SIRT1減弱對脂多糖致急性呼吸窘迫綜合征小鼠的促炎作用

趙維 劉俊彥 李玉英

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·論著·

SIRT1減弱對脂多糖致急性呼吸窘迫綜合征小鼠的促炎作用

趙維1劉俊彥1李玉英2

目的探討SIRT1對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)小鼠炎癥反應(yīng)的作用及其機制。方法采用SIRT1基因敲減小鼠SIRT1+/-與野生型小鼠，qRT-PCR，Western Blot檢測兩種小鼠肺組織中的相關(guān)基因表達差異。兩種小鼠用LPS腹腔注射法造模，同時設(shè)生理鹽水對照組，觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，測定肺濕干比(W/D比)，BCA法測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中總蛋白濃度，ELISA法測定BALF及血漿中炎癥因子TNF-α、IL-6的含量，Western Blot檢測肺組織p-p38MAPK、p38MAPK、p-ATF2的表達變化。結(jié)果與野生型小鼠相比，SIRT1+/-肺組織中SIRT1在mRNA表達和蛋白表達均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。LPS致ARDS后，兩種小鼠病理形態(tài)學(xué)觀察均表現(xiàn)為肺組織炎癥細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)水腫，肺泡間隔增厚，而SIRT1+/-小鼠肺組織破壞更嚴(yán)重。在SIRT1+/-小鼠中，肺W/D比值，BALF中總蛋白濃度，BALF及血漿中炎癥因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)的含量，均明顯高于野生型小鼠(P<0.05)，肺組織p-p38MAPK/p38MAPK、p-ATF2的表達增加也更顯著(P<0.05)。結(jié)論SIRT1基因在LPS致傷ARDS小鼠的炎癥進程中起著非常重要的作用，其機制可能與Sirt1誘導(dǎo)的p38 MAPK-p-ATF2信號通路的活化增強有關(guān)。

急性呼吸窘迫綜合征； SIRT1； p38 MAPK； p-ATF2

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS) 作為急、危重癥，臨床表現(xiàn)為機體受到直接或間接肺損傷后發(fā)生的快速性進行性呼吸衰竭，以蛋白質(zhì)滲漏和炎性細胞因子滲出為主要病理改變，炎癥失控是ARDS發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[1-2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2, Sir2)是在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的可調(diào)控細胞壽命的基因，去乙?；?(sirtuin, SIRT) 是與Sir2同源，并有相似生物學(xué)功能存在于哺乳動物細胞的基因，命名為SIRT1～SIRT7，其中，SIRT1最早在人類細胞發(fā)現(xiàn)并與Sir2同源性最高[3-4]。SIRT1是煙酰腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的組蛋白去乙?；?，通過對組蛋白和非組蛋白的去乙酰化作用，調(diào)控著衰老、應(yīng)激耐受、細胞凋亡、代謝等過程[5]。最近研究表明，SIRT1通過對核因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K) 等信號通路的調(diào)控，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展方面起著重要作用[6]。SIRT1對ARDS的炎癥反應(yīng)具有何種調(diào)節(jié)作用及其機制尚不清楚，本研究采用SIRT1基因缺失的小鼠，建立ARDS模型，評估其炎癥程度，探討SIRT1對ARDS炎癥的作用及其可能機制。

材料與方法

一、實驗材料

1. 實驗動物：8～10周齡健康SIRT1+/-小鼠(購自于The Jackson Laboratory)及同窩出生的野生小鼠(C57BL/6J)，體重20～25 g，均飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)SPF級實驗動物室，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進食進水，室內(nèi)溫度22～25 ℃，光照12 h。

2. 主要試劑： DNA提取擴增試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；PCR引物序列由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成；qRT-PCR試劑盒購自廣州復(fù)能基因；LPS購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Biosharp公司；小鼠TNF-α、IL-6 ELISA測定試劑盒購自安徽巧伊生物有限公司；兔抗鼠多克隆抗體SIRT1購自Abgent公司，兔抗鼠多克隆抗體p-p38MAPK、p38MAPK、p-ATF2購自Santa Cruz公司，兔抗鼠多克隆抗體β-actin、GAPDH購自中杉金橋公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

二、研究方法

1. ARDS模型建立：選取SIRT1+/-與野生型小鼠各5只，行qRT-PCR及Western Blot檢測肺組織SIRT1表達量。另各取20只小鼠，分為SIRT1+/-對照組，SIRT1+/-LPS模型組，野生型對照組，野生型LPS模型組，每組均10只小鼠，LPS模型組腹腔注射20 mg/kg LPS制備ARDS模型，對照組注射等體積的生理鹽水，造模后6 h處死，每組各取5只小鼠行肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察及肺濕/干重比(W/D)測定，另5只收集血漿及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)，行細胞因子水平及BALF中蛋白濃度測定，并取肺組織測定p-p38MAPK、p38MAPK、p-ATF2含量。

