光照對霍山石斛次生代謝產(chǎn)物積累的研究

司華陽，陳乃富，陳乃東，劉國瑞，王 娜

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230032；2.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；3.皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012)

光照對霍山石斛次生代謝產(chǎn)物積累的研究

司華陽1，2，陳乃富2，3，陳乃東2，3，劉國瑞2，王 娜2

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230032；2.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；3.皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012)

通過比較紅藍(lán)光和LED光照處理對霍山石斛根、莖、葉中脂溶性多糖、水溶性多糖及多酚的含量的影響。結(jié)果表明：在本實驗條件下，紅藍(lán)光光照處理的霍山石斛，不同部位水溶性多糖、脂溶性多糖及多酚含量依次為：根<葉<莖、根<莖<葉、根<莖<葉；LED光照處理的霍山石斛不同部位水溶性多糖、脂溶性多糖及多酚含量為：根<葉<莖、根<莖<葉、根<葉<莖；對結(jié)果進(jìn)行初步分析，為霍山石斛資源的合理開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

霍山石斛；不同光照；水溶性多糖；脂溶性多糖；多酚

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseTangetCheng)又稱米斛，主產(chǎn)于大別山安徽霍山縣等地，是蘭科石斛屬的草本植物?；羯绞泻衲c胃、生津益胃，平胃氣，長肌肉，益智除驚，輕身延年，抗腫瘤、降糖保肝和抗白內(nèi)障[1-4]等多種功效。由于霍山石斛生長環(huán)境特殊及人工采集過度，其野生資源已處于瀕臨滅絕境況[5-6]。藥用植物的有效成分通常都是植物次生代謝產(chǎn)物，其含量高低與藥材品質(zhì)息息相關(guān)[7]。目前石斛組培技術(shù)已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但能找到獲得更大藥用價值的培養(yǎng)條件也對霍山石斛研究與發(fā)展有重要的意義。本實驗通過比較紅藍(lán)光和LED光對組培霍山石斛中水溶性多糖、脂溶性多糖及多酚三種次生代謝產(chǎn)物含量影響的研究，為霍山石斛資源產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

經(jīng)紅藍(lán)光照條件處理的霍山石斛和LED光燈光照處理的霍山石斛(均為兩年生霍山石斛)，來自實驗室人工氣候室。

RE-52D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海浦滬儀器廠)；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(北京市普析通用儀器有限公司)；HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠)；GL-200-ll型離心機(jī)(上海市安亭科學(xué)儀器廠)；GL-20G-ll電子分析天平(上海安亭科學(xué)儀器廠)；索氏提取器(天長市千波教學(xué)儀器有限公司)。

葡萄糖(SIGMA試劑公司)；無水乙醇(AR上海振興化工一廠)；三氯甲烷、丙酮、濃硫酸(AR汕頭市西隴化工廠股份有限公司)；α-萘酚(AR北京瀛海精細(xì)化工廠)；蒽酮(AR天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醚(AR上海振興化工一廠)；甲醇(GR上海星可生化有限公司)；福林酚(AR北京夢怡美生物科技有限公司)；沒食子酸(AR上海金穗生物科技有限公司)。

1.2 脂溶性多糖的提取

取不同光照條件下處理的石斛根莖葉分離、切成薄片，薄片置于干燥箱中45 ℃干燥至恒重，粉碎，過20目篩，以95%乙醇，85 ℃回流提取1 h。離心、合并上清液，得到乙醇總浸出物溶液，加入95%乙醇定容，沉淀殘渣物收集，備用。

1.2.1 脂溶性多糖的含量測定

精確移取各供試樣品的乙醇浸出液1.5 mL分別置于清潔的青霉素瓶中，于40 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，稱重，計算供試樣品脂溶性多糖得率，計算公式如下：

脂溶性多糖得率(%)=M×V/W×100%

式中M代表1.5 mL乙醇浸出液干燥后質(zhì)量(mg)；V代表乙醇浸出液總體積；W代表樣品重量(mg)。

1.3 水溶性多糖的提取

石斛多糖采用熱水浸提工藝提取，粗多糖采用Sevag法脫蛋白[8-9]。取適量1.2實驗所得濾渣，于90 ℃熱水浴中浸提2 h(1∶15)，重復(fù)3次，過濾、合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃減壓濃縮至1/3原體積，冷卻至室溫。加入3倍體積的無水乙醇，4℃冰箱內(nèi)靜置過夜，離心收集沉淀物，干燥后即得到組培霍山石斛粗多糖。多糖提取液中的蛋白質(zhì)用三氯甲烷-正丁醇(V∶V=4∶1)混合液萃取多次至萃取液澄清，合并水相萃取液，280 nm處紫外檢測有無蛋白質(zhì)吸收峰，加入3倍體積的無水乙醇，離心，收集沉淀物，所得沉淀物先后用無水乙醇、丙酮、無水乙醚相繼洗滌，烘干后制得組培霍山石斛精制多糖。

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，蒸餾水溶解配制成濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL于10支具刻度線試管中，加水至1.0 mL搖勻。冰水浴條件下向各管中加入4.0 mL蒽酮-硫酸[10-12]溶液，震蕩搖勻，于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，621 nm處檢測吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，采用線性回歸方法，作標(biāo)準(zhǔn)曲線求回歸方程。

