非小細(xì)胞肺癌中間質(zhì)細(xì)胞衍生因子—1及神經(jīng)生長因子的表達(dá)及其臨床意義

楊慶珣+梁有卓

【摘要】 目的：探討間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）與神經(jīng)生長因子（NGF）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)及臨床意義。方法：收集2014年2月-2016年5月本院胸外科手術(shù)切除的人NSCLC病理標(biāo)本65例作為觀察組，其中觀察組按不同病理級別分為了Ⅰ級15例為Ⅰ組，Ⅱ級24例為Ⅱ組，Ⅲ級26例為Ⅲ組。同時隨機(jī)選擇健康者正常肺組織標(biāo)本64例為對照組，各組組織均使用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測SDF-1與NGF mRNA，同時采用免疫組化法檢測各組組織中SDF-1與NGF蛋白的表達(dá)情況。并分析比較各組組織中SDF-1與NGF mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：觀察組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽性率均高于對照組（P<0.05）；Ⅲ組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽性率均高于Ⅱ組（P<0.05）；Ⅱ組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽性率均高于Ⅰ組（P<0.05）；NSCLC組織中SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽性率隨病理級別的增高而增高（P<0.05）。SDF-1和NGF高表達(dá)均是預(yù)測NSCLC預(yù)后不良的獨立因素（P<0.01），SDF-1和NGF的高表達(dá)與NSCLC患者整體不良預(yù)后顯著相關(guān)（P<0.01）。結(jié)論：NSCLC中SDF-1與NGF高表達(dá)對病變進(jìn)展有一定促進(jìn)作用，兩者與腫瘤的病理級別密切相關(guān)，SDF-1與NGF在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，有望為NSCLC的臨床檢測及治療提供新思路。

【關(guān)鍵詞】 非小細(xì)胞肺癌； 間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1； 神經(jīng)生長因子； 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 免疫組化

Expression and Clinical Significance of Stromal Cell Derived Factor-1 and Nerve Growth Factor in Non-small Cell Lung Cancer/YANG Qing-xun，LIANG You-zhuo.//Medical Innovation of China，2017，14（09）：033-036

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of stromal cell derived factor-1（SDF-1） and nerve growth factor（NGF） in non-small cell lung cancer（NSCLC）.Method：65 NSCLC patients who underwent surgical resection in our hospital from February 2014 to May 2016 were selected as observation group，the observation group was divided into different groups according to different pathological grades， 15 cases in grade Ⅰ as the group Ⅰ，24 cases in grade Ⅱ as the group Ⅱ，26 cases in grade Ⅲ as the group Ⅲ.At the same time，randomly selected healthy subjects of normal lung tissue specimens of 64 cases for the control group.All groups were used real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （RT-PCR） technique to detect SDF-1 and NGF expression of mRNA，and immunohistochemical detected SDF-1 and NGF protein in tissue，and tissues were analyzed and compared with NGF SDF-1 mRNA and protein expression.Result：The SDF-1 and NGF mRNA gene expression and protein positive rates in observation group were significantly higher than those in control group（P<0.05）；the SDF-1 and NGF mRNA gene expression and protein positive rates in group Ⅲ were higher than those of group Ⅱ（P<0.05）；the SDF-1 and NGF mRNA gene expression and protein positive rates in group Ⅱ were higher than those of group Ⅰ（P<0.05）；the expression of SDF-1 and NGF in NSCLC tissues and the positive rate of mRNA increased with the increase of pathological grade（P<0.05）.The high expression of SDF-1 and NGF were independent predictors of poor prognosis of NSCLC （P<0.01），and the high expression of SDF-1 and NGF were significantly correlated with the poor prognosis of patients with NSCLC（P<0.01）.Conclusion：The high expression of SDF-1 and NGF in NSCLC may promote the progression of the disease，both are closely related to the pathological grade of the tumor，SDF-1 and NGF play an important role in the occurrence and development of NSCLC，which is expected to provide new ideas for clinical detection and treatment of NSCLC.