2. 標(biāo)本制備： 1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，行眼眶取血，立即以離心半徑8 cm，3 000 r/min離心3 min，取血漿凍存于-80 ℃待用。剪開小鼠頸部皮膚，使氣管暴露，靜脈留置針進行氣管插管，結(jié)扎固定后，用1 ml注射器抽取0.8 ml 0.9%生理鹽水進行肺泡灌洗，反復(fù)注入回收3次后，收集肺泡灌洗液，超過80%回收率為回收成功，重復(fù)三次。BALF于4 ℃，以離心半徑8 cm，3 000 r/min離心10 min，取上清液置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3. 基因型鑒定： 剪小鼠尾，用組織裂解液及蛋白酶K提取出基因組DNA，行PCR反應(yīng)，將擴增后的產(chǎn)物電泳，進行基因型鑒定。用于PCR的引物序列由The Jackson Laboratory提供，Wild type Reverse：5′-TCG GAG GTA GAG GCA AAA TTC-3′；Mutant Reverse：5′-ATT TGG TAG GGA CCC AAA GG-3′；Common：5′-CTG ATG TAG GCC AGG CTC TC-3′。鑒定結(jié)果判定： 僅出現(xiàn)460 bp條帶的為SIRT1+/-純合子小鼠，僅有319 bp條帶的為野生型小鼠，SIRT1+/-雜合子小鼠表現(xiàn)為460 bp和319 bp兩條條帶。

4. qRT-PCR檢測：取肺組織，用Trizol提取總RNA，各組小鼠取等量總RNA，運用SYBR GreenI染料法，按照All-in-OneTMqPCR試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，利用特定的SIRT1引物序列對逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA進行熒光定量PCR反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCT的方法計算SIRT1 mRNA相對表達量。

5. Western Blot檢測： 在肺組織中加入100︰1的RIPA裂解緩沖液及PMSF，用勻漿器粉碎，置于冰上30 min后離心，提取上清液。BCA法測定所提取蛋白的濃度，加入上樣緩沖液于蛋白樣品中，沸水煮5 min使蛋白變性。配制SDS-PAGE凝膠(8%分離膠，5%濃縮膠)，電泳分離蛋白，根據(jù)目的蛋白分子量切膠，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1～2 h。加入一抗SIRT1、p-p38MAPK、p38MAPK、p-ATF2、β-actin、GAPDH多克隆抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3×10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜。膜上滴加ECL發(fā)光液，于凝膠成像儀中進行顯影，分析并計算條帶的灰度值。

6. 肺組織形態(tài)學(xué)觀察： 小鼠左肺組織，用4%多聚甲醛固定72 h后，行浸蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、封片處理，在光鏡下觀察。

7. 肺W/D比測定： 取小鼠右肺組織，濾紙吸盡肺表面的液體，稱取濕重，65 ℃溫箱中烘干72 h至恒重后，稱取干重，得到濕/干比。

8. BALF蛋白濃度測定： 取BALF上清液，按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒操作，檢測其蛋白含量。

9. ELISA法測定細胞因子水平： 按照ELISA測定試劑盒步驟，測定血漿和BALF上清液中炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的含量。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、SIRT1+/-小鼠的基因型鑒定

SIRT1+/-純合子敲除小鼠在出生后不久即死亡，用于實驗的均為SIRT1+/-雜合子敲減小鼠，表現(xiàn)為460 bp和319 bp兩條條帶，野生型小鼠僅有319 bp條帶，見圖1。

圖1 SIRT1+/-小鼠的基因型鑒定結(jié)果

二、SIRT1在肺組織中的表達情況

用qRT-PCR及Western Blot檢測SIRT1在肺組織中的mRNA水平及蛋白水平的表達情況，HET小鼠較WT小鼠表達均顯著降低，見圖2。

圖2 SIRT1在HET小鼠與WT小鼠肺組織中的表達情況；注：A：qRT-PCR分析結(jié)果，SIRT1mRNA在肺組織中的相對表達量；B：Western Blot分析結(jié)果，SIRT1蛋白在肺組織中的相對表達量。(*P<0.01，n=5)

