電阻抗法快速測定巴氏殺菌牛乳中菌落總數(shù)

杜寒春，葉開富，劉紹剛，黃島平，譚學(xué)才

（1.廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，南寧530022；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,南寧530008）

電阻抗法快速測定巴氏殺菌牛乳中菌落總數(shù)

杜寒春1，葉開富1，劉紹剛2，黃島平1，譚學(xué)才2

（1.廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，南寧530022；2.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,南寧530008）

建立了電阻抗法快速測定巴氏殺菌牛乳中菌落總數(shù)的方法。得到的阻抗檢測時(shí)間與菌落總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.5923 t+9.4172，相關(guān)系數(shù)r=-0.9907，可信度高；其可信檢測限為10～107mL-1，完全滿足食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的要求；設(shè)立的樣品評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可以快速、直觀的對巴氏牛乳樣品進(jìn)行評價(jià)，在7.46 h內(nèi)即可快速的判定樣品是否合格，大大縮短了檢測周期。結(jié)果表明，與國標(biāo)法相比，電阻抗法簡便快速、靈敏度高，又準(zhǔn)確可靠，且適用于不同時(shí)期、來源及酸度的產(chǎn)品，具有廣泛的適用性和實(shí)用性。

電阻抗法；巴氏殺菌牛乳；菌落總數(shù)

0 引言

巴氏殺菌乳(Pasteurized milk)是指僅以生牛（羊）乳為原料，經(jīng)巴氏殺菌等工序制得的液體產(chǎn)品[1]。菌落總數(shù)是其重要的衛(wèi)生指示指標(biāo)，依據(jù)國標(biāo)GB 4789.2[2]，需48 h±2 h才能得到結(jié)果，難以滿足生產(chǎn)企業(yè)及市場監(jiān)管檢測快速、準(zhǔn)確的要求。微生物自動快速檢測系統(tǒng)BacTrac4300是基于電阻抗原理設(shè)計(jì)生產(chǎn)的一種微生物快速檢測儀[3]，與傳統(tǒng)方法相比，能更快速監(jiān)測微生物的存在及數(shù)量。目前，電阻抗法在食品微生物快速檢測中已得到廣泛的應(yīng)用[4-15]，但關(guān)于巴氏殺菌乳菌落總數(shù)快速檢測的研究卻報(bào)道不多[16-17]，且僅在實(shí)驗(yàn)室方法的初步探索階段，真正從應(yīng)用的角度來研究則鮮有報(bào)道。

本研究擬對電阻抗法在巴氏殺菌牛乳菌落總數(shù)快速測定中的應(yīng)用進(jìn)行探索和研究，為各乳品企業(yè)及檢測機(jī)構(gòu)提供技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1材料與儀器

樣品為市售的南寧五大品牌巴氏殺菌牛乳；稀釋液為市售的UHT牛乳。

試劑為Bimedia002A培養(yǎng)基，平板計(jì)數(shù)瓊脂，濃度為0.0905 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（分析純），檸檬酸鈉(分析純)。

儀器設(shè)備：微生物自動快速檢測系統(tǒng)Bac?Trac4300，HVE-50型全自動高壓滅菌鍋，HH·B11型電熱恒溫培養(yǎng)箱，OK-S26型恒溫水浴箱，VOR?TEX-GENIE 120型渦旋振蕩器，SG2型pH計(jì)，Me?trohm 836 Titrando全自動電位滴定儀。

1.2方法

1.2.1 常規(guī)方法

按GB 4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

1.2.2 電阻抗法

（1）巴氏殺菌乳標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備。將UHT牛乳分裝9 mL/支作為稀釋液，取自然腐敗（保存條件下自然增殖）的高污染樣品進(jìn)行梯度稀釋，得到系列污染程度不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品。

（2）臨界值的確定。選取一菌數(shù)適中的巴氏牛乳樣品進(jìn)行重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。將1 mL巴氏牛乳樣品接種至加有9 mL的Bimedia002A培養(yǎng)基的測量瓶中作8個(gè)平行檢測。各參數(shù)設(shè)置：臨界值預(yù)設(shè)為5%M值；培養(yǎng)溫度36℃；測量持續(xù)時(shí)間24 h。同時(shí)，為了避免樣液中營養(yǎng)物質(zhì)分解出離子而影響測量結(jié)果，將滅菌后的樣品作基線，結(jié)合基線漂移情況確定最低可能的臨界M值。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程的建立。直接吸取1 mL系列巴氏牛乳樣品分別接種至已加有9 mL的Bime?dia002A培養(yǎng)基的測量瓶中，于Bactrac培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24 h，記錄樣品到達(dá)臨界值的阻抗檢測時(shí)間(IDT)。同時(shí)把樣品按國標(biāo)法進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。以菌落總數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的IDT值為橫坐標(biāo)，將數(shù)據(jù)輸入系統(tǒng)自帶的數(shù)據(jù)處理軟件中即可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1臨界值的確定

