酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法的硅藻檢驗(yàn)

姚建，闞衛(wèi)軍

（南通市公安局物證鑒定所，江蘇南通 226007）

·技術(shù)與應(yīng)用·

酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法的硅藻檢驗(yàn)

姚建，闞衛(wèi)軍

（南通市公安局物證鑒定所，江蘇南通 226007）

目的采用酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法對(duì)溺死尸體的器官進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)，并評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。方法收集40例本地區(qū)確證為溺死的尸體，每例提取肺、肝、腎組織及現(xiàn)場(chǎng)水樣，分別采用強(qiáng)酸消化法、酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法、酶消化法對(duì)組織樣本進(jìn)行硅藻檢驗(yàn)，從消化時(shí)間、消化能力、硅藻檢出率等方面進(jìn)行比較分析。結(jié)果在消化時(shí)間、消化能力方面，酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法明顯優(yōu)于酶消化法；在硅藻檢出率方面，酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法明顯優(yōu)于強(qiáng)酸消化法。結(jié)論酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法結(jié)合了強(qiáng)酸消化法和酶消化法的優(yōu)點(diǎn)，并且操作安全，環(huán)境污染小，具有一定的推廣和實(shí)踐價(jià)值。

法醫(yī)病理學(xué)；溺死；硅藻；強(qiáng)酸消化法；酶消化法

在法醫(yī)檢案實(shí)踐中，時(shí)常會(huì)遇到溺死尸體器官的硅藻檢驗(yàn)。硅藻檢驗(yàn)的方法很多，傳統(tǒng)方法有強(qiáng)酸消化法、酶消化法、浸漬法、硅膠梯度離心法、焚灼法等[1，2]，近年來(lái)又相繼研發(fā)出多種新方法，如DNA檢測(cè)法[3]、微波消解-掃描電鏡法[4]、微束X射線熒光光譜技術(shù)[5，6]。其中強(qiáng)酸消化法、酶消化法較具代表性，是目前國(guó)內(nèi)實(shí)際檢案中的標(biāo)準(zhǔn)方法和常用方法，適合基層實(shí)際辦案需要。梁新華等[7]曾對(duì)強(qiáng)酸消化法和胰蛋白酶消化法檢驗(yàn)腐敗器官硅藻進(jìn)行了比較研究，結(jié)果顯示強(qiáng)酸消化法的消化時(shí)間、消化能力明顯優(yōu)于胰蛋白酶消化法，而強(qiáng)酸消化法的硅藻檢出率低于胰蛋白酶消化法。本研究在梁新華等研究的基礎(chǔ)上，采用酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法檢驗(yàn)器官硅藻，同時(shí)與強(qiáng)酸消化法、酶消化法在消化時(shí)間、消化能力和硅藻檢出率等方面進(jìn)行比較，旨在能找到一種簡(jiǎn)單、科學(xué)、安全并且適合基層應(yīng)用的硅藻檢驗(yàn)新方法。

1 材料與方法

1.1 樣本

收集本地區(qū)確證為溺死的尸體40例，尸體解剖時(shí)分別提取肺、肝、腎組織，并提取每例案件的現(xiàn)場(chǎng)水樣。

1.2 試劑和儀器

蛋白酶K（德國(guó)Merck公司），發(fā)煙硝酸（上?；瘜W(xué)試劑研究所有限公司），0.01mol/L Tris-HCl緩沖液，蒸餾水。

YCX-1型水浴鍋（上海亮研智能科技有限公司），DHG-9070型恒溫箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），2-16P型離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司），HAKD-H型烘片機(jī)（北京恒奧德儀器儀表有限公司），20510型天平（寧波百諾科教設(shè)備有限公司），Axioskop 2plus型顯微鏡（德國(guó)蔡司公司）。

1.3 方法

1.3.1 取材

用蒸餾水充分清洗器官表面，提取被膜下的肺、肝、腎組織各3份，每份5 g，分別用于酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法、強(qiáng)酸消化法[8]、酶消化法[9]實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法操作步驟

（1）將所取組織用干凈剪刀充分剪碎后移入玻璃試管中；（2）向玻璃試管中加入0.01mol/L Tris-HCl緩沖液10m L，并加入蛋白酶K 0.2 g，置于56℃水浴鍋內(nèi)1h；（3）以離心半徑6cm，2500 r/min，離心10min，棄去上清液，加入發(fā)煙硝酸1m L，置于酒精燈上加熱，至溶液澄清透明；（4）以離心半徑6 cm，2 500 r/min，離心10min，棄去上清液，取沉淀均勻涂片烘干，置于顯微鏡下觀察。

1.3.3 消化時(shí)間實(shí)驗(yàn)

用強(qiáng)酸消化法、酶消化法、酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法分別消化5g肺、肝、腎組織，至溶液澄清透明為完全消化，記錄各自完全消化所需要的時(shí)間。

1.3.4 消化能力實(shí)驗(yàn)

