糖基化交聯(lián)反應(yīng)對酪蛋白膠凝和乳化性質(zhì)的影響

宋春麗，陳佳鵬，任 健

(齊齊哈爾大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾161006)

油料蛋白

糖基化交聯(lián)反應(yīng)對酪蛋白膠凝和乳化性質(zhì)的影響

宋春麗，陳佳鵬，任 健

(齊齊哈爾大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾161006)

利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化酪蛋白與殼寡糖發(fā)生糖基化交聯(lián)反應(yīng)，控制反應(yīng)時間 (1、2 h和4 h) 制備3種糖基化交聯(lián)蛋白質(zhì)(修飾酪蛋白)，分析糖基化交聯(lián)反應(yīng)對酪蛋白膠凝和乳化性質(zhì)的影響。結(jié)果表明：修飾酪蛋白的凝膠時間顯著縮短(約50%)；凝膠的持水能力為99%(800 r/min條件下離心10 min)，較高；凝膠的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化，而且隨著反應(yīng)時間的延長，凝膠的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加規(guī)則；糖基化交聯(lián)反應(yīng)對酪蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性影響較大。

酪蛋白；糖基化；膠凝性質(zhì)；乳化性質(zhì)；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶

利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(E.C. 2.3.2.13，TGase)能夠催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)/間發(fā)生交聯(lián)作用[1]，制備交聯(lián)蛋白質(zhì)，改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，相關(guān)應(yīng)用相當(dāng)廣泛[2]。目前，利用該酶催化蛋白質(zhì)分子中的谷氨酰胺殘基與伯胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)特性，將具有伯胺基團的糖分子導(dǎo)入到蛋白質(zhì)分子中[1]，制備糖基化交聯(lián)蛋白質(zhì)，是一種新型的蛋白質(zhì)糖基化交聯(lián)修飾技術(shù)。其相關(guān)的研究很少，主要集中在蛋白質(zhì)與氨基葡萄糖的糖基化制備及功能性質(zhì)的研究上[3-5]。殼寡糖是殼聚糖通過水解多聚鏈制得的低相對分子質(zhì)量糖，它的基本單位是D-氨基葡萄糖，單糖之間以β-(1,4)糖苷鍵連接[6]，具有較好的溶解性。相對于氨基葡萄糖，殼寡糖具有更多的親水性羥基，更大的分子體積，理論上該糖基對蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)會具有顯著的影響，然而目前對酪蛋白的殼寡糖糖基化交聯(lián)修飾，尤其是不同催化時間產(chǎn)物的膠凝和乳化性質(zhì)的研究未見報道。

本研究以酪蛋白及親水性的殼寡糖為底物，通過TGase催化蛋白質(zhì)與殼寡糖反應(yīng)，制備糖基化交聯(lián)蛋白質(zhì)，采用流變學(xué)方法分析不同反應(yīng)時間對所制得的糖基化交聯(lián)蛋白質(zhì)(修飾酪蛋白)的膠凝性質(zhì)(凝膠點及模量變化)、凝膠微觀結(jié)構(gòu)及乳化性質(zhì)的影響，為酶法糖基化制備功能性配料提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

酪蛋白：購于Sigma公司；TGase：江蘇一鳴精細化工有限公司；殼寡糖(相對分子質(zhì)量為1 kDa)：浙江金殼生物化學(xué)有限公司；其他試劑均為分析純。

Kinexus pro+型高級旋轉(zhuǎn)流變儀，英國馬爾文公司；TDZ5-WS型離心機，湘儀離心機儀器有限公司；S-3400型掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖基化交聯(lián)酪蛋白的制備

酪蛋白質(zhì)量濃度為50 g/L，殼寡糖濃度為150 mmol/L(殼寡糖添加量是酪蛋白中酰基供體摩爾數(shù)的3倍)，TGase添加量為10 U/g，pH為7.5、37℃恒溫振蕩，反應(yīng)時間分別為1、2 h和4 h，隨后85℃滅酶5 min，冷卻，酸沉、水洗去除未反應(yīng)的殼寡糖，將沉淀溶解并調(diào)節(jié)pH 至7.0，凍干備用。

