小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子VIGS基因沉默載體構(gòu)建及驗證

蔣魯亞　王君雅　孫依帆　劉曉穎　王振英

摘 要：WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛存在于各種植物中，有助于提高植物抗逆性。本研究用病毒介導的基因沉默方法沉默Brock中克隆到的TaWRKY基因，發(fā)現(xiàn)白粉菌成功侵染小麥葉片的比例上升，畸形胞比例下降。研究表明，TaWRKY基因在小麥抵抗白粉菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用。

關(guān)鍵詞：小麥；白粉?。籛RKY；VIGS

中圖分類號：S512 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.001

Abstract：WRKY transcription factor family can help improve plant stress tolerance， which widely exist in various plants. After TaWRKY gene was silenced by VIGS method， it was found that the proportion of succeed Bgt inoculation increased， and the percentage of abnormal appressoria declined， such as papilla. The results indicated that TaWRKY gene played an important role in wheat- Bgt interaction.

Key words：wheat； powdery mildew； WRKY； VIGS

小麥白粉病是由布氏白粉菌（Blumeria graminis f. sp. Tritici）侵染所引起的真菌感染性病害，如遇高溫多濕天氣病害流行，會使小麥嚴重受害，導致減產(chǎn)13%～34%[1]。 因此，科學家一方面通過抗病育種，不斷培育新的抗病小麥品種來抵御病害，另一方面通過深入的抗病分子機理研究，克隆抗病相關(guān)基因、弄清抗病信號通路以及基因工程等技術(shù)手段，以達到抗病分子育種的目的。

轉(zhuǎn)錄因子可以與真核基因啟動子區(qū)中的順式作用元件互作，激活或抑制多個下游功能基因轉(zhuǎn)錄，從而使植株獲得綜合改良效果。研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族幾乎存在于所有植物中，它們共同含有一段高度保守氨基酸序列WRKYGQK[2]。WRKY廣泛參與植物種子萌發(fā)與休眠、開花、代謝、激素信號轉(zhuǎn)導，還參與抵御生物和非生物脅迫等反應(yīng)過程。擬南芥AtWRKY33基因直接調(diào)控了植物抗毒素Camalexin 的合成[3]，并且調(diào)控大量抗病相關(guān)基因的表達[4]。大豆中GmWRKY58和GmWRKY76的過表達會造成作物提早開花，表達量的區(qū)別對花形態(tài)造成不同影響[5]。水稻中OsWRKY6基因的過表達有助于提高作物對病原菌的抗性，同時可直接調(diào)控異分支酸合成酶的表達從而增加水楊酸的濃度實現(xiàn)自我調(diào)節(jié)[6]。小麥（Triticum aestivum）TaWRKY93可調(diào)節(jié)作物對滲透壓、高鹽、干旱和低溫等脅迫的耐性[7]。迄今為止，研究人員已經(jīng)在大麥[8]、擬南芥[9]、大豆[10]和水稻[11]等多種植物中都鑒定到不同數(shù)量的WRKY轉(zhuǎn)錄因子。

病毒誘導基因沉默（VIGS-induced gene silencing， VIGS）是引起內(nèi)源mRNA特異性降解、引起基因轉(zhuǎn)錄沉默的技術(shù)。VIGS試驗周期短，操作簡便，并且無需轉(zhuǎn)化。近年來，在植物基因功能研究中，VIGS技術(shù)作為一種簡單、快速、高效的反向遺傳學技術(shù)在禾本科植物基因功能研究中發(fā)揮了重要作用[12-13]。

本研究以前期工作獲得的TaWRKY基因為基礎(chǔ)[14]，利用VIGS技術(shù)獲得沉默植株，通過對基因沉默前后白粉菌侵染情況進行觀察統(tǒng)計，最終確定TaWRKY基因在小麥抗白粉病過程中的功能。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

抗白粉病品種Brock，由Ray Johnson博士惠贈。

小麥白粉菌15號生理小種，由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.2 沉默TaWRKY的VIGS載體構(gòu)建

在目的基因核苷酸序列的非保守區(qū)，設(shè)計上、下游特異性沉默引物TaWRKY-VIGS-F和TaWRKY-VIGS-R，以抗病小麥Brock總RNA合成的cDNA為模版，擴增富集沉默片段，將該片段與BSMVγ：連接構(gòu)建重組載體BSMVγ：TaWRKY，構(gòu)建過程參見Li 等[15]。

1.3 基因沉默效率檢測

通過限制性內(nèi)切酶酶切線性化、體外轉(zhuǎn)錄后，獲得病毒RNA組分通過摩擦接種方法接種到小麥第2葉上，待接種H2O（對照1）、BSMV：GFP（對照2）和BSMV： TaWRKY組小麥第3葉伸展完全，采用抖拂法對各株植株第3葉均勻高密度接種新鮮白粉菌孢子，在相應(yīng)時間點取葉片，利用半定量PCR方法檢測這3組植株中TaWRKY基因的mRNA水平的水平變化，從而確定TaWRKY基因沉默的效率。

1.4 基因沉默后對小麥抗白粉病表型的影響

取接種48，72 h和7 d后的小麥葉片，用考馬斯亮藍染色方法染色并觀察統(tǒng)計白粉菌孢子的生長發(fā)育情況，通過與對照白粉菌孢子萌發(fā)、畸形胞比例等的對比分析，確定目標基因在抗白粉病過程中的貢獻。