三、小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化

LPS未處理時，兩種小鼠的肺部結(jié)構(gòu)無明顯差異，LPS處理后，兩種小鼠均可見肺泡腔中紅細胞和白細胞浸潤，血管充血，間質(zhì)水腫明顯，肺泡間隔明顯增厚，肺泡結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，而HET小鼠比WT小鼠炎癥改變更顯著，見圖3。

圖3 肺組織病理學(xué)變化；注：A：WT對照組(×400)；B：HET對照組(×400)；C：WT+LPS模型組(×400)；D：HET+LPS模型組(×400)

四、各組小鼠肺組織W/D比和BALF中總蛋白濃度的改變

LPS處理致ARDS后，毛細血管通透性改變，蛋白滲出到肺泡腔，肺間質(zhì)水腫，小鼠肺組織W/D和BALF中蛋白濃度均增加，但HET小鼠比WT小鼠增加更顯著，見表1。

表1 肺組織W/D比和BALF中的總蛋白濃度

五、各組小鼠BALF和血漿炎性因子濃度的測定

ARDS發(fā)生時，肺內(nèi)及血液中的炎性細胞大量活化并釋放炎癥因子如TNF-α、IL-6，引起炎癥失控級聯(lián)反應(yīng)。WT小鼠與HET小鼠在LPS處理后BALF及血漿中的TNF-α、IL-6均升高，HET小鼠升高更顯著，見表2。

六、各組小鼠肺組織中p-P38 MAPK/P38 MAPK、p-ATF2的表達差異

LPS處理后，HET小鼠與WT小鼠肺組織中p-P38 MAPK/P38 MAPK、p-ATF2的表達均比對照組增加，HET小鼠增加更明顯，見圖4。

討 論

SIRT1作為關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)因子，通過對組蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB，轉(zhuǎn)錄激活因子(activating transcription factor, ATF)的去乙?；饔谜{(diào)控著炎癥反應(yīng)，繼而引起免疫、代謝、線粒體生物功能等機體其它系統(tǒng)的改變。SIRT1可以抑制炎癥因子的轉(zhuǎn)錄及活化，但SIRT1的持續(xù)增高則會導(dǎo)致免疫抑制及死亡率增高，因此SIRT1對炎癥的影響是一把雙刃劍，在不同的機體環(huán)境、作用點及時間、作用靶點情況下，SIRT1對炎癥的調(diào)控作用也會不一[7-8]。Shinozaki 等[9]發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)毒素血癥、帕金森病的動物模型中，SIRT1使p53、p65的乙?；癄顟B(tài)增加，激活NF-κB與p53靶基因的活性，在很多炎性疾病和年齡相關(guān)性疾病中起著促炎作用。Rajendrasozhan等[10]發(fā)現(xiàn)吸煙者和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)患者相對于不吸煙者，其肺巨噬細胞及肺組織中，SIRT1的含量降低，在用香煙提取物處理人單核巨噬細胞的實驗中，也發(fā)現(xiàn)SIRT1下降導(dǎo)致RelA/p65 NF-κB乙?；缴撸琒IRT1的突變或敲除也使核RelA/p65增高及IL-8釋放，而過表達的SIRT1則會降低IL-8的釋放。ARDS是以炎癥失控級聯(lián)反應(yīng)為特征的疾病，SIRT1對ARDS的炎癥反應(yīng)起著何種調(diào)控作用及其機制尚不清楚。

圖4 肺組織中p-P38 MAPK/P38 MAPK、p-ATF2的表達差異 (*P<0.05vscontrol，#P<0.05vsWT，n=5)

表2 炎性因子TNF-α、IL-6在BALF和血漿中的濃度

注：aP<0.05vscontrol，bP<0.05vsWT

本實驗利用不同SIRT1基因型的小鼠，探討在SIRT1表達差異的基礎(chǔ)上，ARDS疾病發(fā)生發(fā)展的變化，發(fā)現(xiàn)LPS致ARDS時，SIRT1+/-小鼠比野生型小鼠肺損傷更嚴(yán)重。LPS腹腔注射6 h后，兩種小鼠病理檢查均表現(xiàn)為肺組織炎癥細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)水腫，肺泡間隔增厚，SIRT1+/-小鼠比WT小鼠對肺結(jié)構(gòu)的破壞更嚴(yán)重。LPS造模后，肺W/D比值加大，BALF中的蛋白濃度增加，BALF及血漿中的炎性因子TNF-α、IL-6均增高，而SIRT1+/-小鼠比野生型小鼠改變更顯著。結(jié)果表明，在LPS致ARDS的小鼠中，SIRT1+/-小鼠與野生型小鼠相比，更易引起肺損傷，且炎癥程度更嚴(yán)重，SIRT1減弱對ARDS的炎癥反應(yīng)有著促進作用。