由圖1可知，巴氏牛乳樣品在5%M具有良好的重現(xiàn)性，其陰性樣品(基線)在24 h內(nèi)最大漂移值為M＝1.3%（圖2）。M值的確定主要遵循三個(gè)原則：高于基線最大漂移值、重現(xiàn)性良好及盡量減少檢測時(shí)間。因考慮到巴氏牛乳樣品的基質(zhì)較復(fù)雜，會有一定的基線漂移，故確定5%M作為臨界值。

圖1 M值重現(xiàn)性

圖2 基線

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和評價(jià)

基于統(tǒng)計(jì)學(xué)原因，要建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，至少應(yīng)該做30個(gè)測試，理想是做50～80個(gè)測試以上，且菌落數(shù)的分布應(yīng)至少有4個(gè)稀釋梯度，覆蓋通常的可能范圍。本實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)期選取市售5大品牌共135個(gè)不同細(xì)菌濃度的巴氏殺菌牛乳樣品進(jìn)行檢測，得到了菌落數(shù)對數(shù)值與IDT的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其回歸方程，如圖3所示。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的細(xì)菌污染范圍覆蓋了巴氏牛乳中菌落總數(shù)允許的限量值，數(shù)量范圍為10～108mL-1，且在標(biāo)準(zhǔn)曲線上分布均勻。

圖3 巴氏殺菌牛乳菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖3可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-0.5923x+9.4172，其相關(guān)系數(shù)r=-0.9907，離差Syx=0.263。一般認(rèn)為，r值應(yīng)該≤-0.85，相關(guān)系數(shù)越接近理想值-1，阻抗檢測與參照方法的關(guān)系越精確。而離差Syx（在取對數(shù)單位給出）應(yīng)該至少小于0.5（對數(shù)值）單位。由此可見，本研究建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)關(guān)系非常顯著，可信度高，完全滿足用于巴氏殺菌牛乳中菌落總數(shù)快速檢測的要求。

2.3電阻抗法的方法學(xué)研究

2.3.1 梯度分離結(jié)果

用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的巴氏牛乳樣品本身應(yīng)對電阻抗檢測結(jié)果無干擾?？煞謩e選取各品牌的高菌落數(shù)的巴氏牛乳樣品用UHT牛乳進(jìn)行梯度稀釋，檢驗(yàn)各個(gè)梯度之間的曲線分離情況。一般要求各個(gè)梯度間的時(shí)間差要大于0.7 h，如果梯度間時(shí)間差很小或者沒有，那就說明樣品中有不明物質(zhì)在干擾檢測結(jié)果，有可能是抗生素或其他藥物，或是防腐劑。由圖4可以看出，樣品的各個(gè)梯度間的時(shí)間差均大于0.7 h，對電阻抗檢測結(jié)果無影響。

圖4 巴氏殺菌牛乳樣品的梯度分離結(jié)果

2.3.2 檢測限的確定

2.3.2.1 檢測上限的確定

可根據(jù)電阻抗法的理論檢測上限確定為107mL-1。因?yàn)楫?dāng)微生物進(jìn)入對數(shù)期，其濃度達(dá)到106～107mL-1時(shí)，測量曲線就達(dá)到了拐點(diǎn)附近，而高菌數(shù)的樣品有可能在保溫1 h期間就已經(jīng)進(jìn)入了對數(shù)期。當(dāng)微生物濃度分別為107，108以及109mL-1時(shí)，達(dá)到曲線拐點(diǎn)處的檢測時(shí)間沒有區(qū)別。在實(shí)際樣品中，一般也很少有大于107mL-1的樣品，且巴氏殺菌牛乳中菌落總數(shù)允許的最大限量值為105mL-1，完全能滿足實(shí)際樣品分析的要求。

2.3.2.2 檢測下限的確定

由于巴氏殺菌牛乳樣品在進(jìn)行電阻抗法檢測時(shí)無需稀釋，因此理論檢測下限為1 mL-1，則可信檢測下限應(yīng)可確定為10 mL-1。取巴士牛乳樣品用UHT牛乳進(jìn)行梯度稀釋，直至樣品的含菌量不超過10 mL-1，將同一樣品分別用阻抗法和國標(biāo)法同時(shí)進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示。比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品含菌量不超過10 mL-1時(shí)，電阻抗法所得檢測結(jié)果與國標(biāo)法的相去甚遠(yuǎn)（P＜0.05）；而當(dāng)樣品含菌量大于10 mL-1時(shí)，兩種方法所得的檢測結(jié)果則無顯著性差異（P＞0.05）。其主要原因一是因?yàn)榘褪蠚⒕Ｈ橹械募?xì)菌為混合菌群，各種細(xì)菌對阻抗的影響不同，當(dāng)所含菌落數(shù)很少（不超過10 mL-1）時(shí)，細(xì)菌的種類及其對阻抗的影響具有很大的不確定性；另外當(dāng)含菌量少時(shí)，樣品取樣時(shí)也存在較大的誤差。由此可確定，電阻抗法的可信檢測限為10～107mL-1。

