ANGPTL4對LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

趙詠梅 王瑞 李新宇 賀志高 桂俊豪 張東輝 王曉燕 張峰 張羽 姜鵬

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·論著·

ANGPTL4對LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

趙詠梅 王瑞 李新宇 賀志高 桂俊豪 張東輝 王曉燕 張峰 張羽 姜鵬

目的探討ANGPTL4對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HPMVECs)損傷的保護(hù)作用。方法以體外培養(yǎng)的HPMVECs作為實(shí)驗(yàn)對象，將細(xì)胞隨機(jī)分為四組：正常對照組(C組)、LPS誘導(dǎo)組(L組)、ANGPTL4表達(dá)組(A組)和ANGPTL4表達(dá)+ LPS誘導(dǎo)組(A+L組)。各處理組細(xì)胞分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后采用CCK-8法觀察細(xì)胞增殖；細(xì)胞孵育12 h后，采用熒光定量PCR和Wester-blot檢測ANGPTL4表達(dá)水平， ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β和MCP-1的蛋白含量。結(jié)果與C組相比，L組和A組細(xì)胞的ANGPTL4表達(dá)明顯增高(P<0.01)；與L組相比，A+L組細(xì)胞的ANGPTL4表達(dá)明顯增高(P<0.01)，LPS刺激可以抑制細(xì)胞增殖，而經(jīng)過pcDNA3.1-ANGPTL4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后這種抑制作用又被削弱了；高表達(dá)ANGPTL4抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的生成。結(jié)論ANGPTL4可以減弱LPS抑制HPMVECs細(xì)胞增殖的作用，降低細(xì)胞中TNF-α, IL-1β和MCP-1等炎癥因子的生成，這些效應(yīng)可能是ANGPTL4保護(hù)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制之一。

ANGPTL4; 急性肺損傷; 人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞

急性肺損傷(severe acute lung injury, ALI)是由各種肺內(nèi)外因素所致的以急性呼吸窘迫、非心源性肺水腫和持續(xù)過度的炎癥反應(yīng)為特點(diǎn)的臨床綜合征，是爆發(fā)性流感、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、重癥肺炎等疾病死亡的主要原因[1-3]。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞在ALI的發(fā)病過程中起著重要作用，包括改變細(xì)胞代謝活性，影響肺和全身的動(dòng)態(tài)平衡、介導(dǎo)細(xì)胞—細(xì)胞黏附特別是介導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附、改變氣血屏障通透性，促進(jìn)肺水腫形成等[4]。ANGPTL4基因是ANGPTLs 基因家族的一個(gè)成員，在調(diào)節(jié)血管發(fā)生、脂類代謝、糖類代謝和胰島素敏感性等具有重要作用，ANGPTL4能顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、趨化性和血管形成，并且顯著抑制體內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的血管生成和血管滲漏[5-7]。本研究擬通過建立脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular endothelial cells, HPMVECs)損傷的模型，觀察ANGPTL4基因表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，評估ANGPTL4對LPS誘導(dǎo)的HPMVECs損傷的影響，探討其可能的保護(hù)作用與機(jī)制，為ALI防治提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

HPMVECs細(xì)胞購自美國ScienCell公司，細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行；pcDNA3.1-ANGPTL4重組質(zhì)粒由本室制備并保存。MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；ANGPTL4、GAPDH抗體購自Abcam公司；LPS購自Sigma公司；抗人TNF-α、IL-1β和MCP-1 ELISA檢測試劑盒購自R&D公司；蛋白裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自北京普利萊公司；HRP二抗、內(nèi)參一抗購自GenScript公司；Trizol購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑購自Takara公司；CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染: 轉(zhuǎn)染前12～18 h，取生長狀態(tài)良好的HPMVECs，按4×105cells/孔接種于24孔板，轉(zhuǎn)染時(shí)稀釋5 μg質(zhì)粒DNA在無血清和抗體的培養(yǎng)基至100 μl，再加入Superfect Transfection Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑30 μl混勻，室溫孵育5～10 min，加入含1 ml培養(yǎng)基的孔中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)3 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2. 實(shí)驗(yàn)分組: 將生長狀態(tài)良好的HPMVECs細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板，并隨機(jī)分為四組：對照組(C組)、LPS誘導(dǎo)組(L組)、ANGPTL4表達(dá)組(A組)和ANGPTL4表達(dá)+LPS誘導(dǎo)組(A+L組)；C組細(xì)胞經(jīng)pcDNA3.1空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，A組經(jīng)pcDNA3.1-ANGPTL4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HPMVECs細(xì)胞；L組細(xì)胞經(jīng)pcDNA3.1空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 hr加入終濃度為5.0 μg/ml的LPS，A+L組細(xì)胞經(jīng)pcDNA3.1-ANGPTL4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h加入終濃度為5.0 μg/ml的LPS；37 ℃，5% CO2培養(yǎng)12 h后行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測。

