小體積液液萃取-GC/MS/MS法檢驗(yàn)血中非那西丁

朱 昱楊 亮宋 輝

（1 中國(guó)刑事警察學(xué)院法化學(xué)系 遼寧 沈陽(yáng) 110035；2 成都市公安局青羊區(qū)分局 四川 成都 610013）

小體積液液萃取-GC/MS/MS法檢驗(yàn)血中非那西丁

朱 昱1楊 亮2宋 輝1

（1 中國(guó)刑事警察學(xué)院法化學(xué)系 遼寧 沈陽(yáng) 110035；2 成都市公安局青羊區(qū)分局 四川 成都 610013）

建立血中非那西丁的小體積液液萃取-GC/MS/MS分析檢驗(yàn)方法。血樣中的非那西丁用小體積的環(huán)己烷萃取后，采用GC/MS/MS方法進(jìn)行定性和定量分析。方法的樣品萃取率為83.2%，檢出限（LOD）為11.5ng/mL，定量限（LOQ）為38.5ng/mL，RSD為5.6%；平均相對(duì)回收率為98.9%。所建立的方法集分析物的提取和富集于一體，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，專屬性強(qiáng)，為中毒案件中血中非那西丁的檢驗(yàn)提供了可靠的方法。

非那西丁 氣相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用 血

1 引言

非那西丁屬乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛劑，通常與其他藥物配成復(fù)方制劑，是去痛片和消炎痛的組分之一。此外，非那西丁還作為毒品添加成分。近年來(lái)，服用去痛片自殺和去痛片過(guò)量服用造成用藥者中毒的案件時(shí)有發(fā)生。非那西丁是去痛片的主要成分之一，在此類中毒案件中，常需要進(jìn)行中毒者血中非那西丁的檢測(cè)。

目前，血樣中非那西丁的GC/MS法分析，國(guó)外主要采用衍生化-GC/CIMS分析方法[1-2]分析血漿中的非那西丁，操作較為復(fù)雜；國(guó)內(nèi)GC/MS法檢測(cè)血中非那西丁曾有報(bào)道采用總離子流一級(jí)質(zhì)譜定性分析和選擇離子（SIM）掃描外標(biāo)法定量分析血中去痛片成分[3]，或采用七氟丁酰氯（HFBC）衍生化-GC/MS/MS法分析血中非那西丁[4]。本論文在借鑒國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道的基礎(chǔ)上，研究建立了血中非那西丁的小體積液液萃取-GC/MS/MS分析方法。所建立的方法集分析物的提取和富集于一體，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，專屬性強(qiáng)，滿足非那西丁中毒血樣檢驗(yàn)鑒定的要求。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑

非那西丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取非那西丁(對(duì)照品，購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)，用甲醇配制成1.0mg/mL溶液。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取SKF525A（購(gòu)自Sigma公司，純度≥95.0%），用甲醇配制成1.0mg/mL溶液。

pH10.8碳酸鹽緩沖溶液：稱取無(wú)水碳酸鈉53.0g，碳酸氫鈉42.0g，加水定容至500mL。

環(huán)己烷、氯化鈉，均為分析純。

空白血為近期未服藥的健康人血。

2.2 儀器及條件

Thermo-Finnigan PolarisQ氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀。

GC條件：HP-5ms 熔融石英毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm i.d. ×0.25μm），柱溫：初始溫度60℃，保持1min，升溫速率20℃/min，至280℃恒溫10min；氣化溫度280℃；載氣：He，流量1min/mL；不分流進(jìn)樣。

MS條件：EI電離源，電子束能量70eV，離子源溫度200℃；AGC自動(dòng)增益控制，倍增器電壓1350V；傳輸線溫度280℃；一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜SRM全掃描方式檢測(cè)（具體條件見(jiàn)下表）。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