表1 電阻抗法檢測下限的確定

2.3.3 不同酸度樣品的適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)GB 19645-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)巴氏殺菌乳》，牛乳的酸度范圍為12～18°T。通過測定發(fā)現(xiàn)，市售的巴氏牛乳樣品的酸度一般在12～14°T之間。為驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線對不同酸度樣品是否均具有廣泛適用性，可取適量的檸檬酸鈉溶液調(diào)節(jié)樣品酸度，使其在12～18°T范圍內(nèi)，同時(shí)進(jìn)行電阻抗法檢測，結(jié)果（均為算術(shù)平均值）如表2所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＞0.05，結(jié)果無顯著差異?？梢?，對于不同酸度的巴氏牛乳樣品，標(biāo)準(zhǔn)曲線均適用。

2.4巴氏牛乳樣品的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)GB 19645-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)巴氏殺菌乳》，巴氏牛乳菌落總數(shù)的限量指標(biāo)為：n=5，c=2， m=50 000 mL-1，M=100 000 mL-1[1]。將警戒值50 000 mL-1和臨界值100 000 mL-1分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-0.5923x+9.4172，得到相對應(yīng)的IDT分別為7.96 h和7.46 h。BacTrac軟件據(jù)此可將檢測結(jié)果分為三類：紅代表陽性，表示樣品不合格；黃代表懷疑，表示樣品不能確定是否合格；綠代表陰性，表示樣品合格（如表3所示）。由此可以快速、直觀的對巴氏牛乳樣品進(jìn)行評價(jià)，最快7.46 h內(nèi)即可判定樣品是否合格。

表2 不同酸度樣品的電阻抗法檢測結(jié)果

表3 巴氏殺菌牛乳樣品的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.5電阻抗法檢測巴氏牛乳樣品的結(jié)果

取市售的5個(gè)品牌的樣品（根據(jù)GB 19645-2010[1]，每份樣品采集5瓶），分別用電阻抗法和國標(biāo)方法進(jìn)行檢測，結(jié)果如表4（1-1～5-5）所示。因樣品均合格，選取其中兩個(gè)品牌的樣品置于保存條件下自然增殖，再進(jìn)行檢測，結(jié)果如表4（6-1～7-5）所示。由此可見，兩種方法所得的菌落總數(shù)結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05），樣品評價(jià)結(jié)果完全一致。因此，電阻抗法是可以替代國標(biāo)法對巴士牛乳樣品進(jìn)行檢測的。

3 結(jié)論

本研究建立了電阻抗法快速測定巴氏殺菌牛乳中菌落總數(shù)的方法。所建立的曲線方程y=-0.5923x +9.4172，其相關(guān)系數(shù)r=-0.9907，非常接近理想值-1，可信度高；其可信檢測限為10～107mL-1，完全滿足食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的要求；設(shè)立的樣品評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可以快速、直觀的對巴氏牛乳樣品進(jìn)行評價(jià)，最快7.46 h內(nèi)即可判定樣品是否合格，大大縮短了檢測周期。與國標(biāo)法相比，電阻抗法簡便快速、靈敏度高，又準(zhǔn)確可靠，且適用于不同時(shí)期、不同來源、不同酸度的產(chǎn)品，具有廣泛的適用性和實(shí)用性。為使標(biāo)準(zhǔn)曲線更具代表性，在日后的檢驗(yàn)過程中仍應(yīng)不斷完善標(biāo)準(zhǔn)曲線，并定期進(jìn)行校準(zhǔn)，最大化的確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。巴氏殺菌羊乳因其細(xì)菌譜及加工工藝不同，并不適用于本方法，有待于進(jìn)一步的探索和研究。

表4 巴氏殺菌乳樣品菌落總數(shù)的檢測結(jié)果

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 19645-2010.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)巴氏殺菌乳[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.2-2010.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

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Application research in rapid detection of aerobic plate count in pasteurized cow’s milk by impedance method

DU Hanchun1,YE Kaifu1,LIU Shaogang2,HUANG Daoping1,TAN Xuecai2
(1.Guangxi Center for Analysis and Test Research,Nanning 530022,China；2.School of Chemistry and Chemical Engi?neering of Guangxi University for Nationalities,Nanning 530008,China)

A method for rapid detection of aerobic plate count in pasteurized cow’s milk by impedance method was established.The follow?ing relationship between the germ count and the impedance detection time(t)was determined for the calibration equation:y=-0.5923 t+ 9.4172,r=-0.9907,with high reliability,and the authentic detection threshold was 10～107mL-1,fully meet the requirements of the national food safety standard.The establishment of the sample evaluation criteria could be fast,intuitive evaluation ofthe milk samples,the fastest 7.46 h could determine whether the sample is qualified,greatly shorten the detection time.Compared with the nationalstandard method,the meth?od was simple,rapid,sensitive,accurate and reliable,and could be used in different periods,sources and acidity of the product,with a wide range ofapplicability and practicality.

impedance method;pasteurized cow’s milk;aerobic plate count

TS252.7

A

1001-2230（2017）04-0056-03

2016-10-24

廣西直屬公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)項(xiàng)目(2011AC Z03)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013GXNSFBA019048)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科能14123006-24)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21367004、21667005)。

杜寒春（1980-），女，高級工程師，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全與檢測。

譚學(xué)才