TUFT1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能研究

袁孔現(xiàn)，王繼年

(1.銅陵市人民醫(yī)院 藥劑科，安徽 銅陵 244002；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 教育處，安徽 合肥 230032)

TUFT1真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能研究

袁孔現(xiàn)1，王繼年2

(1.銅陵市人民醫(yī)院 藥劑科，安徽 銅陵 244002；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 教育處，安徽 合肥 230032)

設(shè)計(jì)合成引物，擴(kuò)增出TUFT1的CDS序列，雙酶切后連接到pEGFP-C2載體上，將過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞株中。結(jié)果顯示，過表達(dá)組細(xì)胞的增殖率，顯著高于空白組和對照組；過表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率，顯著低于空白組和對照組。成功構(gòu)建TUFT1的真核表達(dá)載體，并初步確定TUFT1可以明顯增強(qiáng)人胰腺癌細(xì)胞株的增殖，同時(shí)抑制其凋亡，為進(jìn)一步探索TUFT1基因功能、尋求治療胰腺癌的新途徑提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

TUFT1；轉(zhuǎn)染；增殖；凋亡

胰腺癌(PC)作為一種惡性程度非常高的消化系統(tǒng)腫瘤，具有發(fā)病隱匿、確診困難、侵襲性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移性高、手術(shù)效果差且術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，導(dǎo)致患者病死率居高不下，5年生存率也不容樂觀，有“癌癥之王”的惡稱，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1-4]，因此，對PC發(fā)病機(jī)制和治療策略的研究迫在眉睫。近些年來，基因工程技術(shù)快速發(fā)展，為醫(yī)學(xué)研究和疾病治療開辟了嶄新的道路[5]。TUFT1基因首次發(fā)現(xiàn)并克隆于牛的成釉細(xì)胞中，其開放閱讀框長度為1 170 bp，編碼一種由390個(gè)氨基酸殘基組成的、翻譯修飾前分子量約為44 kDa的親水性蛋白質(zhì)[6]，國外最新研究表明，TUFT1在胰腺癌組織中存在高表達(dá)現(xiàn)象，并提示其在胰腺癌的轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色[7]。本文以此為線索，通過構(gòu)建TUFT1的真核表達(dá)質(zhì)粒，國內(nèi)首次研究其對胰腺癌細(xì)胞系的增殖和凋亡的影響，為胰腺癌的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胰腺癌細(xì)胞系(Panc-1和BxPC-3)、pEGFP-C2載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。PrimeSTAR Max酶和DNA Marker均購于日本TaKaRa公司；Xho I、BamH I內(nèi)切酶和T4連接酶均購于加拿大Fermentas公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小抽試劑盒均購于美國Axygen公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購于上海貝博公司；Lip2000脂質(zhì)體購于Invitrogen公司；GFP抗體購于美國santa cruz公司；DMSO購于日本SIGMA公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)液和胎牛血清均購于Gibco公司；引物合成于上海生工生物。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

利用Primer軟件設(shè)計(jì)引物并送生物公司合成，引物序列如下：F-CCGCTCGAGCGGCATGAACGG GACGCGGAACT；R-CGGGATCCCGTCAGGTTT CCACCACT，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增人源TUFT1的CDS片段，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，在紫外分析儀中切取含有目的片段的凝膠，并用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，然后分別用限制性內(nèi)切酶(Xho I和BamH I)對純化產(chǎn)物和pEGFP-C2空載體進(jìn)行雙酶切(37 ℃，6 h)，然后用T4連接酶對以上酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接(16 ℃，12 h)，然后用感受態(tài)細(xì)胞(TG1或DH5a)對連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化并涂布至帶有卡那抗性的LB平板上倒置培養(yǎng)(37 ℃，10～16 h)，然后挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(37 ℃，250 rpm，10～16 h)，并用質(zhì)粒抽提試劑盒對菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，然后分別用Xho I和BamH I對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并將鑒定正確的質(zhì)粒送生物公司進(jìn)行測序。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

