPICS Elite ESP 流式細胞儀(USA)分析細胞周期。

2 結 果

2.1 HCV感染上調Hsp72的表達：為了評價HCV感染后對Hsp72的表達作用，我們用ELISA的方法評價了32例來自臨床慢性HCV感染患者血清中的Hsp72水平。20例健康患者血清作為對照用于比較。與正常相比，患者血清中Hsp72水平顯著增加(圖1-a)。實時定量PCR分析感染HCV的肝組織活檢樣本中Hsp72mRNA水平。8例中有5例肝組織活檢樣本Hsp72mRNA水平(>3倍)顯著高于正常肝組織(圖1-b)，用柱形圖(圖1-c)比較對照組和HCV感染組肝組織活檢樣本中mRNA表達水平的平均值進一步證明與前面結果一致。接下來，我們用免疫組化染色評價HCV感染后Hsp72的表達情況。8例患者有6例患者肝細胞中發(fā)現(xiàn)Hsp72聚集，而對照組肝臟中只檢測到一點。在HCV感染患者的肝臟中，Hsp72定位主要在肝血竇和分散在肝葉的單個肝細胞細胞質里(圖1-d)。

為了證明Hsp72上調是否與HCV感染有關，對感染HCVcc J6/JFH1的細胞系Huh7.5.1中Hsp72的表達進行評價。收集不同時間點感染HCVcc的Huh7.5.1細胞，用實時定量PCR檢測Hsp72 的表達。在感染24h后Hsp72 的表達穩(wěn)定增加(圖1-e)。相反，沒有感染組的Hsp72表達在整個實驗過程中沒有顯著的變化(數(shù)據(jù)沒有列)。Western蛋白印記法分析結果同樣表明，Huh7.5.1感染HCVcc后每個時間點的Hsp72均過量表達(圖1-f)。以上結果表明，HCV感染能上調Hsp72的表達。

圖1 HCV感染上調Hsp72表達

(a) 比較感染HCV患者血清 (n=32) 與正常血清 (n=20) 中總Hsp72 的表達情況。 (b和c) 用實時定量PCR的方法比較感染HVC肝臟活組織檢查樣本與未感染HCV對照肝臟組織樣本 (C1-3) 中Hsp72 mRNA 表達情況。(d) 感染HCVcc J6/JFH1的Huh7.5.1細胞Hsp72免疫組化染色結果。(e) 感染HCVcc J6/JFH1 的Huh7.5.1細胞中Hsp72 mRNA 表達情況。(f) 感染HCVcc J6/JFH1的Huh7.5.1細胞中Hsp72蛋白表達情況。***P<0.001

2.2 HCV通過誘導NFAT5增加Hsp72 的表達：Hsp72的表達的是由HSF1和NFAT5轉錄因子調控[12]。為了調查這兩個因子是否參與HCV感染增加Hsp72 的表達，我們分析了感染HCVcc的肝癌細胞中NFAT5和HSF1蛋白表達水平。我們發(fā)現(xiàn)NFAT5水平增加，而HSF1總蛋白水平卻沒有改變(圖2-a)，并且NFAT5mRNA的水平也顯著增加(圖2-b)。為了進一步證明在NFAT5依賴轉錄激活中Hsp72水平是否由HCV的調控，對模擬感染和HCVcc感染的細胞轉染抗NFAT5 siRNA敲出內源性NFAT5。NFAT5沉默后，不但NFAT5mRAN的水平減少而且Hsp72mRNA的水平也減少圖 (2-c) 。同時HCVcc感染細胞中Hsp72 蛋白水平上調也在NFAT5沉默后降低(圖2-d)，這說明，HCV感染后通過誘導NFAT5上調Hsp72的表達。

圖2 HCV通過誘導NFAT5增加Hsp72表達水平

(a) Western blot 分析感染HCVcc的Huh7.5.1細胞溶解物中NFAT5 和HSF1 的表達情況。(b) NFAT5 mRNA 表達情況。 (c) NFAT5 siRNA下調NFAT5和Hsp72 mRNA 的表達。 (d) Huh7.5.1轉染NFAT5 siRNA后Hsp72蛋白表達情況。 *P<0.05