1.2.2 流變性質(zhì)分析

配制40 g/L的蛋白質(zhì)分散液(pH 7.0)，加入葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)，加入量為20%(以蛋白質(zhì)質(zhì)量計)，于25℃攪拌2 min后，用流變儀測定蛋白質(zhì)酸凝膠形成過程中的動態(tài)流變性質(zhì)，夾具為PP 60，25℃保溫5 min，應(yīng)變值為0.1%。測定在線性黏彈區(qū)內(nèi)，樣品在0～4.5 h內(nèi)的彈性模量(G′)隨時間的變化。凝膠點定義為G′ ≥1 Pa時對應(yīng)的時間[7]。

1.2.3 凝膠持水能力和容重的測定

配制40 g/L的蛋白質(zhì)分散液(pH 7.0)，充填至干燥且稱重的同一規(guī)格離心管中，加入葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)，加入量為20%(以蛋白質(zhì)質(zhì)量計)，于25℃水浴形成凝膠，取出4℃保存，次日稱量其質(zhì)量，800 r/min離心10 min，排凈水分，稱量離心管總質(zhì)量。凝膠的持水能力(WHC，%)由下式計算：

式中：W0為空離心管的質(zhì)量，g；W1為凝膠后樣品加離心管質(zhì)量，g；W2為離心后樣品加離心管質(zhì)量，g。

配制40g/L的蛋白質(zhì)分散液(pH7.0)，充填至同一規(guī)格的燒杯中，加入葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)，加入量為20%(以蛋白質(zhì)質(zhì)量計)，于25℃水浴形成凝膠，取出4℃保存，次日稱量其質(zhì)量以及測定凝膠高度，容重(ρ，g/cm3)按下式計算：

式中:m為凝膠質(zhì)量，g；d為凝膠直徑，cm；h為凝膠高度，cm。

1.2.4 凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

凝膠微觀結(jié)構(gòu)的觀察采用Haga等[8]的方法。首先按照1.2.3的方法制備凝膠，挑取中心凝塊，用戊二醛溶液固定1h(2.5%，4℃)，隨后用磷酸緩沖液(pH6.8)沖洗兩次，每次10min；然后捶擊使之自然斷裂。分別用50%、70%和90%乙醇溶液進行梯度洗脫，每次洗脫15min，然后用無水乙醇洗脫(3次，每次15min)；用1∶1的無水乙醇-叔丁醇的混合溶液及叔丁醇分別置換15min；將樣品冷凍抽干。利用掃描電子顯微鏡觀察所處理的凝膠微觀結(jié)構(gòu)，樣品放大倍數(shù)為10 000倍。

1.2.5 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測定

參照Pearce等[9]的方法，采用比濁法測定酪蛋白及其修飾產(chǎn)物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 時間掃描分析

利用流變學(xué)方法觀察溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變過程中的凝膠點與最終彈性模量的變化。主要對在線性黏彈區(qū)內(nèi)，監(jiān)測酪蛋白及其修飾產(chǎn)物的分散液在酸化過程中G′隨時間的變化，結(jié)果如圖1所示。

