沙棘和文冠果油體蛋白提取及雙向電泳分析

李榮榮，阮成江，馬 倩，杜 維

(大連民族大學(xué) 資源植物研究所，遼寧 大連116600)

油料蛋白

沙棘和文冠果油體蛋白提取及雙向電泳分析

李榮榮，阮成江，馬 倩，杜 維

(大連民族大學(xué) 資源植物研究所，遼寧 大連116600)

從沙棘果肉和文冠果種仁中提取油體蛋白，并進(jìn)行雙向電泳分析。結(jié)果表明：沙棘果肉和文冠果種仁的油體蛋白相對分子質(zhì)量主要集中在10～60 kD之間；沙棘果肉油體蛋白雙向電泳圖譜至少含有281個蛋白點，文冠果種仁油體蛋白則至少含有248個蛋白點，兩種木本油料的酸性蛋白點均多于堿性蛋白點，且蛋白點主要集中在等電點4.0～7.0之間。實驗結(jié)果為進(jìn)一步對沙棘和文冠果的油體蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供依據(jù)和基礎(chǔ)。

沙棘；文冠果；油體；油體蛋白；雙向電泳

油體是植物的儲油細(xì)胞器[1]，其大小與分布直接影響器官含油量。油體外部包被一層磷脂和蛋白質(zhì)鑲嵌而成的半單位膜，油體膜及膜上附著的蛋白占油體質(zhì)量的1%～4%，脂肪酸以三酰甘油的形式儲存在膜內(nèi)。油體蛋白中約90%為油質(zhì)蛋白(oleosins)，少量為油體鈣蛋白(caleosin)等其他蛋白，它們共同參與油體結(jié)構(gòu)的建成和生物學(xué)功能，并在油體的形成、穩(wěn)定及油脂代謝利用過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2-7]。近20年來對油體及油體蛋白的研究趨于多樣性，齊玉紅等[2]研究了大豆、花生等不同作物油體的性質(zhì)，曾艷玲等[7]研究了芝麻、花生等作物油體蛋白組分含量的比較及溫度對油體儲存的影響。

沙棘和文冠果是北方重要的木本油料，抗旱、耐瘠薄，在我國北方防沙治沙、干旱半干旱區(qū)生態(tài)建設(shè)和退耕還林中被大面積推廣[8-10]。但到目前為止對沙棘和文冠果油脂的合成機(jī)制仍不清楚。本研究從沙棘果肉和文冠果種仁中提取油體蛋白，并使用雙向電泳方法對其進(jìn)行分析，不僅有助于了解這兩種木本油料油體蛋白的組成、種類和理化性質(zhì)，也可為進(jìn)一步對這兩種木本油料的油脂合成及其蛋白調(diào)控的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

沙棘：實優(yōu)一號，果實采自大連民族大學(xué)校園內(nèi)沙棘林，采摘后在低溫環(huán)境下用解剖刀將其果肉和種子進(jìn)行分離，果肉冷凍備用。文冠果：東蘭一號，采自內(nèi)蒙古赤峰，破殼處理后將種仁冷凍備用。

KCl， MgCl2，蔗糖， 石油醚，氯仿，丙酮，尿素，瓊脂糖，甘氨酸，過硫酸銨，考馬斯亮藍(lán)G-250，磷酸銨，磷酸(優(yōu)級純，科密歐)；EDTA，DTT，SDS，硫脲，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，IAM(阿拉丁)；CHAPS(進(jìn)口)；Tris-HCl(生工)；甲醇(色譜純，科密歐)；Bio-Lyte(Bio-Rad)；標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白(美國MP公司)；GMI(1 mmol/L EDTA，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，2 mmol/L DTT,0.6 mol/L蔗糖,0.15 mmol/L Tricine-KOH,pH 7.5)；FMI(0.4 mol/L蔗糖，其他成分與GMI相同)；GMII(GMI+2 mol/L NaCl);FMII(FMI+2 mol/L NaCl)

1.1.2 儀器與設(shè)備

UH5300型分光光度計(Hitachi),PROTEANi12型等電聚焦儀(Bio-Rad),GS-900型校準(zhǔn)光密度儀(Bio-Rad),ProteanII XLCell垂直板電泳儀(Bio-Rad)，IPG膠條(11 cm，pH 4～7，Bio-Rad),渦旋振蕩器(上海昕儀),微波爐(Midea),搖床,紫外分光光度計,離心機(jī)，雙向電泳系統(tǒng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 油體分離

[11-13]的方法。取6 g左右冷凍備用的沙棘果肉或文冠果種仁，液氮下充分研磨成粉末，按如下步驟操作：①加入15 mL GMI，再加入15 mL FMI，4℃、10 000g條件下離心30 min。②取上層油層將其重懸于15 mL GMII，加入15 mL FMII，如上條件離心。③重復(fù)步驟①。④取上層油層重懸于15 mL GMII溶液，室溫振蕩30 min，懸浮液如上條件離心。⑤重復(fù)步驟①。最終將得到的油體懸浮于GMI溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 油體蛋白提取

