芝麻物種特異性定性PCR方法的建立

王慶平　王成　蘭青闊　陳銳　趙新　沈曉玲　王永　檀建新

摘 要：為鑒別食品中芝麻成分的真實性，建立了一套芝麻物種特異性定性PCR方法。根據(jù)Sesamum indicum 2S albumin-like序列，設計了3對芝麻物種特異性定性PCR引物，并對引物的特異性、最適反應濃度和最適退火溫度進行了篩選和優(yōu)化，建立了芝麻物種特異性定性PCR檢測方法。進一步對方法的靈敏度、檢出限和對芝麻加工品的適用性進行了測試。結果顯示，引物sesame-1F/1R的特異性最好，最優(yōu)反應條件為引物濃度0.4 μmol·L-1，退火溫度60 ℃；該方法能夠檢測出芝麻質(zhì)量分數(shù)為0.1%的樣品，且對于芝麻油、芝麻醬2種性狀的加工樣品均有很好的擴增。該方法能夠鑒別食品中芝麻成分，為食品質(zhì)量安全監(jiān)管提供了有力的技術支撐。

關鍵詞：芝麻；物種特異性序列；定性PCR檢驗

中圖分類號：S565.3 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.003

Abstract： To identify the authenticity of sesame ingredient in food， a set of specific quantitative PCR method for sesame species was established in this study. According to the sequence of sesamum indicum 2S albumin-like sequence， three pairs of sesame species specific qualitative PCR primers were designed. Passed the primer specificity test， PCR reaction condition and system optimize， a sesame species-specific qualitative PCR detection method was established. Then we need to make further testing on sensitivity test， detection limit test and processed product test. The results showed that the specificity of the primer sesame-1F/1R was the best， and the primer concentration was 0.4 μmol·L-1 and the annealing temperature was 60 ℃， which was the optimum reaction condition. The minimum detection limit of the specific PCR method was 0.1% （M/M）， two kinds of traits of processed samples such as sesame paste and sesame oil were well amplified. This method can identify the sesame ingredients in food which provides strong technical support for food quality and safety supervision.

Key words： sesame； species specific sequence； qualitative PCR test

芝麻具有很高的營養(yǎng)和保健價值，富含蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、磷、鐵、維生素E等多種營養(yǎng)物質(zhì)，芝麻油的油酸和亞油酸總含量高達85%，其特有的抗氧化物質(zhì)，如芝麻酚（Sesamol）、芝麻素（Sesamin）、芝麻酚林（Sesamolin）具有降血壓、抗氧化、抗癌等多種功能，被廣泛應用于醫(yī)藥和臨床[1]。但芝麻作為過敏原，有相當一部分人群對芝麻及其加工品存在過敏反應[2-3]，影響消費者的身體健康；同時芝麻產(chǎn)品因其豐富的營養(yǎng)價值和較高的銷售價值，而成為不少不良商家的造假目標，據(jù)報道，造假商販可以用香油精勾兌假香油，再加以香精和色素，消費者難以鑒別其真?zhèn)蝃4]；芝麻醬更是由用花生醬及少量香精勾兌而成。此類芝麻加工品完全不含有芝麻成分，嚴重損害了消費者的利益。因此，為確保消費者的身體健康及保障消費者的利益，急需建立芝麻及其產(chǎn)品的檢測方法。

目前，對于芝麻產(chǎn)品的檢測多為對造假香油的檢測，鑒別造假香油的理化方法主要是對香精等化合物的檢測，從而判斷產(chǎn)品是否為造假產(chǎn)品。賈洪鋒等[5]利用電子鼻對市售芝麻油中的芝麻香精成分進行了檢測；秦早等[6]利用頂空固相微萃取結合氣質(zhì)聯(lián)用技術分析芝麻油和芝麻香精的揮發(fā)性成分，以此對芝麻香精成分進行檢測；李凝等[7]在芝麻油質(zhì)量現(xiàn)狀及摻假檢測方法中敘述了顯色法、紫外分光光度法、色譜法等。但化合物成分容易受到儲藏環(huán)境、時間等因素的影響[6]，因此，理化方法檢測具有一定的局限性。

隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，運用分子生物學方法進行食品成分真?zhèn)舞b別已然成為備受關注的研究方向。韓建勛等[8]根據(jù)梨類甜蛋白基因內(nèi)含子設計梨特異性擴增引物，建立梨成分的實時熒光PCR檢測方法；ZHANG 等[9]基于棕櫚油MT3-B序列，建立常規(guī)和實時熒光PCR方法，通過擴增109 bp的擴增子來檢測棕櫚油污染。

本研究旨在尋找芝麻物種特異性序列，并設計特異性引物，建立一套鑒別食品中芝麻成分的方法，為今后食品質(zhì)量安全監(jiān)管提供重要的技術依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