復(fù)蘇細(xì)胞后，用完全培養(yǎng)基(90%高糖DMEM+10%胎牛血清+雙抗)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為含有5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，根據(jù)細(xì)胞生長速度和狀態(tài)，及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞換液和細(xì)胞傳代，并以適當(dāng)密度重新接種至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至適當(dāng)密度(80%～90%)后，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟如下：分別將適量pEGFP-C2-TUFT1質(zhì)粒(5～10 μg)和Lip2000脂質(zhì)體(5～15 μL)加入至500 μL左右的Opti-MEM轉(zhuǎn)染液中，輕輕混勻后室溫靜置5 min，然后將二者溶液充分混勻后室溫靜置20 min，輕輕加入細(xì)胞中并補(bǔ)充適量無雙抗的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，4～6 h后更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

1.2.3 免疫印跡

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化細(xì)胞，低速離心收集細(xì)胞后用PBS清洗2～3次，然后加入適量細(xì)胞裂解液(RIPA，用前加入PMSF)，4 ℃混旋裂解5～10 min，然后高速低溫離心(4 ℃，14000 rpm/min)10～15 min，并收集適量的裂解上清，加入等量的SDS上樣緩沖液，混勻后沸水浴5～10 min，然后放置冰水中至冷卻，即得到蛋白樣品，取適量樣品進(jìn)行SDS-PAGE恒壓電泳(80～100 V)約2 h，然后進(jìn)行恒流電轉(zhuǎn)(200 mA)約2 h，即得到負(fù)載蛋白的PVDF膜，將膜進(jìn)行封閉(室溫，2 h)后依次孵育GFP一抗(4 ℃，12 h)和二抗(室溫，2 h)，TBST緩沖液洗膜后用ECL液進(jìn)行顯影。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)

胰腺癌細(xì)胞(Panc-1和BxPC-3)傳代后重新接種到96孔培養(yǎng)板中(細(xì)胞密度約為1×108·L-1)，培養(yǎng)12～24 h后分別轉(zhuǎn)染0.1 μg左右的pEGFP-C2(作為對照)和pEGFP-C2-TUFT1質(zhì)粒，48 h后更換為無血清培養(yǎng)基，并加入20 μL MTT(5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基并加入150 μL DMSO，震蕩混勻10 min后，測定492 nm波長處的吸光度。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)

胰腺癌細(xì)胞(Panc-1和BxPC-3)傳代后重新接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12～24 h后分別轉(zhuǎn)染5 μg左右的pEGFP-C2(作為對照)和pEGFP-C2-TUFT1質(zhì)粒，48 h后收集細(xì)胞，并加入400 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，并加入5 μL Annexin V染液，輕輕混勻后孵育15 min(4 ℃，避光)，然后加入10 μL PI，輕輕混勻后5 min(4 ℃，避光)，并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS軟件19.0對統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來表示，組間對比采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用比例表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-C2-TUFT1真核表達(dá)質(zhì)粒的酶切

用Xho I和BamH I內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，質(zhì)粒被酶切成兩條帶，與DNA Marker比對發(fā)現(xiàn)，一條帶位于4 268 bp和4 973 bp之間，另一條帶位于947 bp和1 375 bp之間，而pEGFP-C2載體和TUFT1片段的大小分別為4.7 kb和1 173 bp，大小均分別位于兩個(gè)區(qū)間，然后經(jīng)過pEGFP-C2載體和TUFT1PCR產(chǎn)物的酶切結(jié)果的橫向比較，基本可以確定一條是載體pEGFP-C2的條帶，另一條是目的片段TUFT1的條帶，表明質(zhì)粒連接成功，后續(xù)測序結(jié)果顯示TUFT1序列正確，表明pEGFP-C2-TUFT1質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pEGFP-C2-TUFT1的酶切鑒定M：DNA Marker；1：pEGFP-C2的酶切；2：重組質(zhì)粒的酶切；3：TUFT1的PCR產(chǎn)物