2.3 Hsp72沉默抑制HCV感染人肝癌細胞的增殖：Hsp72涉及腫瘤發(fā)生并可能通過各種致瘤產物相互作用介導致瘤性蛋白的形成，最后促進腫瘤細胞生長和增殖。用細胞增殖來評價感染HCV的HCC中Hsp72過量表達的意義。細胞層傷口愈合實驗表明，HCVcc感染細胞敲出Hsp72后傷口愈合的恢復比轉染對照siRNA的細胞慢(圖3-a、b)。此外，用MTT評價細胞增殖情況。經Hsp siRNA敲出Hsp72后，細胞增殖顯著降低(圖3-c)。接著，考察Hsp72過量表達對細胞周期的影響。如表3-c所示，Hsp72顯著抑制G1/S期。流式細胞檢測結果顯示，G2和S期細胞百分比降低，G0/G1期細胞百分比增加。而這些發(fā)現(xiàn)在對照中卻沒有出現(xiàn)。

圖3 Hsp72 沉默抑制感染HCV的Huh7.5.1細胞增殖并且是細胞周期阻滯在S期

(a) 轉染48h后熒光顯微鏡下觀察EDU標記的復制細胞。(b)EDU陽性細胞百分比。(c)轉染48h后流式細胞儀檢測細胞周期分別情況。(d)細胞周期結果圖譜。*P<0.05,**P<0.001

2.4 Hsp72通過激活MEK/ERK信號通路誘導HCV感染肝癌細胞增殖：為了確定Hsp72誘導了哪條信號通路而促進細胞增殖，HCV感染的肝癌細胞轉染Hsp72 siRAN或者siNC后，檢測細胞蛋白中RAF, MEK, phosphor-MEK (p-MEK), ERK1/2 和 p-ERK1/2的表達。結果表明RHsp72顯著誘導細胞增值和p-MEK的表達(圖4-a、b)，Hsp72敲除后顯著下調p-MEK和p-MEK1/2的表達(圖4-a)。通過在細胞中加入MEK抑制劑PD98095來研究MEK/ERK1/2通路參與的過程。PD98095能顯著減少rHsp72誘導的HCV感染后Huh7.5.1細胞的增加(圖4-c)。這些結果說明MEK/ERK1/2信號通路介導Hsp72誘導HCV感染后的肝癌細胞增殖。

圖4 MEK/ERK信號通路參與Hsp72誘導的細胞增殖。

(a)處理24h后CK8分析不同劑量rHSP72對細胞增殖的影響。(b)處理60h后RAF,MEK,ERK1/2蛋白表達水平和其磷酸化形式(對照,5μg/mL rHsp72,陽性對照siRNA和20nM Hsp72 siRNA)。(c)細胞經5μg/mL rHsp72 或者20μM MEK 抑制劑(PD98095)孵育24h后 CCK8 分析表明，Hsp72誘導細胞增值是由MEK/ERK1/2信號通路介導的。。*P<0.05, ** P<0.01

3 討 論

熱激蛋白能防止蛋白經過熱激或者其他刺激后變性[13]。HCV感染能引起細胞應答包括應激反應蛋白如Hsp72。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性感染HCV患者的血清及肝活組織檢查樣本中Hsp72均顯著增加。同時，對感染HCV的肝細胞進行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)細胞中Hsp72的表達也顯著增加。Hsp72的表達是受兩種不同的轉錄因子HSF1和NFAT5調控。我們發(fā)現(xiàn)HSF1蛋白水平不受HCV感染的影響。然而，NFAT5蛋白水平和mRNA水平卻顯著增加。將NFAT5沉默后，Hsp72表達水平顯著降低。結果說明，經HVC感染后，Hsp72上調是受NFAT5誘導介導的。

眾所周知Hsp72是細胞內分子伴侶，協(xié)助細胞中蛋白折疊特別是在應激的時候[14]。在對應激和損傷應答時，Hsp72可能會從已經溶解的細胞和通過受體介導胞吐作用從肝臟細胞中釋放出來[15]。很多體內外研究已經證明細胞外Hsp72可能擔任應激應答的調節(jié)子[16-19]。一些研究認為，Hsp72涉及到腫瘤的發(fā)生，并且可能與一些致瘤產物(c-myc,p53,scr,c-fos,Rb)相互作用而調節(jié)致瘤蛋白的構成，最后促進腫瘤細胞生長和增殖[20-23]。另外，Hsp72被證明能是大量刺激引起凋亡的蛋白抑制劑[24]。癌組織細胞中大量表達Hsp72可能會使細胞抵抗環(huán)境應激而提高活性。