特異性鑒定樣品白芝麻、黑芝麻、大豆、向日葵、花生，均購自超市；玉米、水稻、油菜籽、小麥由（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院）生物污染與動植物分子識別研究室保存；芝麻加工品芝麻油和芝麻醬購自超市。

1.2 主要試劑

新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根，DP320-03）；正己烷、異丙醇、醋酸鈉（分析純）；2×GoTaq Green Master Mix（Promega M7123）；DL 2 000 DNA Marker（寶生物工程有限公司）；瓊脂糖凝膠（Biowest Agarose）；引物（蘇州金唯智生物技術有限公司）。

1.3 試驗儀器

分析天平（Mettler Toledo PL602-L）；恒溫水浴鍋（Neslab EX-111）；小型臺式離心機（Thermo PICO 21）；超微量紫外分光光度計（NanoDrop ND-1000）； PCR儀（ABI Veriti 96）；電泳儀（BioRad PAC 200）；凝膠成像儀（Azure c150）。

1.4 試驗方法

1.4.1 DNA的提取與制備 （1）特異性鑒定樣品DNA的提取。用新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根，DP320-03）：取600 μL緩沖液LP1于100 mg樣品中，加入6 μL RNase A（10 mg·mL-1），漩渦振蕩1 min，65 ℃中孵育40 min，每10 min顛倒混勻一次；加入150 μL緩沖液LP2，振蕩1 min，12 000 g離心5 min，取300 μL上清移至新的2 mL離心管中，加入450 μL緩沖液LP3，顛倒混勻15 s；立即倒入吸附柱CB3中，12 000 g離心30 s，倒掉廢液；加入600 μL漂洗液PW，12 000 g離心30 s，倒掉廢液；重復上述漂洗操作。將吸附柱CB3放回收集管后，12 000 g離心2 min，倒掉廢液，室溫下放置5 min；將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中，在吸附膜中間部位滴加50 μL的ddH2O，室溫放置5 min，12 000 g離心2 min，離心所得溶液即為樣品DNA溶液。

（2）芝麻加工品基因組DNA提取。取100 mL芝麻油（30 mL芝麻醬）置于燒杯中，加入100 mL（30 mL）正己烷，磁力攪拌2 h，加入已65 ℃預熱的裂解液（20 g·L-1 CTAB；81.82 g·L -1NaCl；100 mmol·L-1 Tris-HCl；20 mmol·L-1 EDTA；pH值 8.0）繼續(xù)混勻2 h。將燒杯中溶液轉(zhuǎn)入6個50 mL離心管中，10 000 g離心10 min分相；取120 mL水相，加入等體積異丙醇及0.1倍體積1 mol·L-1醋酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻，-20 ℃靜置2 h，10 000 g離心10 min沉淀DNA，棄上清。加入400 μL TE緩沖液回溶，加入200 μL 氯仿∶異戊醇（24∶1）輕緩顛倒混勻，10 000 g離心5 min分層。將450 μL上清液轉(zhuǎn)移至2 mL新離心管中，加入等體積異丙醇及0.1倍體積醋酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻，-20 ℃靜置2 h后，10 000 g離心10 min沉淀DNA，棄上清。加1 mL 70%乙醇洗滌DNA沉淀，重復1次。干燥沉淀，50 μL ddH2O溶解。

1.4.2 引物特異性測試 利用設計的引物，分別以白芝麻、黑芝麻、玉米、水稻、大豆、向日葵、花生、油菜籽、小麥基因組DNA為模板進行PCR擴增。

1.4.3 PCR擴增體系及程序的優(yōu)化 根據(jù)引物特異性及擴增條帶亮度確定最佳引物，對該引物以52，54，56，58，60，62 ℃為退火溫度進行PCR反應擴增（10%，DNA模板50 ng·μL-1），并在5種退火溫度下分別設置0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol·L-1等6個引物濃度梯度進行PCR擴增條件的優(yōu)化。

1.4.4 引物靈敏度測試 將提取的芝麻基因組DNA用ddH2O進行梯度稀釋，DNA濃度分別為100%，10%，1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%和0。利用優(yōu)化后的PCR擴增條件進行擴增。

1.4.5 引物檢出限的確定 取60份芝麻質(zhì)量分數(shù)為0.1%的樣品，提取基因組DNA，進行PCR擴增。

1.4.6 加工品測試 分別提取芝麻醬和芝麻油基因組DNA，25 μL體系加50 ng樣品DNA，利用優(yōu)化后的PCR擴增條件進行擴增。

2 結果與分析

2.1 序列分析及引物設計

根據(jù)HSIAO等[10]對編碼芝麻種子貯藏蛋白的研究，獲取Sesamum indicum 2S albumin-like序列（GI：747093087），通過NCBI-BLAST未見其他作物與之同源。利用Primer Premier 5軟件設計3對芝麻物種特異性引物（表1）。