用上述3種方法分別將5 g肺、肝、腎組織消化2h，稱(chēng)取消化后剩余固體殘?jiān)馁|(zhì)量。

1.3.5 硅藻檢出率實(shí)驗(yàn)

用上述3種方法分別消化5g肺、肝、腎組織，至溶液澄清透明，離心后棄去上清液，取沉淀涂片烘干，顯微鏡下觀察硅藻形態(tài)并計(jì)數(shù)。分別取40例的現(xiàn)場(chǎng)水樣各10mL，以離心半徑6cm，2500 r/min，離心10min，棄去上清液，取沉淀均勻涂片烘干，顯微鏡下觀察硅藻形態(tài)并計(jì)數(shù)。

1.3.6 硅藻檢測(cè)定量分級(jí)

按照整張載玻片檢見(jiàn)的硅藻數(shù)量對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)判：大量（++++），＞60個(gè)；中量（+++），30～60個(gè)；少量（++），10～30個(gè)；極少量（+），1～10個(gè)；未見(jiàn)（-），0個(gè)。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 消化時(shí)間的比較

3種消化法將5g肺、肝、腎組織完全消化所需要的時(shí)間見(jiàn)表1。結(jié)果表明，強(qiáng)酸消化法消化時(shí)間最短，酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法次之，酶消化法時(shí)間最長(zhǎng)。3種方法消化時(shí)間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 3種消化法對(duì)肺、肝、腎組織的消化時(shí)間比較（n=40，±s，min）

表1 3種消化法對(duì)肺、肝、腎組織的消化時(shí)間比較（n=40，±s，min）

注：1）與強(qiáng)酸消化法比較，P＜0.05；2）與酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法比較，P＜0.05

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2.2 消化能力的比較

3種消化法在規(guī)定的時(shí)間（2 h）內(nèi)將5 g肺、肝、腎組織消化后剩余的殘?jiān)|(zhì)量見(jiàn)表2。結(jié)果表明，強(qiáng)酸消化法消化能力最強(qiáng)，酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法次之，酶消化法最差。3種方法消化能力兩兩比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 3種消化法對(duì)肺、肝、腎組織消化后剩余殘?jiān)|(zhì)量的比較（n=40，±s，mg）

表2 3種消化法對(duì)肺、肝、腎組織消化后剩余殘?jiān)|(zhì)量的比較（n=40，±s，mg）

注：1）與強(qiáng)酸消化法比較，P＜0.05；2）與酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法比較，P＜0.05

2.3 硅藻檢出率的比較

2.3.1 3 種方法的硅藻檢驗(yàn)結(jié)果

3種方法對(duì)40例溺死尸體的肺、肝、腎組織硅藻檢驗(yàn)數(shù)量和硅藻檢出率見(jiàn)表3。結(jié)果表明，（1）強(qiáng)酸消化法在肺、肝、腎組織中檢出硅藻數(shù)量達(dá)中量以上的分別為17例（42.5%）、3例（7.5%）、2例（5.0%），酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法在肺、肝、腎組織中檢出硅藻數(shù)量達(dá)中量以上的分別為34例（85.0%）、12例（30.0%）、7例（17.5%），酶消化法在肺、肝、腎組織中檢出硅藻數(shù)量達(dá)中量以上的分別為36例（90.0%）、13例（32.5%）、9例（22.5%）；酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法檢出硅藻數(shù)量達(dá)中量以上的明顯多于強(qiáng)酸消化法。（2）肺、肝、腎組織中硅藻檢出率最高的是酶消化法，其次是酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法，最低的是強(qiáng)酸消化法。（3）肺、肝、腎3種組織中，肺的硅藻檢出率最高。

2.3.2 現(xiàn)場(chǎng)水樣的硅藻檢驗(yàn)結(jié)果

40例現(xiàn)場(chǎng)水樣中均檢出硅藻，其中硅藻檢出數(shù)量達(dá)大量的有36例，達(dá)中量的有3例，還有1例檢出極少量硅藻，該例現(xiàn)場(chǎng)水樣為井水。

表3 3種方法中各組織的硅藻檢驗(yàn)結(jié)果（N=40，例）

2.4 硅藻檢出種類(lèi)的比較

3種方法消化肺、肝、腎組織后檢出的硅藻種類(lèi)及現(xiàn)場(chǎng)水樣中檢出的硅藻種類(lèi)見(jiàn)表4。結(jié)果表明，強(qiáng)酸消化法檢出硅藻種類(lèi)較現(xiàn)場(chǎng)水樣少，酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法和酶消化法檢出的硅藻種類(lèi)與現(xiàn)場(chǎng)水樣基本一致。

