基因芯片篩選Sirt1在小鼠急性呼吸窘迫綜合征炎癥損傷中相互作用的基因

劉俊彥 呂學(xué)軍 趙維 胡明冬 李玉英 王關(guān)嵩 徐劍誠 錢桂生

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·論著·

基因芯片篩選Sirt1在小鼠急性呼吸窘迫綜合征炎癥損傷中相互作用的基因

劉俊彥 呂學(xué)軍 趙維 胡明冬 李玉英 王關(guān)嵩 徐劍誠 錢桂生

目的篩選小鼠急性呼吸窘迫綜合征炎癥損傷中與Sirt1相互作用的基因，探討Sirt1在急性呼吸窘迫綜合征炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制。方法購買Sirt1過表達(dá)(Tg)小鼠和野生型(WT)小鼠，飼養(yǎng)、繁殖、鑒定新生小鼠基因型；Western Blot鑒定小鼠肺組織Sirt1表達(dá)差異；建立ARDS小鼠模型，觀察ARDS小鼠肺組織HE染色病理變化，并采用ELISA檢測兩種ARDS小鼠肺組織IL-6表達(dá)差異；采用基因芯片篩選Sirt1在小鼠ARDS炎癥損傷中相互作用的基因。結(jié)果通過聚合酶鏈反應(yīng)鑒定出Tg和WT兩種不同基因型的小鼠；免疫印跡法檢測小鼠肺組織Sirt1的表達(dá)差異結(jié)果提示Tg小鼠肺組織Sirt1含量顯著高于WT小鼠(P=0.001)；不同濃度LPS腹腔注射12 h后小鼠肺組織HE染色病理變化提示隨著LPS用量增加，兩種小鼠肺組織損傷程度明顯增加，且WT-ARDS小鼠的肺組織損傷程度比Tg-ARDS小鼠更為嚴(yán)重；當(dāng)LPS用量達(dá)到20 mg/kg時兩組小鼠存活率<50%；兩種小鼠腹腔注射LPS(15 mg/kg)后，肺組織IL-6的表達(dá)隨時間推移逐漸呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，在3，6，12，24 h WT-ARDS組肺組織IL-6表達(dá)濃度顯著高于Tg-ARDS組(P<0.05)，尤其在12 h差異最為顯著(P=0.007)?；蛐酒Y選出在小鼠ARDS炎癥損傷中與Sirt1相互作用的基因有Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，Hivep3和Lpar1。結(jié)論Sirt1可能通過調(diào)控Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，Hivep3和Lpar1的表達(dá)減輕ARDS小鼠的炎癥損傷。

急性呼吸窘迫綜合征； 沉默信息調(diào)節(jié)因子1； 泛素D； 核轉(zhuǎn)錄因子κB

Sirtuins是第三類組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDACs)，其分布廣泛，底物眾多，作用機(jī)制復(fù)雜。哺乳動物Sirt1(Sirtuin type 1)是酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Sir2)的同源基因，其功能的發(fā)揮依賴NAD+[1]。核定位的Sirt1因其能去乙?；M蛋白，從而具有調(diào)控多種關(guān)鍵的生理和病理過程，以及多種疾病發(fā)生發(fā)展的能力。研究發(fā)現(xiàn)乙酰白藜蘆醇(AC-Res，Sirt1激活劑)預(yù)處理能使急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)小鼠的炎癥反應(yīng)減輕[2]，因此有學(xué)者將Sirt1定義為ARDS炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子之一[3]，但Sirt1參與ARDS發(fā)生發(fā)展的機(jī)制目前仍未闡明，Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的分子也未有較全面的報道。本實(shí)驗(yàn)通過對兩種不同Sirt1基因的ARDS小鼠肺組織基因芯片進(jìn)行分析，篩選小鼠ARDS中與Sirt1相互作用的基因。