2.2 引物篩選

利用設計的3對引物，對9種特異性鑒定樣品材料進行PCR擴增（圖1），結果顯示，引物sesame-2F/2R在以水稻基因組DNA為模板時出現(xiàn)非特異性擴增條帶，說明其特異性較差。引物sesame-1F/1R和sesame-3F/3R只有黑、白芝麻樣品出現(xiàn)目的片段，其他樣品均未出現(xiàn)任何擴增片段，但引物sesame-1F/1R的擴增條帶比引物sesame-3F/3R的亮，前者的擴增效率高于后者。因此，選擇引物sesame-1F/1R進行后續(xù)試驗。

2.3 PCR擴增體系及程序的優(yōu)化

引物sesame-1F/1R在不同的退火溫度（Tm值）和引物濃度處理中，擴增條帶表現(xiàn)出不同的亮度（圖2），當Tm值為60 ℃、引物終濃度為0.4 μmol·L-1時，擴增條帶亮度明顯高于其他條件，而且不隨著引物濃度的加大而增加。

由圖2可知，引物sesame -1F/1R的最適PCR反應體系為；1×GoTaqR Master Mix，0.4 μmol·L-1上游引物、下游引物，50 ng DNA模板（50 ng·μL-1），雙蒸水補足25 μL；PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃充分延伸7 min，保存。由此可以建立芝麻物種特異性定性PCR方法，并對該方法進行靈敏度、檢出限及加工品測試。

2.4 方法靈敏度測試

利用芝麻特異性引物sesame-1F/1R及優(yōu)化后的PCR擴增條件，對不同濃度的DNA模板進行擴增。結果表明，當芝麻質(zhì)量分數(shù)為0.1%及以上時，特異性目的片段條帶清晰；當芝麻質(zhì)量分數(shù)為0.1%以下時，擴增效果明顯下降。因此，本方法的靈敏度為0.1%。

2.5 方法檢出限測試

由圖7可知，60份芝麻質(zhì)量分數(shù)為0.1%的測試樣品，均能穩(wěn)定擴增出217 bp的目的片段，表明該方法的檢測極限不高于0.1%。

2.6 加工品測試

根據(jù)1.4.1.2的方法提取芝麻醬及芝麻油DNA，并用超微量紫外分光光度（NanoDrop ND-1 000）對樣品DNA濃度進行測定，其結果列于表2。

該方法選取芝麻油和芝麻醬作為芝麻加工品進行試驗方法的驗證。由圖5可知，無論是何種性狀的芝麻加工品，sesame-1F/1R經(jīng)體系及程序優(yōu)化后，對芝麻加工品進行PCR擴增，結果均能得到芝麻物種特異性基因擴增條帶。

3 討 論

物種特異性參照基因需要滿足以下2個條件：該作物所有品種都存在該基因；其他生物沒有或不存在擴增該基因的特異靶序列[11]。通過建立物種特異性PCR方法來檢測食品加工品中的該物種，逐漸成為食品質(zhì)量檢測的重要手段[12-14]。本研究通過Sesamum indicum 2S albumin-like序列對比，結果發(fā)現(xiàn)Sesamum indicum cultivar Zhongzhi No. 13 linkage group LG11序列，并對其進行Blast對比及特異性分析，結果表明，該序列為芝麻物種特異性序列。

隨著PCR技術的發(fā)展和對檢測要求的不斷提高，運用qPCR及dPCR技術可以對檢測成分進行相對定量甚至絕對定量的測定[15-16]，但普通PCR方法與其相比，對設備要求不高，試驗耗費更低，操作相對簡單，技術更加成熟，因此，其應用更加廣泛。根據(jù)《農(nóng)業(yè)部2259號公告-4-2015 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測 定性PCR方法制定指南》[17]，普通PCR產(chǎn)物長度宜為120～300 bp，而袁茵等[18]建立的芝麻醬成分真實性檢測中設計芝麻物種特異性引物為66 bp，在凝膠電泳過程中不易與二聚體分開，故其不太適用于定性PCR檢測。本研究所設計的擴增片段為217 bp的芝麻物種特異性引物，更適用于普通PCR法鑒定芝麻成分。

本試驗所設計的引物sesame-1F/1R物種特異性良好，在優(yōu)化后的擴增條件下能夠檢測出芝麻質(zhì)量分數(shù)為0.1%的樣品，芝麻加工品測試結果可信。因此，可以用來對芝麻加工品中芝麻成分進行檢測。但為了定量檢測食品加工品中的芝麻成分，本試驗后續(xù)將進行實時熒光定量PCR方法的開發(fā)，為食品質(zhì)量安全監(jiān)管提供更有力的保障。

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