2 結(jié)果與分析

2.1 VIGS沉默載體構(gòu)建

根據(jù)已獲得TaWRKY基因序列，在基因的非保守區(qū)設(shè)計添加了NheI識別序列的引物WRKY-V-F（AGCCGCAGCAGCAGAACG）、WRKY-V-R（CTTGAAGCTGGGGTCCCTC）。以含TaWRKY基因序列的重組質(zhì)粒作為模板，擴增用于構(gòu)建BSMV重組載體的目的基因片段，擴增結(jié)果如圖1所示。目的片段大小約為250 bp左右，隨后將回收后的目的片段進行酶切形成粘性末端，BSMV載體同樣經(jīng)過酶切回收，與目的片段進行連接，通過進一步篩選、驗證，挑選陽性克隆送測驗證。

2.2 VIGS技術(shù)沉默靶基因后TaWRKY表達水平檢測

在TaWRKY基因的特異性核苷酸序列區(qū)段設(shè)計引物，擴增一個長227 bp的片段構(gòu)建TaWRKY基因沉默載體BSMVγ：TaWRKY。本次沉默試驗共設(shè)置4個組別，分別為H2O對照組（空白對照）、BSMV：GFP對照組（陽性對照）、BSMV：PDS對照組（沉默PDS基因）、BSMV： TaWRKY試驗組（沉默目的基因TaWRKY）。為了驗證本試驗所建立的沉默體系成功有效，分別對各組摩擦接種后約15 d的小麥第3葉進行表型觀察，結(jié)果如圖2所示。除BSMV：PDS對照組葉片發(fā)生明顯白化現(xiàn)象之外，其他組葉片均呈綠色，說明該基因沉默體系構(gòu)建成功。

2.3 TaWRKY基因沉默效率驗證

為了進一步證實TaWRKY基因是否被有效沉默，采用半定量PCR的方法，對沉默后各組植株中TaWRKY基因的轉(zhuǎn)錄水平進行了檢測，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，摩擦接種后，TaWRKY試驗組的mRNA水平明顯低于H2O和GFP對照組，說明小麥內(nèi)源TaWRKY基因被有效沉默了。另外，在接種重組病毒BSMV：GFP后，TaWRKY基因的表達也有輕微下調(diào)，該現(xiàn)象可能是由于病毒的侵染對植株造成了影響。

2.4 TaWRKY基因沉默植株抗病分析

為了進一步研究TaWRKY基因在小麥葉片與白粉菌的互作過程中所起到的調(diào)控作用，本研究使用考馬斯亮藍染色法分別對接種48，72 h和7 d后的GFP組、TaWRKY組小麥植株的第3葉進行固定、染色、制片，在顯微鏡下進行鏡檢，觀察各時間點中，白粉菌萌發(fā)形態(tài)及生長狀態(tài)，如圖4所示。從圖4中可以看出：染菌48 h后，TaWRKY組白粉菌孢子萌發(fā)狀態(tài)優(yōu)于對照組，孢子萌發(fā)，芽管伸長，形成附著胞；染菌72 h后，TaWRKY試驗組白粉菌孢子大量萌發(fā)形成次生菌絲，而各對照組中，孢子萌發(fā)出現(xiàn)分瓣型畸形附著胞、纖細型畸形附著胞等；染菌7 d后，TaWRKY試驗組白粉菌孢子大量生成串珠狀分生孢子，而各對照組中，僅有少量孢子萌發(fā)形成次生菌絲。

在鏡檢觀察孢子發(fā)育結(jié)構(gòu)的同時，統(tǒng)計各個視野內(nèi)白粉菌孢子萌發(fā)率、畸形率、寄主抗性等參數(shù)。統(tǒng)計結(jié)果如圖5、圖6所示。由圖可以得出，接種白粉菌48 h后，白粉菌對TaWRKY基因沉默后的植株侵染成功率增加，畸形附著胞比例下降，與GFP對照組相比，TaWRKY基因沉默組植株白粉菌孢子萌發(fā)率上升，畸形附著胞（分瓣型附著胞、纖細型附著胞等）比例下降。

3 結(jié)論與討論

自1994年，Ishiguro和Nakamura[16]首次從甘薯（Ipomoea batatas）中克隆出第一個WRKY蛋白SPF1，研究人員對于植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族開展了大量研究。越來越多的研究結(jié)果表明，WRKY 蛋白在植物生長發(fā)育，抵御生物以及非生物脅迫等多種生理生化過程中發(fā)揮重要作用[17]。前期工作中，筆者在小麥Brock中分離到一個WRKY類轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY，并初步證實該基因參與了小麥的白粉菌脅迫應(yīng)答反應(yīng)，但還不能夠較確切了解TaWRKY基因與小麥抗白粉病之間的關(guān)系[12]。

關(guān)于病毒介導的基因沉默技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于基因功能研究[18-21]，但該方法由于涉及到病毒感染，從而影響對正確結(jié)果的判斷而備受爭議。本研究為了降低這種系統(tǒng)誤差，采取了3個對照組，即用GKP緩沖液作為摩擦接種介質(zhì)為陰性對照，用綠色熒光蛋白基因構(gòu)建γ載體BSMVγ：GFP、編碼葉綠素關(guān)鍵酶基因PDS基因構(gòu)建γ載體BSMVγ：PDS為兩個陽性對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：GKP緩沖液和GFP對照組生長正常，沒有病毒侵染后留下的病斑，生長正常，說明病毒對葉片生長沒有明顯影響；PDS組出現(xiàn)了葉片白化現(xiàn)象，說明PDS基因被有效沉默，表明基因沉默系統(tǒng)可用；基因沉默后再接種白粉菌孢子7 d后，白粉菌孢子充分萌發(fā)。與GFP組相比，TaWRKY基因沉默組小麥葉片表面的白粉菌附著胞畸形率明顯下降，白粉菌的成功侵染率顯著上升。因此，推測TaWRKY基因可能在小麥抗白粉菌反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。

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