超聲法提取杏鮑菇菌糠總黃酮工藝

楚祿建　劉陽　朱單潔　李佩佩　李熱　賀曉龍　王延峰

摘 要：對杏鮑菇菌糠中總黃酮含量進(jìn)行提取，以獲取最佳提取工藝。采用超聲輔助提取法，以總黃酮得率為指標(biāo)，利用單因素考察了乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲功率對杏鮑菇菌糠中總黃酮提取率的影響；在單因素基礎(chǔ)上利用正交試驗設(shè)計對超聲輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，杏鮑菇菌糠中總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度70%，料液比1∶30 （g·mL-1），超聲時間25 min，超聲功率350 W，該提取條件下，總黃酮的提取率為1.995%±0.019%。在該條件下總黃酮得率較高且比較穩(wěn)定，具有一定現(xiàn)實意義。

關(guān)鍵詞：杏鮑菇菌糠；總黃酮；超聲波輔助法；提取率

中圖分類號：S646.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.011

Abstract： In order to obtain the best extraction process， the content of total flavonoids in P.eryngii was extracted from this experiment. Ultrasound assisted extraction was used， took the yield of total flavonoids as the index， the effect of ethanol concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic time， ultrasonic power on total flavonoids extracted from eryngiibacterial chaff was reviewed. The results showed that the optimum extraction process of total flavonoids from eryngiibacterial chaff were ethanol concentration 70%， material liquid ratio 1∶30 （g·mL-1）， ultrasonic time 25 min， ultrasonic power 350 W， under this extraction condition， the extraction rate of total flavonoids was 1.995%±0.019%. And under this condition， the yield of total flavonoids was high and relatively stable.

Key words： P.eryngii funigus chaff； total flavonoids； ultrasonic method； extraction rate

杏鮑菇菌糠，又名菌渣、菌糠、杏鮑菇菌渣等，是指已經(jīng)出菇之后，營養(yǎng)成分被完全利用或未被完全利用的菌包。工廠為了追求最大的經(jīng)濟利益，杏鮑菇在實際生產(chǎn)過程中，通常只出一潮菇，這使得菌包中的營養(yǎng)成分不能被完全利用，便隨意堆積或者隨處丟棄，在造成嚴(yán)重資源浪費的同時，也給生態(tài)環(huán)境帶來了嚴(yán)重的污染[1]。本研究欲從杏鮑菇菌糠中提取黃酮類化合物，旨在為了減少菌糠不能完全利用帶來的資源浪費以及隨意丟棄造成的環(huán)境污染。

黃酮類化合物是自然界廣泛存在的一種天然化合物，有多種藥用價值，如降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老等作用，已成為國內(nèi)外研究的熱點[2]。目前，有關(guān)黃酮類化合物提取的方法有很多種，如水提法、醇提法、微波輔助法、超聲波輔助法、酶解法、高壓脈沖電場輔助提取法等。其中超聲波輔助提取法是利用超聲波產(chǎn)生的機械振動作用和空化作用，破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速胞內(nèi)有效成分的釋放與溶出的一種新方法。超聲提取技術(shù)與傳統(tǒng)的浸泡法相比，加快了活性物質(zhì)的浸提速度，縮短了時間，提高了活性成分的提取率[3]。因此，本研究選用超聲波輔助提取法來研究此法對杏鮑菇菌糠總黃酮提取含量的影響。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑及儀器

杏鮑菇菌糠，由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，烘干，粉碎，過篩（備用）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、強氧化鈉等，均為國產(chǎn)分析純。

FW100型高速萬能粉碎機；101-3BS型電熱鼓風(fēng)干燥箱；SCIENZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋；SHZ-D（HD）循環(huán)水式真空泵；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；UV-2600紫外可見分光光度計等實驗室常用儀器和設(shè)備。

1.2 試驗方法

1.2.1 杏鮑菇菌糠總黃酮的提取工藝 新鮮菌糠→干燥至恒質(zhì)量→粉碎→過孔徑0.25 mm的篩→石油醚脫脂→回收石油醚→超聲提取→過濾→定溶→測定[4-6]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 取一定量蘆丁為標(biāo)品，在110 ℃烘干至恒質(zhì)量，精確秤取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用70%的乙醇溶液溶解并定容至100 mL，使其濃度為100 μg·mL-1。再將此溶液用70%乙醇溶液分別稀釋至0，20，40，60，80，100 μg·mL-1。然后各取1 mL于10 mL具塞比色管中，各加70%乙醇溶液1 mL，5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4%NaOH溶液2 mL。最后用蒸餾水定容至5 mL，搖勻，靜置15 min。以加入0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的比色管作為參照，在510 nm處測其吸光度A，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 杏鮑菇菌糠總黃酮含量的測定 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系絡(luò)合化學(xué)吸光法于510 nm處測定提取液中的吸光度，從而確定總黃酮含量。計算公式如下：

黃酮含量=（C×V1×N）/（W×V2×1 000） ×100%

式中：C為提取液中黃酮含量（mg）；V1為總樣品體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量（g）；V2為測定樣品體積。

1.2.4 乙醇濃度對總黃酮含量的影響 準(zhǔn)確稱量杏鮑菇菌糠粉末1.0 g，放入150 mL三角瓶中，加入不同濃度乙醇水溶液30 mL，設(shè)定超聲時間15 min，超聲功率250 W，乙醇濃度分別為50%，60%，70%，80%，90%。冷凍離心后取上清液測定吸光度，計算樣品中總黃酮的含量。