取已分離的沙棘果肉油體或文冠果種仁油體2 mL，加入等體積的石油醚，振蕩，13 000g、4℃條件下離心5 min，用移液槍去除上層的石油醚相。重復(fù)以上實驗2次以上，直至上層石油醚相顏色變淡，然后氮氣噴射除去殘余的石油醚。加入3 mL氯仿-甲醇(體積比2∶1)，振蕩，如上條件離心。用移液槍去除上層和下層液相，將富含蛋白的中間層重懸于1 mL水，加入3 mL氯仿-甲醇(體積比2∶1)，振蕩，如上條件離心。重復(fù)以上實驗3次。最終，將中間層蛋白重懸于2 mL水，超聲波處理5 min。加入4倍體積的冷丙酮，于-20℃沉淀16 h以上，然后13 000g離心20 min，再加入冷丙酮清洗2～3次，如上條件離心，所得蛋白沉淀凍干備用[11-13]。

1.2.3 油體蛋白的SDS-PAGE

改進(jìn)齊玉紅等[2]的油體蛋白SDS-PAGE電泳方法。取經(jīng)上樣緩沖液處理后的蛋白樣品，每孔加樣10 μL，用12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，每塊膠的電流強(qiáng)度為20 mA，10 min后改為60 mA，直至樣品達(dá)到膠板底部，結(jié)束電泳；后用考馬斯亮藍(lán)G250染色2 h，脫色，拍照觀察。

1.2.4 油體蛋白的雙向電泳分析

1.2.4.1 等電聚焦

取凍干備用的蛋白干粉，用蛋白裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、0.2% Bio-Lyte)裂解，采用Bradford法[14]測定樣品中蛋白質(zhì)含量，以確保上樣量。從-20℃冰箱取出IPG膠條，室溫放置10 min。用移液槍沿著水化盤槽的邊緣由左到右加入樣品(0.6 g/L，200 μL)，用鑷子輕輕去除IPG膠條上的保護(hù)層，將膠條覆蓋于樣品之上，膠條標(biāo)有“+”號一端對應(yīng)水化盤的正極。在膠條上覆蓋2 mL的礦物油后采用主動水化，條件為50 V、17℃、12 h，等電聚焦具體參數(shù)見表1。每根膠條的最大電流設(shè)置為50 μA。

表1 等電聚焦參數(shù)

1.2.4.2 膠條平衡

等電聚焦結(jié)束后取出膠條，用濾紙吸取礦物油，加入平衡緩沖液I(5 mL平衡緩沖母液+0.1 g DTT)進(jìn)行第一次平衡，時間為15 min；用濾紙吸取膠條上多余的平衡緩沖液I，加入平衡緩沖液II(5 mL平衡緩沖母液+0.125 g IAM)進(jìn)行第二次平衡，時間為15 min。膠條平衡緩沖母液：6 mol/L尿素、2% SDS、0.375 mol/L pH 8.8 Tris-HCl、20%甘油。

1.2.4.3 SDS-PAGE

平衡結(jié)束后，用濾紙吸去多余的平衡緩沖液，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸沒在1×電泳緩沖液(25 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、0.1% SDS)中。將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上，加入封膠液(0.5% 瓊脂糖、25 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、0.1% SDS、0.001% 溴酚藍(lán))，避免膠條與膠面之間產(chǎn)生氣泡。待低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中，并加入1×電泳緩沖液，接通電源，使進(jìn)膠條件為10 mA/膠，分離條件為20 mA/膠。待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時停止電泳。

1.2.4.4 染色與脫色

采用Neuhoff考染法[15]。雙向電泳結(jié)束后用固定液對凝膠固定2 h，然后用染色液染色24 h，染色結(jié)束后用去離子水水洗3次，每次10 min。

1.2.4.5 圖像掃描與分析

用GS-900型校準(zhǔn)光密度儀進(jìn)行掃描拍照(同種樣品不同次)，用PDQuest 8.0 軟件對所得圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 油體提取

分離出的沙棘果肉和文冠果種仁的油體見圖1。

圖1 沙棘果肉(a)和文冠果種仁(b)的油體

由圖1可看出，沙棘果肉和文冠果種仁的油體的基本形態(tài)均為圓形或橢圓形，沙棘果肉的油體分布較文冠果種仁分散，且體積較小(見圖1方框中)，同時還存在黃色較大的圓形或不規(guī)則形狀的非油體物質(zhì)。

2.2 油體蛋白的SDS-PAGE

將蛋白干粉溶解于上樣緩沖液中，做SDS-PAGE，結(jié)果如圖2所示。

圖2 沙棘果肉(1)和文冠果種仁(2)油體蛋白的SDS-PAGE

由圖2可看出，沙棘果肉和文冠果種仁的油體蛋白主要集中在10～60 kD之間，均得到8、12、25 kD和35 kD左右4條明顯的油體蛋白帶，文冠果油體高表達(dá)蛋白相對集中，沙棘油體蛋白相對分子質(zhì)量分布較廣。