注：a、b、c和d分別為酪蛋白、1h修飾酪蛋白、2h修飾酪蛋白和4h修飾酪蛋白，下同。

圖1 酪蛋白及其修飾產(chǎn)物分散液酸化過程的時間掃描曲線

從圖1可以看出，在時間掃描分析的前期，酪蛋白分散液的彈性模量(G′)幾乎沒有發(fā)生變化，而酸化到一定時間后，G′均出現(xiàn)驟然增加的現(xiàn)象。依據(jù)G′≥1Pa時對應(yīng)的時間為凝膠點這一理論[7]，相對于酪蛋白，糖基化交聯(lián)酪蛋白分散液的凝膠時間顯著縮短，約為酪蛋白的50%。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的蛋白質(zhì)糖基化交聯(lián)反應(yīng)會很大程度上縮短凝膠時間。糖基的導(dǎo)入，有利于氫鍵的形成，進而會縮短凝膠時間[10]。此外可以看出，在測試終點(4.5h)時，酪蛋白修飾產(chǎn)物對應(yīng)的G′都接近于或者高于酪蛋白，較高的彈性模量(G′)表明，酪蛋白修飾產(chǎn)物具有黏彈性固體的性質(zhì)。結(jié)果表明，糖基化交聯(lián)反應(yīng)對凝膠的流變特性影響較大。

2.2 凝膠持水能力及容重變化

酪蛋白及其修飾產(chǎn)物酸凝膠的持水能力及容重測定結(jié)果如圖2所示。

圖2 酪蛋白及其修飾產(chǎn)物酸凝膠的持水能力及

從圖2可以看出，與酪蛋白相比，其修飾產(chǎn)物的酸凝膠的持水能力約為99%，并沒有發(fā)生顯著的變化，表明在低離心力(800r/min)的情況下，酪蛋白及其修飾產(chǎn)物都具有較好的持水能力。這表明在低離心力下，酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，不易被壞破，凝膠中束縛的水不易游離出來。此外，從容重的數(shù)據(jù)可以看出，隨著反應(yīng)的進行，糖基化交聯(lián)酪蛋白的容重發(fā)生了變化，這一定程度上表明凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)存在差異。

2.3 凝膠微觀結(jié)構(gòu)

利用掃描電子顯微鏡觀察分析凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，進一步分析酪蛋白及其修飾產(chǎn)物酸凝膠的性質(zhì)。酪蛋白及其修飾產(chǎn)物所制凝膠的微觀結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 酪蛋白及其修飾產(chǎn)物凝膠的掃描電子顯微鏡圖

從圖3可以看出，相對于酪蛋白，酪蛋白修飾產(chǎn)物所制酸凝膠的微結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。在反應(yīng)的初期(1 h修飾酪蛋白)，酪蛋白凝膠的粒子相互交聯(lián)的程度不明顯，沒有建立起明顯的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成了不規(guī)則的粗鏈。隨著反應(yīng)的進行，這種交聯(lián)作用逐漸增強，凝膠粒子結(jié)構(gòu)伸展，而且結(jié)構(gòu)更加規(guī)則，最終使酪蛋白酸凝膠的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加規(guī)則(2 h修飾酪蛋白和4 h修飾酪蛋白)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化酪蛋白分子發(fā)生的交聯(lián)作用對形成規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)貢獻較大[11-12]?？梢娞腔宦?lián)反應(yīng)能夠顯著改變酪蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.4 乳化活性和乳化穩(wěn)定性

酪蛋白及其修飾產(chǎn)物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性分析結(jié)果如圖4所示。

圖4 酪蛋白及其修飾產(chǎn)物的乳化活性及乳化穩(wěn)定性

從圖4可以看出，與酪蛋白相比，修飾酪蛋白的乳化活性從47.5 m2/g下降到34.1～39.6 m2/g，乳化穩(wěn)定性從92.6%下降到60.6%～83.3%。結(jié)果表明，3種修飾酪蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性均下降，但是程度不同。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的β-酪蛋白的交聯(lián)修飾作用降低了酪蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性[13]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的糖基化交聯(lián)反應(yīng)，在糖基導(dǎo)入到蛋白質(zhì)的同時會發(fā)生蛋白質(zhì)的交聯(lián)?？梢娞腔宦?lián)反應(yīng)對修飾酪蛋白的乳化性影響較大。

3 結(jié) 論

本文研究了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的殼寡糖糖基化交聯(lián)反應(yīng)對酪蛋白的膠凝和乳化性質(zhì)的影響。該反應(yīng)顯著縮短了凝膠時間(約50%)，改變了凝膠內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠的持水能力較高。同時，該反應(yīng)對酪蛋白的乳化性質(zhì)影響較大。

[1] DEJONG G, KOPPELMAN S. Transglutaminase catalyzed reactions: impact on food applications[J]. J Food Sci, 2002, 67(8): 2798-2806.