【Key words】 Non-small cell lung cancer； Stromal cell derived factor-1； Nerve growth factor； Real-time quantitative polymerase chain reaction； Immunohistochemistry

First-authors address：The Central Hospital in Baoan District of Shenzhen，Shenzhen 518102，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.09.010

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一[1]，NSCLC的生長方式為浸潤性生長，藥物化療治療與手術(shù)治療均預(yù)后差，復(fù)發(fā)率及致死率均很高[2-3]。NSCLC發(fā)病原因尚不明確，其病變進(jìn)展中出現(xiàn)多種蛋白表達(dá)失調(diào)[4]；間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）、神經(jīng)生長因子（NGF）基因及其蛋白表達(dá)是近年來腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一，文獻(xiàn)[5]研究認(rèn)為，SDF-1與NGF與多種惡性腫瘤的預(yù)后特別是腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。筆者通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）定量與免疫組化定性技術(shù)，以探討SDF-1與NGF基因及其蛋白表達(dá)水平與NSCLC的惡性程度的關(guān)系及臨床診斷價值，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月-2016年5月本院胸外科手術(shù)的人NSCLC病理標(biāo)本65例作為觀察組，男38例，女27例，年齡47～78歲，平均（55.6±12.2）歲，患者術(shù)前未接受放化療等治療，均無其他腫瘤病史，均排除肝、腎、心臟和血液性疾病，患者均有齊全完整的臨床資料。所有病理標(biāo)本均取出一部分制作成石蠟切片，通過HE染色后，由病理科組織兩位經(jīng)驗豐富病理醫(yī)生進(jìn)行雙盲鏡檢讀片，其中肺鱗癌28例為鱗癌組，肺腺癌25例為腺癌組，其他型肺癌12例為其他組；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例為轉(zhuǎn)移組，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例為無轉(zhuǎn)移組，TNM分期按照國際肺癌研究會（IASLC）公布的標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中Ⅰ級15例為Ⅰ組，Ⅱ級24例為Ⅱ組，Ⅲ級26例為Ⅲ組。同時隨機(jī)選擇健康者肺組織標(biāo)本64例為對照組，男32例，女32例，年齡46～78歲，平均（56.2±11.9）歲。觀察組與對照組的年齡和性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性?；颊呒覍倬?，依從性良好并簽署知情同意書。

1.2 方法 觀察組患者組織標(biāo)本為進(jìn)行外科手術(shù)所切取的NSCLC標(biāo)本，對照組的組織標(biāo)本為健康者肺組織標(biāo)本。兩組均在術(shù)中各取兩組份標(biāo)本，其中一份標(biāo)本通過甲醛固處理備用，另外一份標(biāo)本通過液氮固定處理備用。

1.2.1 免疫組化法檢測 SDF-1和NGF表達(dá)檢測：SDF-1和NGF表達(dá)的檢測采用采用免疫組化SP法，步驟均嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：所有的免疫組化SP切片均由兩位病理學(xué)主治醫(yī)師以上的醫(yī)師對的染色結(jié)果進(jìn)行評定，在高倍鏡下（400倍）隨機(jī)抽取5個視野，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照隋銳等[7]的計數(shù)方法計算陽性細(xì)胞率，陰性：比率<5%；弱陽性：比率5%～25%；陽性：比率25%～50%；強(qiáng)陽性>50%?？傟栃月?弱陽性率+陽性率+強(qiáng)陽性率。

1.2.2 RT-PCR定量檢測 PCR引物序列：參照Kenri等[8]的方法設(shè)計正反及探針義鏈，內(nèi)參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）均由FAM標(biāo)記，由廣州中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司合成，見表1，與設(shè)計的目的片段大小一致。各組份的檢測所需的標(biāo)本均采用液氮固定處理的標(biāo)本，并按照試劑盒說明進(jìn)行SDF-1與NGF的RNA萃取，RT-PCR方法獲得cDNA片段，基因分析采用美國MJR Option。（2）實時熒光FQ-PCR分儀自帶的基因分析應(yīng)用軟件及Gen Bank對比分析基因序列同源性，RNA表達(dá)量與內(nèi)參基因的比值表示 mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 for Windows軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，風(fēng)險級別采用Cox回歸模型，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組計量資料比較采用F檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽性率比較 觀察組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽性率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.2 NSCLC各組mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽性率比較 Ⅲ組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽性率均高于Ⅱ組（P<0.05）；Ⅱ組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽性率均高于Ⅰ組（P<0.05），NSCLC組織中SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽性率隨病理級別的增高而增高（P<0.05），見表3。