3. 檢測指標(biāo): 各組細(xì)胞分別繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h后采用CCK-8法觀察細(xì)胞增殖(方法同文獻(xiàn)[8])；細(xì)胞孵育12 h后，熒光定量PCR和Wester-blot檢測ANGPTL4表達(dá)水平(相關(guān)引物序列如表1示，ALB、FOXP2為參考基因，方法同文獻(xiàn)[9])； ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β和MCP-1的含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明。

表1 相關(guān)引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、ANGPTL4轉(zhuǎn)染效率

用熒光定量PCR和Western blot方法檢測pcDNA3.1-ANGPTL4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對HPMVECs細(xì)胞中ANGPTL4表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與C組相比， L組和A組細(xì)胞的ANGPTL4表達(dá)明顯增高(P<0.01)；與L組相比，A+L組細(xì)胞的ANGPTL4表達(dá)明顯增高(P<0.01)，表明LPS刺激和pcDNA3.1-ANGPTL4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后都可以使細(xì)胞中ANGPTL4的表達(dá)增高，見圖1A、B。

圖1 LPS刺激和pcDNA3.1-ANGPTL4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中ANGPTL4的表達(dá)；注：A：RT-PCR 檢測各組細(xì)胞 ANGPTL4基因的表達(dá)；B：Western blot檢測各組細(xì)胞 ANGPTL4蛋白的表達(dá)(*P<0.05)

二、ANGPTL4對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的影響

CCK8檢測各組細(xì)胞在 12、24、48、72 h的吸光度值，繪制增殖曲線，結(jié)果顯示：與C組相比，L組細(xì)胞的增殖受到抑制，差異有顯著意義(P<0.05)；而A+L組與L組相比，其細(xì)胞的增殖又被促進(jìn)了(P<0.05)，見圖2A；說明LPS刺激可以抑制細(xì)胞增殖，而經(jīng)過pcDNA3.1-ANGPTL4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后這種抑制作用又被削弱了。

三、ANGPTL4對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子的影響

采用ELISA檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的含量，結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在炎癥刺激下的炎癥因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的含量明顯低于LPS刺激組，說明高表達(dá)ANGPTL4抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的生成，見圖2B。

圖2 LPS刺激和pcDNA3.1-ANGPTL4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞增殖和炎癥因子的影響；注：A：CCK8檢測各組細(xì)胞的增殖；B：ELISA檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的含量(*P<0.05)

討 論

肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞位于肺微循環(huán)交換血管的最內(nèi)層，通過細(xì)胞間的相互作用以及與細(xì)胞外基質(zhì)的連接構(gòu)成屏障，參與肺內(nèi)多種生理功能調(diào)節(jié)，如宿主防御反應(yīng)、血管生成和微血管緊張性的維持等[10]。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能失調(diào)作為在ALI發(fā)病過程的中心環(huán)節(jié)，可以引起血流動(dòng)力學(xué)和體液平衡改變，促進(jìn)血循環(huán)中的細(xì)胞相互作用，從而導(dǎo)致血管通透性增加和肺水腫形成[9]。格蘭陰性菌外膜的免疫原LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化后，可激活炎癥反應(yīng)，生成大量的炎癥因子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或功能障礙[11]，進(jìn)而引起機(jī)體產(chǎn)生一系列級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織損傷。

ANGPTL4基因是ANGPTLs 基因家族的成員之一，在肺、腎、肝臟、垂體、骨骼肌和心臟中均有表達(dá)[12-14]。ANGPTL4基因具有多種作用，但其最重要的作用是調(diào)節(jié)血管發(fā)生、脂類代謝、糖類代謝和胰島素敏感性等。血管發(fā)生既是機(jī)體生長發(fā)育的正常生理過程，又是腫瘤、心血管疾病和各種炎性反應(yīng)的重要病理基礎(chǔ)[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)ANGPTL4參與調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[15]，我們的前期研究結(jié)果顯示, 上調(diào)ANGPTL4在小鼠肺內(nèi)的表達(dá)，能夠減輕 LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺部炎癥損傷反應(yīng)[9]，本研究結(jié)果也顯示，LPS誘導(dǎo)HPMVECs中ANGPTL4的表達(dá)增加，因此推測ANGPTL4 可能通過調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞的炎癥損傷而參與調(diào)節(jié)ALI的發(fā)生發(fā)展。