材料和方法

一、研究材料

實(shí)驗(yàn)動物 從美國Jackson實(shí)驗(yàn)室購入Sirt1superB6.Cg-Tg(Sirt1)ASrn/J小鼠(簡稱Tg小鼠)雄鼠2只和野生型(WT)雌性小鼠2只。小鼠飼養(yǎng)在第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院動物中心，按照雌雄1︰1繁殖，室內(nèi)恒溫25 ℃，照明12 h晝夜交替，喂食飼料制備于第三軍醫(yī)大學(xué)動物中心，子代小鼠21 d斷乳分籠，待8周齡后繼續(xù)近親繁殖。

二、主要設(shè)備和試劑

SDS-PAGE電泳設(shè)備，PCR儀，水平電泳儀，Thermo紫外分光光度計，TIANGEN快速DNA提取擴(kuò)增套裝，Trizol、RIPA強(qiáng)裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、Trisbase、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、LPS均來自Biosharp公司，Anti-SIRT1抗體(Abcam公司)，Actin β Polyclonal Antibody(ruiying biological公司)，小鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒(QuantiCyto)，Agilent mRNA 單通道表達(dá)譜芯片。

三、測定方法

1. 動物基因型鑒定

(1)小鼠基因組DNA提取對10～12 d 子代小鼠打耳標(biāo)編號，并剪取0.5 cm尾巴進(jìn)行鑒定?；蚪MDNA提取方法按照TIANGEN快速DNA提取擴(kuò)增套裝，紫外分光光度計進(jìn)行DNA定量。

(2)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)引物來自Jackson實(shí)驗(yàn)室官網(wǎng)，Tg小鼠標(biāo)記(350 bp)F：5′-AGA TAG TTC ACC GGG GTG AGA-3′；Tg-R：5′-TCG GTC GAA GAG TAT CTG GTG-3′。內(nèi)參(200 bp)F：5′-CAA ATG TTG CTT GTC TGG TG-3′；內(nèi)參R：5′-GTC AGT CGA GTG CAC AGT TT-3′。反應(yīng)體系25 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保溫。

2. Western blot鑒定小鼠Sirt1表達(dá): 8～12周齡小鼠，無菌條件下取出肺組織，按照RIPA強(qiáng)裂解液提供方法抽提肺組織蛋白，BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度。加入5*蛋白上樣緩沖液，沸水變性5 min。SDS-PAGE電泳和顯影：兔抗鼠Sirt1抗體(1︰500)或兔抗鼠β-actin抗體(1︰1 000)；山羊抗兔抗體(1︰1 000)。

3. ARDS小鼠模型的建立

(1) ARDS小鼠肺組織HE染色病理變化差異：隨機(jī)選取Tg和WT小鼠(8～12 W)各20只，各隨機(jī)分為5組，分別腹腔注射LPS(0 mg/kg)，LPS(5 mg/kg)，LPS(10 mg/kg)，LPS(15 mg/kg)，LPS(20 mg/kg)[4]，自由進(jìn)食水，12 h后無菌條件下取出肺組織，用4%多聚甲醛固定72 h，常規(guī)制備石蠟切片，帶HE染色。

(2) ELISA檢測兩種ARDS小鼠肺組織IL-6表達(dá)差異：隨機(jī)選取Tg和WT小鼠(8～12 W)各15只，腹腔注射LPS(15 mg/kg)，分別在0、3、6、12、24 h各處死小鼠3只，取肺組織100 μg，加入1 ml PBS，冰上勻漿10 s，4 ℃，以離心半徑8 cm，3 000 r/min離心10 min取上清。按照QuantiCyto小鼠IL-6 ELISA試劑盒說明檢測不同時間點(diǎn)小鼠肺組織IL-6的表達(dá)水平。