MAPKs調(diào)控著一系列生理功能，包括ERKs、c-JNKs、p38 MAPKs三個特征性的亞家族，其中p38 MAPKs作為炎癥細胞因子表達的重要調(diào)節(jié)者[11]。近年來，p38 MAPK在內(nèi)毒素損傷中的作用備受關(guān)注。p38 MAPK的活化是保守的三級酶促級聯(lián)反應(yīng)，LPS刺激時，LPS與巨噬細胞表面的Toll 樣受體4( toll-like receptor 4, TLR4)結(jié)合，在MKK3(MAP kinase kinase 3)/MKK6的作用下，鄰近的酪氨酸和絲氨酸被磷酸化，p38 MAPK被激活，移位入細胞核或核膜周圍，將靶蛋白磷酸化，誘導(dǎo)效應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄，對炎癥因子的產(chǎn)生如TNF-α、IL-6進行著調(diào)控[12-14]。p38 MAPK作用的下游因子有ATF-2、c-jun、c-fos 等，其中ATF-2是 p38 MAPK 的主要底物[15]。本實驗發(fā)現(xiàn)不同SIRT1基因型的小鼠在LPS處理后，肺組織中p-p38 MAPK/p38 MAPK，p-ATF-2表達均增高，其中SIRT1+/-小鼠比WT小鼠增加更顯著，提示SIRT1減弱小鼠在LPS作用下，導(dǎo)致更嚴(yán)重的肺損傷，可能與增強了p38 MAPK-p-ATF2信號通路的活化有關(guān)。

綜上所述，本實驗表明SIRT1減弱對LPS致ARDS的炎癥反應(yīng)起著促進作用，這一過程可能與p38 MAPK-p-ATF-2信號通路的活化增強有關(guān)，對SIRT1基因的深入研究，將為內(nèi)毒素所致ARDS的防治提供新的方向。

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(本文編輯：黃紅稷)

趙維，劉俊彥，李玉英. SIRT1減弱對脂多糖致急性呼吸窘迫綜合征小鼠的促炎作用[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(2)： 163-167.

Effect of SIRT1 weakening on inflammation in mice with acute respiratory distress syndrome induced by lipopolysaccharide

ZhaoWei1,LiuJunyan1,LiYuying2.

1DepartmentofRespiration,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China;2DepartmentofRespiration,NavyGeneralHospitalPLAChina,Beijing100048,China

LiYuying,Email:lzhlyyhy@163.com

Objective To investigate the effect and mechanism of SIRT1 on inflammation in acute respiratory distress syndrome (ARDS) mice induced by lipopolysaccharide(LPS) . Methods The differences of related gene expression of lung tissues in two mice, including the SIRT1+/-mice with SIRT1 gene is knocked down and the wild-type mice, were detected by qRT-PCR and Western Blot. Then the ARDS model was induced in two kinds of mice by intraperitoneal injection of LPS, and the control group were injected with equal volume of saline. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining and the lung W/D ratio were calculated, the total protein concentration in BALF were detected by BCA, the levels of inflammatory factor tumour necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-6(IL-6) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) and plasma were tested by ELISA, the expression of p38 MAPK, p-p38 MAPK and p-ATF2 in lung tissue were detected by Western Blot. Results Compared with wild-type mice, the mRNA and protein expression of SIRT1 in lung tissue in SIRT1+/-were significantly decreased, The difference was statistically significant(P<0.01). After ARDS induced by LPS, The pathological observation about two kinds of mice both showed infiltration of inflammatory cells in lung tissue, destruction of alveolar structure, edema of interstitial, thickening of alveolar septum, and SIRT1+/-mice were more severely damaged than wild-type mice. In SIRT1+/-mice, lung W/D ratio, total protein concentration in BALF, the levels of inflammatory factors TNF-α and IL-6 in BALF and plasma were significantly increased(P<0.05), the expression of p-p38 MAPK/p38 MAPK and p-ATF2 in lung tissues were increased more significantly than in wild-type mice(P<0.05). Conclusion The SIRT1 gene plays an important role in the inflammatory process of mice with ARDS induced by LPS, which may be related to the increased activity of p38 MAPK-p-ATF2 signaling pathway.

Acute respiratory distress syndrome; SIRT1; p38 MAPK; p-ATF2

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.02.010

國家自然科學(xué)基金資助項目(81370167)

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸內(nèi)科1100048 北京，中國人民解放軍海軍總醫(yī)院呼吸內(nèi)科2

李玉英， Email: lzhlyyhy@163.com

文獻標(biāo)識碼： A

2017-01-08)