已知TNF-α、IL-1β和MCP-1是重要的炎性介質(zhì)，可以導(dǎo)致發(fā)熱、代謝性酸中毒、腹瀉、低血壓以及彌漫性血管內(nèi)凝血等[16-19]。在炎癥介質(zhì)的作用下，細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞通透性增加，引起細(xì)胞損傷并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在ALI的發(fā)病過程中肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡是ALI重要的病理變化。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加了血管內(nèi)皮通透性，促進(jìn)了中性粒細(xì)胞黏附到肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，縮短中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞遷移到肺間質(zhì)和肺泡的時(shí)間，最終引起肺呼吸換氣障礙，加重肺損傷和增加動(dòng)物死亡率[20-21]，因此減緩促炎因子的釋放將有助于保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能。

基于以上推測，本研究通過建立LPS刺激HPMVECs損傷的模型，觀察ANGPTL4基因表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞可能的保護(hù)作用，結(jié)果顯示, 經(jīng)LPS刺激的HPMVECs細(xì)胞增殖被抑制了，同時(shí)生成大量的TNF-α、IL-1β和MCP-1。上調(diào)ANGPTL4的表達(dá)后，HPMVECs的細(xì)胞增殖開始明顯恢復(fù)，并且細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β和MCP-1的水平也顯著降低了，表明ANGPTL4基因表達(dá)對LPS刺激的HPMVECs損傷具有一定的保護(hù)作用。

ANGPTL4基因作為各種炎癥信號(hào)通路的連接點(diǎn)，是炎癥反應(yīng)的保護(hù)性蛋白，ANGPTL4基因的高表達(dá)可能影響炎癥因子的相關(guān)信號(hào)通路如PKC、ERK-MAPK通路等，減少炎癥因子的釋放，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞凋亡，維持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定性，保護(hù)肺損傷。在LPS 誘導(dǎo)的 ALI 發(fā)病過程中，對ANGPTL4的調(diào)控基因和相關(guān)信號(hào)通路的研究將是下一步工作的重點(diǎn)。

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(本文編輯：王亞南)

趙詠梅，王瑞，李新宇，等. ANGPTL4對LPS誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(2)： 192-195.

Protective effect of ANGPTL4 on human lung microvascular endothelial cell injury

ZhaoYongmei,WangRui,LiXinyu,HeZhigao,GuiJunhao,ZhangDonghui,WangXiaoyan,ZhangFeng,ZhangYu,JiangPeng.

XinjiangMedicalUniversity,MilitaryGeneralHospitalinXinjiangofPeople′sLiberationArmy,Urumchi830000,China

JiangPeng,Email：jipzym@126.com

Objective To investigate the protective effect of ANGPTL4 to human lung microvascular endothelial cell injury. Method Human lung microvascular endothelial cells cultured in vitro were randomly divided into four groups: normal control group (group C), LPS induced group (group L), ANGPTL4 expression (group A) and ANGPTL4+LPS induced group (group A+L). CCK8 method was used to observe cell proliferation; fluorescence quantitative PCR and Western blot were applied to test ANGPTL4 expression level, Inflammatory factor TNF-α, IL-1β and MCP-1in cell culture fluid were also detected by ELISA method. Results Compared with group C, the expression of ANGPTL4 in group L and group A was significantly higher(P<0.01); Compared with group L,The expression of ANGPTL4 in A+L group was significantly higher (P<0.01), LPS stimulation can inhibit cell proliferation, and after pcDNA3.1- ANGPTL4 recombinant plasmid transfection, this inhibition was weakened; high ANGPTL4 expression can also inhibit the generation of inflammatory factor TNF-α, IL-1β and MCP-1. Conclusions ANGPTL4 can inhibit LPS induced HPMVECs cell proliferation decreased, and reduce the generation of Inflammatory factor TNF-α, IL-1β and MCP-1, which may be one of the mechanism of the protective effect of ANGPTL4 to human lung microvascular endothelial cells.

ANGPTL4; Acute lung injury; Human lung microvascular endothelial cell

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.016

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金 資助項(xiàng)目(2013211A062)

830000 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué) 現(xiàn)為新疆軍區(qū)總醫(yī)院

姜鵬，Email：jipzym@126.com

R563

A

2016-12-28)