1.2.5 料液比對總黃酮含量的影響 準(zhǔn)確稱量杏鮑菇菌糠粉末1.0 g，放入150 mL三角瓶中，加入不同倍數(shù)的70%乙醇水溶液，設(shè)定超聲時間15 min，超聲功率250 W，乙醇用量分別為20，25，30，35，40 mL。冷凍離心后取上清液測定吸光度，計算樣品中總黃酮的含量。

1.2.6 超聲提取時間對總黃酮含量的影響 準(zhǔn)確稱量杏鮑菇菌糠粉末1.0 g，放入150 mL三角瓶中，加入70%乙醇水溶液30 mL，設(shè)定超聲功率250 W，超聲提取時間分別為5，10，15，20，25 min。冷凍離心后取上清液測定吸光度，計算樣品中總黃酮的含量。

1.2.7 超聲功率對總黃酮含量的影響 準(zhǔn)確稱量杏鮑菇菌糠粉末1.0 g，放入150 mL三角瓶中，加入70%乙醇水溶液30 mL，設(shè)定超聲時間15 min，超聲功率分別為50，100，150，200，250 W。冷凍離心后取上清液測定吸光度，計算樣品中總黃酮的含量。

1.2.8 正交試驗設(shè)計 以總黃酮的得率為指標(biāo)，在單因素基礎(chǔ)上，選取每個因素提取率最佳的3個水平，設(shè)計L9（34）表進(jìn)行正交試驗，優(yōu)化杏鮑菇菌糠中總黃酮提取工藝條件，如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

2.2 乙醇濃度對總黃酮含量的影響

由圖2可知，在乙醇濃度小于70%時， 總黃酮的提取率隨溶劑濃度增大而增大，當(dāng)乙醇濃度超過70%以后呈下降趨勢，說明乙醇濃度過高或過低對提取率都有影響。這可能是由于不同濃度的乙醇溶液極性不同，而黃酮類化合物具有較高的極性[7]。根據(jù)相似相溶原理，本研究選擇乙醇濃度為70%。

2.3 料液比對總黃酮提取率的影響

由圖3可以看出，隨著料液比的增大，提取率相應(yīng)增高，這主要是因為液料比越大，黃酮類化合物就越容易滲透出來；但是由于黃酮含量有限，料液比達(dá)到1∶30（g·mL-1）以后，提取率的增加就趨于平緩?？紤]節(jié)約乙醇，故選擇適宜的料液比為1∶30（g·mL-1）。

2.4 超聲提取時間對總黃酮提取率的影響

由圖4可以看出，在超聲波功率等其它因素固定的條件下，超聲處理時間越長，超聲波對物料的作用越充分，黃酮浸出越多，提取率越高。但20 min以后，提取率增高趨于緩慢，可見超聲波能在較短時間內(nèi)對物料進(jìn)行充分提取，從而驗證了超聲波提取具有省時的優(yōu)點。考慮到能源消耗等各方面因素，確定20 min為較適宜的超聲處理時間。

2.5 超聲功率對總黃酮提取率的影響

由圖5可知，超聲波的功率越高越容易獲得較大的聲強，超聲功率從100 W到500 W時，隨著功率的提高提取率也上升，這可能是因為超聲強度越大越容易使細(xì)胞內(nèi)容物溢出，越有利于提高提取效率[8-10]。但在功率為400 W時，提取率僅比500 W時的提取率少0.04個百分點。因此，確定400 W為適宜的提取功率。

2.6 正交試驗結(jié)果及分析

由表2可知，在試驗選定的4個因素中，對杏鮑菇菌糠總黃酮提取率的影響程度大小依次是B>C>A>D，即料液比>超聲時間>乙醇濃度>超聲功率。由于A因素，k3>k2>k1；B因素，k2>k3>k1；C因素，k3>k2>k1；D因素，k1>k3>k2；所以得出杏鮑菇菌糠總黃酮的最佳提取工藝為A3B2C3D1，即乙醇濃度70%，料液比1∶30（g·mL-1），超聲時間25 min，超聲功率350 W。

2.7 最佳工藝驗證試驗

在正交試驗所得出的最佳工藝條件A3B2C3D1下，重復(fù)3次試驗，計算該條件下提取率為1.995%±0.019%，RSD為0.981%，表明該結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論與討論

本研究利用超聲輔助法提取杏鮑菇菌糠中黃酮類化合物，既縮短了提取時間，又達(dá)到較高的提取效率，與傳統(tǒng)水提法、醇提法相比具有省時、高效、節(jié)能的優(yōu)點。研究表明，在乙醇濃度70%，料液比1∶30（g·mL-1），超聲時間25 min，超聲功率350 W的條件下，杏鮑菇菌糠的提取率達(dá)到最大值1.995%±0.019%，且重復(fù)性高，相對穩(wěn)定。

為了更加合理地開發(fā)利用菌糠資源，本研究采用了超聲輔助提取法研究杏鮑菇菌糠中總黃酮的含量，旨在獲取最佳提取工藝，為菌糠資源的開發(fā)利用提供技術(shù)參考。另外，由于本研究僅考慮了醇濃度、料液比、超聲時間、超聲功率4個因素，沒有涉及到提取中所面臨的全部因素，因此在實際生產(chǎn)過程中還需綜合考慮各種外界因素，比如提取溫度、料液pH值等，還需要在本研究的基礎(chǔ)上做進(jìn)一步研究。

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