取血樣5mL，加入內(nèi)標(biāo)SKF525A標(biāo)準(zhǔn)溶液5μL，混勻；加入1.5g氯化鈉至飽和，再加入1mL的pH10.8緩沖溶液，渦旋1min；加0.5mL環(huán)己烷，渦旋1min，振蕩混勻，10000r/min離心3min，取上層有機(jī)相1μL進(jìn)樣，按2.2儀器條件進(jìn)行GC/MS/MS分析，測(cè)定非那西丁和內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜總離子流（TIC）色譜和質(zhì)譜。根據(jù)特征母離子的二級(jí)質(zhì)譜特征離子及其質(zhì)量色譜的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜SRM色譜峰面積采用內(nèi)標(biāo)曲線法進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 總離子流色譜（TIC）和質(zhì)譜

3.1.1 非那西丁和內(nèi)標(biāo)SKF525A的一級(jí)質(zhì)譜MS1和二級(jí)質(zhì)譜MS2

取非那西丁和內(nèi)標(biāo)SKF525A標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.2儀器條件進(jìn)行GC/MS和GC/MS/MS分析，采集總離子流色譜、一級(jí)質(zhì)譜（MS1）和二級(jí)質(zhì)譜（MS2，母離子為一級(jí)質(zhì)譜的基峰）。非那西丁和內(nèi)標(biāo)SKF525A的TIC色譜峰保留時(shí)間（tR）分別為8.99min和12.08min。其MS1和MS2質(zhì)譜如圖1、圖2所示，MS2質(zhì)譜特征子離子如下表所示。

表 一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜SRM全掃描檢測(cè)條件和特征離子

3.1.2 空白添加血樣的GC/MS/MS總離子流色譜

取空白血樣5mL，添加非那西丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和SKF525A標(biāo)準(zhǔn)溶液各5μL，按2.3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和GC/MS/MS分析，其SRM二級(jí)質(zhì)譜的TIC色譜如圖3所示?？梢?jiàn)非那西丁和內(nèi)標(biāo)SKF525A的GC/ MS/MS色譜峰分離良好且互不干擾。

圖1 非那西丁和內(nèi)標(biāo)的MS1質(zhì)譜

圖2 非那西丁和內(nèi)標(biāo)的MS2質(zhì)譜

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

對(duì)于GC/MS/MS分析來(lái)說(shuō)，較為理想的內(nèi)標(biāo)應(yīng)是分析物的氘代物。因此，國(guó)外已有的GC/MS法定量分析血中非那西丁的文獻(xiàn)中均采用氘代物做內(nèi)標(biāo)。但國(guó)內(nèi)氘代物來(lái)源較困難，且價(jià)格昂貴，分析成本較高。因此，本文選擇國(guó)內(nèi)公安毒物分析領(lǐng)域中定量分析堿性藥毒物常用的SKF525A做內(nèi)標(biāo)。

圖3 空白添加血樣的SRM二級(jí)質(zhì)譜TIC色譜

3.3 氣相色譜/質(zhì)譜分析方式的選擇

在GC/MS一級(jí)質(zhì)譜全掃描方式檢測(cè)總離子流色譜中，血樣基體的響應(yīng)信號(hào)高，內(nèi)源性雜質(zhì)干擾較大，非那西丁色譜峰的信噪比較低，導(dǎo)致靈敏度降低，雖然采用選擇離子檢測(cè)（SIM）方式，可降低背景噪聲，提高靈敏度，但會(huì)降低質(zhì)譜的特異性，使定性的準(zhǔn)確性和可靠性下降。而在GC/MS/ MS總離子流色譜中，采用二級(jí)質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）檢測(cè)方式，可最大程度上消除了檢材基體和內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，顯著提高了檢測(cè)靈敏度；同時(shí)由于SRM子母離子相互配合印證，避免了一級(jí)質(zhì)譜SIM檢測(cè)方式的定性特異性差、抗干擾能力不強(qiáng)等缺點(diǎn)。因此，本文利用SRM監(jiān)測(cè)技術(shù)，以非那西丁一級(jí)質(zhì)譜的基峰特征離子作為母離子，根據(jù)其二級(jí)質(zhì)譜的特征子離子進(jìn)行定性分析；利用二級(jí)質(zhì)譜的SRM色譜峰面積進(jìn)行定量分析。