[2] GASPAR A L, DE GES-FAVONI S P. Action of microbial transglutaminase (MTGase) in the modification of food proteins: a review[J]. Food Chem, 2015, 171: 315-322.

[3] JIANG S J, ZHAO X H. Transglutaminase-induced cross-linking and glucosamine conjugation in soybean protein isolates and its impacts on some functional properties of the products [J]. Eur Food Res Technol, 2010, 231(5): 679-689.

[4] 周利敏, 劉曉蘭, 劉玥, 等. TGase催化玉米醇溶蛋白糖基化改性[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(24): 15-19.

[5] HONG P K, NDAGIJIMANA M, BETTI M. Glucosamine-induced glycation of hydrolysed meat proteins in the presence or absence of transglutaminase: chemical modifications

and taste-enhancing activity[J]. Food Chem, 2016, 197: 1143-1152.

[6] 蔣挺大. 殼聚糖[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2001.

[7] ERCILI-CURA D, LILLE M, LEGLAND D, et al. Structural mechanisms leading to improved water retention in acid milk gels by use of transglutaminase[J]. Food Hydrocoll, 2013, 30(1): 419-427.

[8] HAGA S, OHASHI T. Heat-induced gelation of a mixture of myosin B and soybean protein[J]. Agric Biol Chem, 1984, 48(4): 1001-1007.

[9] PEARCE K N, KINSELLA J E. Emulsifying properties of proteins: evaluation of a turbidimetric technique[J]. J Agric Food Chem, 1978, 26(3): 716-723.

[10] SONG C L, ZHAO X H. Rheological, gelling and emulsifying properties of a glycosylated and cross-linked caseinate generated by transglutaminase[J]. Int J Food Sci Technol, 2013, 48(12): 2595-2602.

[11] SCHORSCH C, CARRIE H, NORTON I T. Cross-linking casein micelles by a microbial transglutaminase: influence of cross-links in acid-induced gelation[J]. Int Dairy J, 2000, 10(8): 529-539.

[12] FAERGEMAND M, QVIST K B. Transglutaminase: effect on rheological properties, microstructure and permeability of set style acid skim milk gel[J]. Food Hydrocoll, 1997, 11(3): 287-292.

[13] LIU M, DAMODARAN S. Effect of transglutaminase-catalyzed polymerization ofβ-casein on its emulsifying properties[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47(4): 1514-1519.

Effects of glycation cross-linking reaction on gelling and emulsifying properties of casein

SONG Chunli, CHEN Jiapeng, REN Jian

(Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province,Qiqihar University, Qiqihar 161006, Heilongjiang, China)

Transglutaminase was used to catalyze glycation cross-linking reaction of casein and oligochitosan. Three kinds of glycation cross-linked proteins (modified casein) were prepared by controlling reaction time of 1, 2, 4 h. The effects of glycation cross-linking reaction on gelling and emulsifying properties of casein were analyzed. The results showed that the gelation time of the modified casein nearly reduced by 50%. The water holding capacity (centrifugation at 800 r/min for 10 min) of the gel was higher, reaching 99%. The microstructure of the gel changed significantly, and the spatial network structure of the gel was more regular with the reaction time prolonging. The effects of glycation cross-linking reaction on the emulsifying activity and emulsion stability were great.

casein; glycation; gelling property; emulsifying property; transglutaminase

2016-05-04;

2016-10-22

黑龍江省自然科學(xué)基金項目(B201421)

宋春麗(1980)，女，副教授，研究方向為蛋白質(zhì)化學(xué)(E-mail)songchunlilily@sina.com。

Q518.3;O63

A

1003-7969(2017)02-0098-04