4. 基因芯片篩選Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的基因[5]: 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨機(jī)選取Tg和WT小鼠(8～12 w)各10只，各隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射LPS(15 mg/kg)對照組生理鹽水處理，自由進(jìn)食水，12 h后無菌條件下取出肺組織，Trizol法提取肺組織mRNA，-80 ℃保存。Agilent mRNA 單通道表達(dá)譜芯片檢測，由北京博奧公司提供檢測服務(wù)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、基因型鑒定

經(jīng)過繁殖、基因型鑒定篩選出Tg小鼠和WT小鼠，1，2，5，6表達(dá)350 bp條帶和200 bp條帶，為Tg小鼠；3，4，7，8只表達(dá)200 bp條帶，為WT小鼠，見圖1。

二、小鼠Sirt1表達(dá)檢測

免疫印跡法檢測兩種不同Sirt1基因背景的小鼠肺組織Sirt1的含量，Tg小鼠肺組織Sirt1表達(dá)水平顯著高于WT小鼠(P=0.001)，見圖2。

三、ARDS小鼠模型

1. ARDS小鼠肺組織HE染色病理變化： ARDS小鼠肺組織HE染色觀察不同濃度LPS腹腔注射12小時后肺組織的病理形態(tài)，見圖3，當(dāng)LPS用量從5 mg/kg經(jīng)10 mg/kg增加到15 mg/kg時，兩種小鼠肺組織損傷程度明顯增加，鏡下表現(xiàn)為肺組織彌漫性出血、肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞漏出、肺泡間隔破壞增寬、肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤均不同程度增加，且Tg-ARDS小鼠的肺組織損傷程度比WT-ARDS小鼠輕；LPS(20 mg/kg)兩組小鼠存活率<50%，未做進(jìn)一步分析。

2. ARDS小鼠肺組織IL-6表達(dá): 小鼠LPS 15 mg/kg腹腔注射，分別在不同的時間點(diǎn)檢測小鼠肺組織IL-6的表達(dá)差異，見圖4，兩種ARDS小鼠肺組織IL-6的表達(dá)隨時間推移逐漸增加，與0 h對比均差異顯著(P<0.01)；兩種對照組小鼠(0 h)肺組織IL-6濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.239)，在3、6、12、24 h WT-ARDS組肺組織IL-6濃度顯著高于Tg-ARDS組(P<0.05)，尤其在12 h最為顯著(P=0.007)。

圖1 小鼠基因鑒定

圖2 小鼠肺組織Sirt1表達(dá)

圖4 兩種ARDS小鼠肺組織IL-6表達(dá)變化

四、基因芯片篩選Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的基因

通過對基因芯片的數(shù)據(jù)聚類分析WT-ARDS：WT-Control表達(dá)差異顯著的炎癥相關(guān)基因有1 000余個，經(jīng)與WT-ARDS： Tg-ARDS所得結(jié)果交叉對比

圖3 不同濃度LPS腹腔注射12 h后小鼠肺組織以病理變化(HE×20)

和查閱文獻(xiàn)共得到6個在小鼠ARDS中與Sirt1相互作用的基因，見表1。其中促炎基因4個，分別為Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，WT-ARDS：Tg-ARDS上述4個基因表達(dá)上調(diào)；抗炎基因2個，為Hivep3和Lpar1，WT-ARDS：Tg-ARDS上述兩個基因表達(dá)下調(diào)，具體差異倍數(shù)見表1“FC (abs) WT-ARDS：Tg-ARDS”列。