3.4 萃取方法、萃取溶劑和萃取率

本文采用小體積液-液萃取方法對(duì)血中的非那西丁進(jìn)行提取。在萃取時(shí)，采用0.5mL環(huán)己烷萃取5mL血中的非那西丁，使非那西丁由大體積（5mL）的水基質(zhì)血樣中轉(zhuǎn)移到小體積（0.5mL）的環(huán)己烷有機(jī)相中，集分析物的提取與富集于一體，不需對(duì)萃取液進(jìn)行濃縮。既簡(jiǎn)化了操作，又避免了萃取液濃縮所造成的分析物的損失。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)乙醚、環(huán)己烷、苯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯作為萃取溶劑分別進(jìn)行了考察。結(jié)果表明乙酸乙酯、三氯甲烷的萃取率較高，分別為89.1%和88.3%，乙醚、環(huán)己烷、苯、二氯甲烷的萃取率接近分別為83.1%、83.2%、84.1%和83.8%，但乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、苯萃取時(shí)較易乳化，乙醚則揮發(fā)性太強(qiáng)，萃取時(shí)由于溶劑體積小而容易揮干而分取困難，另外三氯甲烷和二氯甲烷萃取液位于水基質(zhì)血樣下層，不便分取。因此，選擇環(huán)己烷作為小體積萃取的溶劑。

實(shí)驗(yàn)中在血樣中加入氯化鈉至飽和，使水基質(zhì)血樣和萃取劑有機(jī)相之間的比重差加大，有效地消除了萃取過(guò)程中的乳化現(xiàn)象。

在空白血中加入1.0μg/mL的非那西丁，進(jìn)行萃取率測(cè)定試驗(yàn)，根據(jù)經(jīng)萃取和未經(jīng)萃取樣品所測(cè)得的非那西丁與內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜SRM色譜峰面積比，計(jì)算非那西丁萃取率。結(jié)果測(cè)得非那西丁的平均萃取率E%=均值±SD=83.2%±5.5%（n=5）。

3.5 檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

本方法以非那西丁GC/MS/MS色譜峰信噪比為3時(shí)的信號(hào)值所對(duì)應(yīng)的血樣中非那西丁濃度為檢出限（limit of detection，LOD），以非那西丁色譜峰信噪比為10時(shí)的信號(hào)值所對(duì)應(yīng)的非那西丁濃度為定量限（limit of quantitation，LOQ）。 結(jié)果測(cè)得血樣中非那西丁的LOD為11.5ng/mL，LOQ為38.5ng/mL。

3.6 內(nèi)標(biāo)工作曲線

取5mL空白血若干份，制備不同濃度（0.05、0.25、1.0、5.0、10和50μg/mL）的非那西丁空白血添加系列，分別加內(nèi)標(biāo)SKF525A各1μg，按2.3方法進(jìn)行GC/MS/MS分析。以非那西丁的添加濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，非那西丁與內(nèi)標(biāo)SKF525A的二級(jí)質(zhì)譜SRM色譜峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得內(nèi)標(biāo)工作曲線方程為y=0.3559x-0.0084，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，呈良好的線性關(guān)系，線性范圍0.05~50μg/mL。

3.7 準(zhǔn)確性和精密度

取空白血制備非那西丁濃度為1.0μg/mL的添加血樣，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)定相對(duì)回收率，計(jì)算平均相對(duì)回收率和RSD（n=5），結(jié)果血中非那西丁的平均相對(duì)回收率為98.9%，平均RSD為5.6%。

3.8 方法的專屬性

取空白血樣，按2.3實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和GC/MS/MS分析。結(jié)果表明，空白血的內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾分析物的測(cè)定。

4 服藥自愿者血樣檢測(cè)

一健康男性，25歲，口服治療量去痛片2小時(shí)后采集血液，用本文方法測(cè)定血樣中非那西丁濃度為3.1μg/mL。表明本方法滿足司法檢驗(yàn)鑒定的要求。

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（責(zé)任編輯：孟凡騫）

R991；O657.63

A

2095-7939(2017)02-0100-03

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.02.020

2016-11-29

朱昱（1964-），男，遼寧沈陽(yáng)人，中國(guó)刑事警察學(xué)院法化學(xué)系教授，主要從事毒物毒品分析研究。