2.3 SDF-1和NGF預(yù)后相關(guān)性分析 SDF-1和NGF高表達(dá)均是預(yù)測NSCLC預(yù)后不良的獨立因素（P<0.01），見表4。SDF-1和NGF的高表達(dá)與NSCLC患者整體不良預(yù)后顯著相關(guān)（P<0.01），見表5。

3 討論

NSCLC占惡性肺癌發(fā)病率的首位[9]，NSCLC發(fā)病比較隱匿性，其確診時大多已是中晚期肺癌，因此，容易錯過了NSCL最佳治療時機(jī)，嚴(yán)重影響NSCL治療效果[10]。目前，對NSCLC診斷及病情變化的判斷主要依靠主要依賴影像學(xué)檢查及術(shù)后病理診斷，缺乏具有指導(dǎo)意義的腫瘤標(biāo)記物[11]，盡管近年來報到了許多與NSCLC相關(guān)的蛋白及因子，但關(guān)于這些蛋白對NSCLC診斷及預(yù)后的提示作用至今尚未達(dá)成共識[12-13]。

本研究結(jié)果表明，SDF-1和NGF在NSCLC中的表達(dá)均明顯高于正常肺組織中的表達(dá)，NGF與SDF-1的表達(dá)從對照組到NSCLC的Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組逐漸增高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；SDF-1是來源于上皮細(xì)胞和間皮細(xì)胞所分泌的具有特殊化學(xué)誘導(dǎo)作用的生物因子，是屬于趨化因子家族成員之一，參與腫瘤細(xì)胞趨化性、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移的功能，文獻(xiàn)[14]研究表明，SDF-1在多種腫瘤中均有表達(dá)，參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。SDF-1在正常的肺組織中，維持較低的生物水平，不發(fā)揮遷移及趨化的作用，當(dāng)肺組織發(fā)生低氧、缺血和炎癥等病變后，SDF-1高度表達(dá)，趨化免疫系統(tǒng)的單核細(xì)胞—巨噬細(xì)胞向受損肺組織遷移并發(fā)揮相應(yīng)的免疫生物學(xué)效應(yīng)[15-16]，SDF-1能夠激活機(jī)體的ERK-1/2和Akt信號通路，募集內(nèi)皮前祖細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤血管生成，調(diào)節(jié)抗凋亡信號途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖，直接作用腫瘤細(xì)胞促進(jìn)腫瘤的生長[17]。NGF是神經(jīng)系統(tǒng)重要的營養(yǎng)因子之一，NGF具有多功能性生長因子，對免疫和炎癥細(xì)胞具有確切的趨化和增殖活性，夏玉等[18]研究表明，NGF是—種在神經(jīng)-免調(diào)節(jié)環(huán)路中起作用的因子，NGF在NSCLC的發(fā)生和增殖過程中起非常重要的作用，促進(jìn)腫瘤血管的修復(fù)或重新形成新的腫瘤血管，有助于腫瘤細(xì)胞趨化性及腫瘤轉(zhuǎn)移[19]。NSCLC癌組織中NGF與SDF-1表達(dá)水平相關(guān)性分析結(jié)果表明，SDF-1和NGF的表達(dá)與NSCLC患者整體不良預(yù)后密切相關(guān)，NGF與SDF-1間的相互作用是影響NSCLC癌細(xì)胞生長的重要因素，NGF與SDF-1共同參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤，NSCLC癌細(xì)胞是一個復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)對損傷與再生的反應(yīng)性調(diào)控過程[20]，當(dāng)損傷刺激后NGF與SDF-1即逆轉(zhuǎn)為高表達(dá)狀態(tài)。

本試驗的結(jié)果可以看出NGF與SDF-1在NSCLC中的表達(dá)風(fēng)險級別回歸分析，NGF與SDF-1的表達(dá)水平與患者的年齡、性別和腫瘤的大小無明顯關(guān)系，而與NSCLC的分化程度有密切關(guān)系，提示NGF與SDF-1的高表達(dá)是NSCLC發(fā)生的重要的危險因素之一，NGF與SDF-1在促進(jìn)膠質(zhì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤中可發(fā)揮重要作用。

綜上所述，NSCLC中SDF-1與NGF高表達(dá)對病變進(jìn)展有一定促進(jìn)作用，兩者與腫瘤的病理級別密切相關(guān)，兩者相互作用，SDF-1與NGF在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，有望為NSCLC的臨床檢測及治療提供新思路。

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