表1 小鼠ARDS炎癥損傷中與Sirt1相互作用的基因

討 論

ARDS是由肺內(nèi)外各種致病因素引起的，以頑固性低氧血癥為特征的臨床綜合征[5-6]。ARDS病因繁多，不同病因所致急性呼吸窘迫綜合征發(fā)病機(jī)制也各有不同，其中肺炎是引起直接肺損傷的最常見原因[7-8]，而不可控的肺內(nèi)炎癥、內(nèi)皮和上皮細(xì)胞損傷是ARDS 發(fā)生發(fā)展的重要部分[9]。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是參與重癥肺炎患者進(jìn)展為ARDS的重要分子，也是實(shí)驗(yàn)中常用制備ARDS動物模型的試劑[10]。Sirt1廣泛分布于人體各種組織器官，參與炎癥、細(xì)胞凋亡/增殖、細(xì)胞分化/衰老、新陳代謝和細(xì)胞周期調(diào)控等多種生理病理過程[11]。組織病理學(xué)提示AC-Res處理顯著減少中性粒細(xì)胞從血管到肺泡的滲漏，而AC-Res除了調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)外，還影響參與炎癥發(fā)病機(jī)制的酶和介質(zhì)的活化[12]。但Sirt1參與ARDS發(fā)生發(fā)展的機(jī)制目前仍待探索，Sirt1在小鼠ARDS中相互作用的分子也未有較全面的報道。

本實(shí)驗(yàn)所用Sirt1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠來自Jackson實(shí)驗(yàn)室[13]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種小鼠在經(jīng)不同劑量的LPS腹腔注射12 h后，Tg小鼠的肺組織損傷程度均較WT小鼠輕；且LPS 15 mg/kg腹腔注射12 h后，T g小鼠炎癥因子IL-6的表達(dá)水平也明顯低于WT小鼠。證明Sirt1能減輕ARDS小鼠的炎癥反應(yīng)。通過對基因芯片的數(shù)據(jù)聚類分析和查閱文獻(xiàn)共得到6個在小鼠ARDS中與Sirt1相互作用的基因。其中促炎基因4個，分別為Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1，WT-ARDS：Tg-ARDS以上4個基因表達(dá)上調(diào)，即這些基因在WT-ARDS中的表達(dá)高于Tg-ARDS；其中抗炎基因2個，為Hivep3和Lpar1，WT-ARDS：Tg-ARDS以上2個基因表達(dá)下調(diào)，即這些基因在WT-ARDS中的表達(dá)低于Tg-ARDS。泛素D(ubiquitin D, Ubd)、泛素偶聯(lián)酶E2D2B(ubiquitin-conjugating enzyme E2D2B, Ube2d2b)、嗅覺素-4(olfactomedin-4, Olfm4)、白細(xì)胞介素-1受體1(interleukin-1 receptor-like 1, Il1rl1)、轉(zhuǎn)錄因子HIVEP3(transcription factor HIVEP3)均與NF-κB通路密切相關(guān)：Ubd通過促進(jìn)蛋白酶體降解泛素化的IκBα，參與調(diào)控LPS介導(dǎo)的NF-κB的活化[14-15]；Ube2d2b參與NFκBIα的降解；Olfm4通過NOD1和NOD2介導(dǎo)的NF-κB激活和隨后的細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生在幽門螺桿菌感染的宿主防御中發(fā)揮重要作用[16]；NF-κB參與調(diào)節(jié)粒細(xì)胞集落刺激因子引起的Olfm4的表達(dá)，在早期骨髓發(fā)育中起重要作用[17]。Il1rl1是IL-33的受體，IL-33是一種促炎癥因子，可以通過細(xì)胞膜表面的ST2及相關(guān)信號傳導(dǎo)蛋白Acp受體復(fù)合物，將活化信號傳遞到胞內(nèi)，經(jīng)過一系列的信號傳遞，激活NF-κB[18]和MAPK等，誘導(dǎo)效應(yīng)因子IL-5等的釋放，起到調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等的功能；此外IL-33能激活巨噬細(xì)胞，增加氣道炎癥反應(yīng)[19]。HIVEP3抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB激活作用顯著，能通過多種機(jī)制干預(yù)NF-κB[20-21]：作為一種轉(zhuǎn)錄因子，通過抑制 KκB基團(tuán)抑制核轉(zhuǎn)錄；通過非轉(zhuǎn)錄途徑-通過與TRAF2(一種腫瘤壞死因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的適配分子)協(xié)作抑制RELA的核異位，阻斷IKK復(fù)合體的形成。溶血磷脂酸受體1(lysophosphatidic acid receptor 1, Lpar1)是溶血磷脂酸 (LPA)的受體，LPA通過誘導(dǎo)趨化因子和脂質(zhì)介質(zhì)的釋放在肺炎癥中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)LPA能誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞中白細(xì)胞介素-8和前列腺素E2的分泌；LPA1的敲除或活性抑制對LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥有著顯著的保護(hù)作用[22]。因此，Sirt1可能是通過下調(diào)ARDS小鼠炎癥損傷中促炎基因Ubd，Ube2d2b，Olfm4，Il1rl1的表達(dá)和上調(diào)抗炎基因Hivep3和Lpar1的表達(dá)發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用，從而減輕ARDS小鼠的炎癥損傷。