本研究證明，感染HCV后Hsp72過度表達能促進肝癌細胞增殖。將Hsp72沉默后，HCV感染的Huh7.5.1細胞增殖顯著被抑制，G0/G1期細胞數(shù)量也顯著增加，G2期和S-期細胞數(shù)量顯著降低。細胞周期在調節(jié)腫瘤細胞生長和凋亡中起著重要的作用。目前研究[25]已經提出，HSPs可能通過與某些原癌基因產物結合參與細胞生成和增殖從而調節(jié)一些如信號轉導或者細胞周期的進程。Hsp72是細胞進入S期的必需蛋白。本實驗結果顯示，Hsp72沉默誘導HCV感染的Huh7.5.1細胞滯留在G0/G1期，從而不能進入S期。這些結果證明，Hsp72和HCV-HCC之間的功能和機制關系，強調Hsp72在HCV-HCC分子病因方面對惡性增殖調控的重要作用。

Hsp72在保護細胞免受損失調節(jié)的各種靶點包括Bax，細胞色素C釋放，磷脂酶A2抑制劑和p38/MAPK與細胞增殖有關[26]。本實驗結果表明，MEK/ERK1/2信號通路參與Hsp72誘導HCV感染后的肝癌細胞的增殖。Hsp72敲出后，p-MEK和P-ERK1/2表達水平顯著下調。加入抑制劑PN98095后，rHSp72誘導的經HCVcc感染的Huh7.5.1細胞增殖也減少?？傊?，本實驗結果證明，Hsp72通過MEK/ERK信號通路促進HCV感染的肝癌細胞增殖。然而，我們也應該考慮HCV對MEK/ERK信號通路的直接影響。我們之前的報告提出，HCV蛋白能通過沿著信號通路的多個步驟介導MAPK(ERK)信號。說明，HCV E2蛋白激活MAPK(ERK)通路促進人肝癌細胞Huh7細胞增殖。最近研究提出，Hsp72可能直接通過磷酸化作用激活MEK/ERK1/2。我們之前的報告沒有描述上游刺激因子表達，也有可能HCV蛋白通過激活各種刺激因子調節(jié)MAPK(ERK)通路，包括Hsp72。正如該研究報告，我們進一步闡明了Hsp72參與MEK/ERK1/2信號通路，并且促進HCV感染的肝癌細胞增殖。

綜上所述，最近研究結果證明，Hsp72在HCV感染的肝癌細胞中過度表達可以通過激活MEK和Erk1/2促進細胞增殖。Hsp72過度表達的結果對感染HCV的HCC患者的治療有負影響。Hsp72過度表達可以作為治療感染HCV的HCC患者的潛在靶標，以后的研究將研究該可能性。

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Over-expression of Hsp72 Induced by Hepatitis C virus: Role of Hsp72 in Proliferation of Hepatocellular Carcinoma with HCV Infection

WANGXi,etal

(InstituteforFoodandDrugControlinShanghai,Shanghai201203,China)

Objective:To investigate the expression of Heat shock protein 72(Hsp72) in HCV infection and its role on the growth and proliferation of hepatocellular carcinoma cells with hepatitis C virus (HCV) infection. Methods: Sera and liver biopsy specimens from patients chronically infected with HCV were obtained for analysis of Hsp72 expression by ELISA, quantitative PCR and immunohistochemical staining. Hepatocytes upon infection with cell culture-grown HCV J6/JFH1 were used to investigate the role of over-expressed Hsp72 in proliferation of hepatocellular carcinoma cell with HCV infection by siRNA and cell proliferation assays. Results: Hsp72 expression was significantly upregulated in HCV infection. HCV increases Hsp72 expression level via induction of NFAT5. Hsp72 promotes proliferation of human hepatocellular carcinoma cells with HCV infection. The MAPK/MEK activation and cell proliferation driven by Hsp72 were suppressed by MEK inhibitor PD98095. Conclusions: The over-expressed of Hsp72 in HCV related HCC contributes to cell proliferation by activating MEK/Erk1/2. The role of Hsp72 and its importance for elimination of HCV in patients with HCC needs to take into account.

Hepatitis virus C; Heat shock protein 72; Hepatocellular carcinoma; Proliferation

1006-6233(2017)04-0645-06

上海市2015年度“科技創(chuàng)新行動計劃”生物醫(yī)藥領域產學研醫(yī)合作項目,(編號：15DZ1940700)

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.04.034