2.2 pEGFP-C2-TUFT1真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)

培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞(Panc-1和BxPC-3)，并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染約5 μg pEGFP-C2-TUFT1質(zhì)粒至細(xì)胞中，24 h后收集裂解細(xì)胞，提取總蛋白后利用蛋白印跡檢測TUFT1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，用GFP抗體免疫印跡后，轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-TUFT1組在70 ku左右的位置出現(xiàn)了清晰的條帶，其大小基本與GFP-TUFT1(27 ku+44 ku)一致，而未轉(zhuǎn)染的空白對照組未檢測到任何條帶，表明pEGFP-C2-TUFT1能夠在細(xì)胞中正常表達(dá)(圖2)。

2.3 TUFT1對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響

將胰腺癌細(xì)胞(Panc-1和BxPC-3)分成三組，即空白組、對照組和實(shí)驗(yàn)組，空白組不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染pEGFP-C2空載體質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-TUFT1質(zhì)粒，并利用MTT技術(shù)對各組細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測和比較，結(jié)果顯示空白組和對照組的細(xì)胞增殖率分別為0.616±0.048/0.634±0.043和0.610±0.041/0.625±0.047，二者不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而觀察組的細(xì)胞增值率為0.867±0.045/0.829±0.053，均要顯著高于空白組和對照組(P<0.05)，表明TUFT1的過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞(Panc-1和BxPC-3)的增殖，見表1。

圖2 重組質(zhì)粒pEGFP-C2-TUFT1的蛋白表達(dá)

2.4 TUFT1對胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響

將胰腺癌細(xì)胞(Panc-1和BxPC-3)分成三組，即空白組、對照組和實(shí)驗(yàn)組，空白組不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染pEGFP-C2空載體質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-TUFT1質(zhì)粒，并用流式細(xì)胞術(shù)對各組細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測和比較，結(jié)果顯示空白組和對照組的細(xì)胞凋亡率分別為0.236±0.024/0.221±0.031和0.240±0.033/0.223±0.021，二者不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而觀察組的細(xì)胞增值率為0.095±0.008/0.091±0.009，均要顯著高于空白組和對照組(P<0.05)，表明TUFT1的過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞(Panc-1和BxPC-3)的增殖，見表2。

表1 過表達(dá)TUFT1基因后對人胰腺癌細(xì)胞增殖的影響

* 表示與空白組和對照組相比，P<0.05。

表2 過表達(dá)TUFT1基因后對胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響

* 表示與空白組和對照組相比，P<0.05。

3 討論

在21世紀(jì)，對胰腺癌的治療仍然是個(gè)難題，不但治愈率極低，而且預(yù)后效果也很差，患者中位生存期都很難超過6個(gè)月，5年生存率也基本低于5% ，但其發(fā)病率卻有逐年升高的趨勢，在有些國家和地區(qū)竟上升7倍之多，形勢異常嚴(yán)峻[8-9]。目前，對于胰腺癌發(fā)病的具體原因還不清楚，可能與吸煙酗酒、過分?jǐn)z入高糖分、高脂肪、高熱量、高蛋白飲食等不良生活習(xí)慣、環(huán)境污染以及遺傳因素有著一定的關(guān)系[10]。對于PC的治療，主要采用以外科手術(shù)治療為主、放化療結(jié)合為輔、免疫和分子等生物治療綜合應(yīng)用的治療方法，但由于其發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者確診是已經(jīng)失去了手術(shù)治療的機(jī)會，因此探索PC的發(fā)病機(jī)制、尋找治療其的有效的基因靶點(diǎn)意義重大。TUFT1是一種富含谷氨酸和天冬氨酸典型酸性蛋白，且其在脊椎動物中具有高度保守性，人類的和牛和小鼠的同源性分別高達(dá)89%和88%。最初的研究發(fā)現(xiàn)，TUFT1表達(dá)于牙齒中，在牙釉的發(fā)展和礦化中發(fā)揮著重要作用[11]，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)TUFT1在其它組織中也有不同程度的表達(dá)[12-13]，尤其是癌組織，這將表明TUFT1可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展密不可分。

癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移是癌癥惡化和致死的重要原因之一，而上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變(EMT)在這一過程扮演這十分重要的角色[14]，有研究表明TUFT1與胰腺癌細(xì)胞中EMT的發(fā)生有著密切的關(guān)系，過表達(dá)TUFT1后能夠顯著上調(diào)HIF1、Snail、Vimentin等蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)降低E-cadherin的表達(dá)水平，而這些EMT相關(guān)蛋白的異常變化將最終導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞的遷移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這一研究結(jié)果提示TUFT1可能發(fā)揮著一定的致癌功能，與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系[7]。另外，細(xì)胞增殖和凋亡是一對相互并存的矛盾，二者的動態(tài)平衡維護(hù)這細(xì)胞的正常生長，而一旦這種平衡被打破，如細(xì)胞增殖的速度加快、細(xì)胞凋亡的速率下降最終會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[15]。因此為了確定TUFT1在癌細(xì)胞中的功能，本文進(jìn)一步研究了TUFT1對胰腺癌細(xì)胞系(Panc-1, BxPC-3)增殖和凋亡的影響，我們首先成功構(gòu)建了pEGFP-C2-TUFT1真核表達(dá)載體，然后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到Panc-1和BxPC-3細(xì)胞系中，裂解細(xì)胞提取總蛋白，免疫印跡檢測到該質(zhì)粒能夠正常表達(dá)，為研究其在細(xì)胞增殖和凋亡中的功能奠定了基礎(chǔ)。在細(xì)胞增殖和凋亡的研究中，結(jié)果表明：TUFT1能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖，并抑制癌細(xì)胞的凋亡，從而有利于癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移，但對于其促增殖抑凋亡的具體機(jī)制目前還不清楚，需要進(jìn)一步研究。

綜上，本研究成功構(gòu)建了人源TUFT1的真核表達(dá)載體，并初步確定TUFT1可以明顯加速人胰腺癌細(xì)胞株(Panc-1和BxPC-3)的增殖，同時(shí)又能抑制其凋亡，具有顯著的致癌功能，為進(jìn)一步探索TUFT1基因功能、尋求治療胰腺癌的新途徑提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。另外本研究探討的是TUFT1過表達(dá)后對胰腺癌細(xì)胞的影響，在接下來研究中，我們將利用siRNA干擾技術(shù)和CRISPR技術(shù)沉默和敲除TUFT1基因，進(jìn)而探討其對腺癌和其它癌細(xì)胞的增殖、凋亡、以及信號通路的影響，逐漸解開TUFT1基因與癌癥的關(guān)系。

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Research on Construction of TUFT1 EukaryoticExpression Plasmid and Its Function

YUAN Kongxian1, WANG Jinian2

(1.DepartmentofPharmacy,TonglingPeople’sHospital,Tongling244002,China;2.DepartmentofEducation,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Extract total RNA of human hepatic stellate cells, reverse transcription into cDNA as templates, and obtain amplification TUFT1 CDS sequence, after connect to pEGFP-C2 carrier by using the double enzyme. Eukaryotic expression plasmid was transfected respectively to human pancreatic cancer cell line. Then, result showed that the cell proliferation rate of transfection group was significantly lower than normal group; cell apoptosis rate of transfection group was significantly higher than normal group. TUFT1 can significantly inhibit the proliferation of pancreatic cancer cell line, and promote its apoptosis. These results have a further understanding the function of TUFT1, and lay a foundation for searching a new direction in the therapy of pancreatic cancer.

TUFT1; transfection; proliferation; apoptosis

2017-03-27

袁孔現(xiàn)(1973-)，男，安徽當(dāng)涂人，副主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)。通信作者：王繼年(1984-)，男，安徽阜陽人，助理研究員，碩士，研究方向：醫(yī)藥管理、藥理學(xué)。

R735.9

A

1009-9735(2017)02-0071-04