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(本文編輯：王亞南)

劉俊彥，呂學(xué)軍，趙維，等. 基因芯片篩選Sirt1在小鼠急性呼吸窘迫綜合征炎癥損傷中相互作用的基因[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(2)： 168-172.

Screening of genes interacting with Sirt1 in inflammatory injury of acute respiratory distress syndrome in mice by gene chip

LiuJunyan,LyuXuejun,ZhaoWei,HuMingdong,LiYuying,WangGuansong,XuJiancheng,QianGuisheng.

Departmentofrespiratorymedicine,XinQiaoHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China

LiYuying,Email:lzhlyyhy@163.com

Objective To Screen of Sirt1 interacting genes in acute respiratory distress syndrome in mice by gene chip, and to provide a reference for exploring the mechanism of action of Sirt1 in acute respiratory distress syndrome. Methods Sirt1 overexpression (Tg) mice and wild type (WT) mice were bought for research, and the genotypes of newborn mice were identified after reproduction. The Sirt1 expression differences in lung tissue of Tg mice and WT mice were test by Western Blot. Construction of ARDS mouse model, the expression of IL-6 in lung tissue of two ARDS mice was detected by ELISA, and pathological changes in lung tissue of ARDS mice by HE staining were observed. Screening of Sirt1 interacting genes in acute respiratory distress syndrome in mice by gene chip. Results Two different genotypes of Tg and WT were identified by polymerase chain reaction (PCR). The expression of Sirt1 in lung tissue of mice which detecting by Western blot suggested that the Sirt1 in lung tissue of Tg mice was significantly higher than that of WT mice (P=0.001). Pathological changes of lung tissue of mice after intraperitoneal injection of LPS after LPS via HE staining prompted that with the increase of LPS dosage, the injury degree of lung tissue of two kinds of mice increased obviously, and the degree of lung injury in WT-ARDS mice was more serious than that of Tg-ARDS mice,and when the dosage of LPS reached 20 mg/kg, the survival rate of the two groups was <50%. Two kind of mice were injected intraperitoneally with LPS (15 mg/kg), The expression of IL-6 in lung tissue gradually increased with the passage of time,The expression of IL-6 in lung tissue of 3 h, 6 h,12 h, 24 h inWT-ARDS group was significantly higher than that in Tg-ARDS group(P<0.05), morever, the difference was the most significant especially in 12 h(P=0.007).Ubd, Ube2d2b, Olfm4, Il1rl1, Hivep3 and Lpar1 were identified as genes that interact with Sirt1 in mouse ARDS inflammatory lesions by gene chip screening. Conclusion Sirt1 may reduce the inflammatory damage in ARDS mice by regulating the expression of Ubd, Ube2d2b, Olfm4, Il1rl1, Hivep3 and Lpar1.

Acute respiratory distress syndrome; Sirtuin type 1; Ubiquitin D; Nuclear factor kappa B

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.011

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30770950)

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸內(nèi)科

李玉英， Email：zhlyyhy@163.com

R563

A

2017-02-08)