2.3 油體蛋白的雙向電泳

經(jīng)雙向電泳對沙棘果肉和文冠果種仁油體蛋白進(jìn)行多次實驗與分析獲得了蛋白點豐富、分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜，見圖3、圖4。

圖3 沙棘果肉油體蛋白雙向電泳分析

圖4 文冠果種仁油體蛋白雙向電泳分析

由圖3可看出，沙棘果肉油體蛋白雙向電泳圖譜至少含有281個蛋白點，其中酸性蛋白點明顯多于堿性蛋白點，蛋白點主要集中在等電點4.0～7.0之間，對重復(fù)實驗得到的雙向電泳圖譜進(jìn)行重復(fù)性分析，得出其匹配率達(dá)到88%，相對分子質(zhì)量在13～30 kD、等電點在5.5～7.0之間的蛋白分布相似，相對分子質(zhì)量在50～97 kD、等電點在5.0～7.0之間的蛋白分布相似，圖3中圓圈的酸性區(qū)域蛋白點存在一定差異。

由圖4可看出，文冠果種仁油體蛋白雙向電泳圖譜至少含有248個蛋白點，同樣酸性蛋白點多于堿性蛋白點，蛋白點主要集中在等電點4.0～7.0之間，文冠果含油量多且含糖量低，油體提取較沙棘容易且得到的蛋白雜質(zhì)少，重復(fù)實驗蛋白點分布基本一致。

2.4 討論

樣品制備是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為基礎(chǔ)和重要的步驟，樣品制備的好壞可以從雙向電泳結(jié)果得以直觀的體現(xiàn)[16-17]。本研究的蛋白樣品是在分離獲得油體的基礎(chǔ)之上提取的，由于油體蛋白大多具有一部分疏水區(qū)域，提取與電泳分析較困難，本研究所獲得的油體狀態(tài)與之前報道的油菜籽、水稻、黑豆、紅花、芝麻等[1-2，7]的油體狀態(tài)相符，但本研究的沙棘油體圖像中顯示出黃色較大的圓形或不規(guī)則形狀的非油體物質(zhì)，這是由于沙棘本身含油量少且含糖量較高，分析此物質(zhì)是糖類等和未能分離的果肉物質(zhì)與油體形成的聚合物。同時，沙棘油體蛋白雙向電泳圖的酸性端區(qū)域出現(xiàn)拖尾，這主要是因為樣品中帶負(fù)電荷的雜質(zhì)較多，等電聚焦中聚集到酸性端附近造成酸性端聚焦不完全形成的。相對分子質(zhì)量為15～24 kD[3]的油質(zhì)蛋白在油體蛋白中最為豐富，據(jù)此推測圖3、圖4方框內(nèi)某點為小分子油質(zhì)蛋白，未來將對此處蛋白點做質(zhì)譜分析。

3 結(jié) 論

本研究從沙棘果肉和文冠果種仁中提取油體蛋白，并進(jìn)行雙向電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙棘果肉和文冠果種仁的油體蛋白主要集中在10～60 kD之間；沙棘果肉油體蛋白雙向電泳圖譜至少含有281個蛋白點，對其進(jìn)行重復(fù)性分析匹配率達(dá)88%，文冠果種仁油體蛋白則至少含有248個蛋白點，重復(fù)實驗的蛋白點分布基本一致，兩種木本油料的酸性蛋白點均多于堿性蛋白點，且蛋白點主要集中在等電點4.0～7.0之間。

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Extraction and two-dimensional electrophoresis analysis of oil body proteins from seabuckthorn and yellow horn

LI Rongrong, RUAN Chengjiang, MA Qian, DU Wei

(Institute of Plant Resources,Dalian Nationalities University, Dalian 116600, Liaoning,China)

Oil body proteins were respectively extracted from seabuckthorn pulp and yellow horn kernel, and analyzed by two-dimensional electrophoresis. The results showed that the relative molecular weights of oil body proteins from seabuckthorn pulp and yellow horn kernel were mainly in the range of 10-60 kDa; two-dimensional electrophoresis could present the ideal picture of oil body proteins, in which 281 protein spots were found from oil body protein in seabuckthorn pulp and 248 protein spots were found from oil body protein in yellow horn kernel, respectively. The acidic protein spots of these two woody oil plants were more than alkaline protein spots, and the isoelectric points of most protein spots ranged from 4.0 to 7.0. The results provided scientific base for oil body proteomics of seabuckthorn and yellow horn.

seabuckthorn; yellow horn; oil body; oil body protein; two-dimensional electrophoresis

2016-06-01;

2016-11-17

國家自然科學(xué)基金(13570681)；國家“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域科技支撐計劃專題(2015BAD07B0106)

李榮榮(1990)，女，碩士研究生，研究方向為植物蛋白質(zhì)組學(xué)(E-mail)lirongrong201507@163.com。

阮成江，教授，博士(E-mail)ruan@dlnu.edu.cn。

TQ936.2;O657

A

1003-7969(2017)02-0089-04