表4 硅藻種類(lèi)檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐中，理想的硅藻檢驗(yàn)方法是操作簡(jiǎn)單、安全、環(huán)境污染小，所需設(shè)備和試劑經(jīng)濟(jì)、便宜，消化時(shí)間短，硅藻檢出率高。傳統(tǒng)方法中強(qiáng)酸消化法、酶消化法是目前國(guó)內(nèi)基層法醫(yī)檢驗(yàn)硅藻的主要方法，也是具有代表性的兩種硅藻檢驗(yàn)方法。梁新華等[7]通過(guò)對(duì)強(qiáng)酸消化法和胰蛋白酶消化法檢驗(yàn)器官硅藻的比較研究結(jié)果表明，強(qiáng)酸消化法消化時(shí)間短、消化能力強(qiáng)，但硅藻檢出率低，并且存在硝酸噴出會(huì)灼傷人體、反應(yīng)過(guò)程中釋放的二氧化氮會(huì)污染環(huán)境等缺點(diǎn)；胰蛋白酶消化法操作簡(jiǎn)單安全，所需設(shè)備少，對(duì)人體和環(huán)境造成的危害也較小，最重要的是硅藻檢出率較高，但此法消化所需時(shí)間較長(zhǎng)，不適合緊急案件的偵辦。

近幾年研發(fā)的硅藻檢驗(yàn)新方法有DNA檢測(cè)法、微波消解-掃描電鏡聯(lián)用法等，DNA檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)是具有極高的靈敏度和特異性，同時(shí)能排除腐敗菌的干擾；微波消解-掃描電鏡聯(lián)用法采用真空抽濾法富集硅藻，可最大程度避免硅藻損傷，提高了硅藻的回收率。但此兩種方法都存在操作復(fù)雜、所需儀器和試劑昂貴、對(duì)實(shí)驗(yàn)室清潔和操作過(guò)程中防污染的要求嚴(yán)格等問(wèn)題，目前條件下，該兩種方法在基層辦案單位中推廣應(yīng)用受到限制。

本研究對(duì)強(qiáng)酸消化法、酶消化法、酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法3種檢驗(yàn)方法分別進(jìn)行了消化時(shí)間、消化能力、硅藻檢出率等方面的比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在消化時(shí)間、消化能力上，酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法明顯優(yōu)于酶消化法；在硅藻檢出率上，酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法優(yōu)于強(qiáng)酸消化法；在檢出的硅藻種類(lèi)上，酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法多于強(qiáng)酸消化法。酶消化聯(lián)合強(qiáng)酸消化法是在酶前期對(duì)組織器官消化到一定程度的基礎(chǔ)上再加入少量的強(qiáng)酸聯(lián)合消化，該方法在消化過(guò)程中引入了破機(jī)能力強(qiáng)的強(qiáng)酸，與單純酶消化相比較，消化時(shí)間減少，消化能力增加，提高了辦案效率。由于該方法只加入少量的強(qiáng)酸，避免了強(qiáng)酸消化法中因使用大量強(qiáng)酸對(duì)耐酸性差的有機(jī)硅藻的破壞，提高了硅藻檢出率，同時(shí)也避免了使用大量強(qiáng)酸對(duì)操作者的危險(xiǎn)性和對(duì)環(huán)境的危害性。此法結(jié)合了強(qiáng)酸消化法和酶消化法的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)彌補(bǔ)了各自的不足，在實(shí)踐中既適合緊急案件的偵辦，也適合水體中硅藻含量低的案件檢驗(yàn)，有一定的推廣和實(shí)踐價(jià)值。

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[3]何方剛，劉良，黃代新，等.浮游生物16S rDNA檢測(cè)在大鼠溺死鑒定中的價(jià)值[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2006，21（6）：331-333.

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Diatom Detection Using Enzyme Combined w ith Strong Acid Digestion M ethod

YAO Jian,KAN Wei-jun
（Institute of Forensic Science,Nantong Public Security Bureau,Nantong 226007,China）

ObjectiveTo detect diatom in the organs of drowners by enzyme combined w ith strong acid digestion method,and evaluate its application value.MethodsA total of 40 cases which have been identified as drowning in local region were collected.Samples of the lung,liver,kidney,and the water of the scene were also gathered from each case.Strong acid digestion method,enzyme combined w ith strong acid digestion method,and enzymic digestion method were respectively performed to detect the diatom in the samples.The comparative analysis was made on digestion time,digestive power and detection rate of diatom,etc.ResultsEnzyme combined w ith strong acid digestion method was significantly better than enzym ic digestion method on digestion time and digestive power;enzyme combined w ith strong acid digestion method were obviously superior to strong acid digestion method on the detection rate of diatom.ConclusionEnzyme combined w ith strong acid digestion method combines the advantages of strong acid digestion method and enzymic digestion method.It has the characters of operation safety w ith little pollution to environment,which is worthy of further popularization and practice.

forensic pathology;drowning;diatom;strong acid digestionmethod;enzymatic digestionmethod

DF795.1

：A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.02.012

1004-5619（2017）02-0165-03

2016-05-13）

（本文編輯：張建華）

姚建（1981—），男，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)和法醫(yī)臨床學(xué)鑒定；E-mail：nantongyaojian@163.com