1.3.2 多糖換算因子的測定

精確稱取干燥至恒重的精制組培霍山石斛多糖樣品10 mg，配成濃度為0.1 mg/mL的石斛多糖溶液，按1.3.1方法檢測其吸光度，代入回歸方程，算的多糖含量，另取1 mL于40 ℃烘箱中干燥至恒重，測定質(zhì)量，由以下公式計算多糖的換算因子。

換算因子：f=W/C×D

式中W代表干燥至恒重精制多糖的量(mg)；C代表多糖液中折合標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度(mg/mL)；D代表稀釋因素。

1.3.3 水溶性多糖含量的測定

精確吸取組培霍山石斛水提液1.0 mL，按1.3.1方法測定吸光度值，將其吸光度平均值代入回歸方程求出多糖含量，由以下公式計算出石斛中多糖含量。

多糖含量(%)=C·D·F/W×100%

式中W代表樣品的重量(mg)；C代表多糖液中折合標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度(mg/mL)；D代表稀釋因素；F代表換算因子。

1.4 多酚的提取

取不同光照條件下處理的石斛根莖葉分離、切成薄片，薄片置于干燥箱中45 ℃干燥至恒重，粉碎，過20目篩，取一定量的不同方法處理的石斛根、莖和葉粉末，置于250 mL燒瓶中，按料液比1∶15(g/mL)加80%乙醇,冷凝回流提取，80 ℃條件下回流提取3次，每次1.5 h[13-14]。合并提取液，再將合并的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器濃縮至適量，然后將濃縮液放置于燒杯中揮去剩余乙醇，最后將提取液用倒入容量瓶并用蒸餾水定容得總多酚提取液，4 ℃保存，備用。

1.4.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，用蒸餾水溶解并定容至1 000.0 mL配置成25 ug/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用Folin-Ciocalteu比色法測定樣品中總多酚的含量。分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5、3.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，依次加入2.5 mL福林酚試劑，2 mL 7.5%的NaCO3(4～6 min內(nèi))和1 mL甲醇最后加蒸餾水至10 mL[15]，在昏暗中反應(yīng)60 min，然后在517 nm處測定吸光度值(A)。以吸光度值為縱坐標(biāo)(Y)，多酚含量為橫坐標(biāo)(X)。測定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 石斛多酚含量的測定

取1.0 mL多酚總提液加2.5 mL福林酚試劑2 mL 7.5%的NaCO3(4～6 min內(nèi))和1 mL的甲醇于10 mL容量瓶中，加蒸餾水至10 mL，在黑暗中反應(yīng)60 min，然后在517 nm處測定吸光度，以蒸餾水為空白對照。將所測吸光度值代入回歸方程，計算不同光照處理的霍山石斛根、莖和葉多酚的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗所有數(shù)據(jù)均取三次平行實驗的平均值。

2 結(jié)果分析

2.1 不同光照多霍山石斛中脂溶性多糖得率影響

由圖1可知，不同光照條件對霍山石斛根、莖、葉中脂溶性多糖得率具有顯著影響。紅藍(lán)光組霍山石斛根、莖、葉中脂溶性多糖得率明顯低于LED光照組，同組光照處理的霍山石斛根莖葉中脂溶性多糖的得率依次遞增，葉中所含的脂溶性多糖得率最高。LED光照處理的霍山石斛根莖葉中，不同部位之間所含的脂溶性多糖增長趨勢平穩(wěn)，保持約2%的增長率。紅藍(lán)光處理的霍山石斛根莖葉中，葉中脂溶性多糖得率的增長率相較于莖中較高，說明紅藍(lán)光處理對葉中脂溶性多糖合成的影響較根莖更為顯著。

圖1 不同光照下霍山石斛中脂溶性多糖的得率

2.2 不同光照對霍山石斛中水溶性多糖含量的影響

由圖2可知，LED光組和紅藍(lán)光組處理的霍山石斛莖中所含的水溶性多糖含量最高，其次為葉，根中水溶性多糖含量相對較少。LED光處理的霍山石斛莖中的水溶性多糖含量高于紅藍(lán)光組，其根、葉中所含的水溶性多糖含量比紅藍(lán)光組低。相較于根葉中水溶性多糖LED光照組莖中水溶性多糖含量的增長率分別為238%、85%，遠(yuǎn)高于紅藍(lán)光組莖中水溶性多糖的增長率112%、37%。

圖2 不同光照下霍山石斛中水溶性多糖的含量

2.3 不同光照對霍山石斛中多酚含量的影響

由圖3可知，LED光照處理的霍山石斛根莖葉中的多酚含量明顯高于同部位紅藍(lán)光處理的霍山石斛，莖中的多酚含量最高，其次為葉，紅藍(lán)光處理的霍山石斛根、莖、葉中所含的多酚含量依次遞增，兩組不同光照處理的霍山石斛根、莖、葉中的多酚含量呈現(xiàn)兩種不同的增長趨勢，可能是由于光照不同影響植物的代謝從而影響多酚的產(chǎn)生。兩組光照處理的石斛莖中所含的多酚含量有較為明顯的差異，相差0.71%，多酚含量增長率約為82%，明顯高于根、葉中多酚含量的增長率(7%、15%)。

圖3 不同光照下霍山石斛中多酚的含量

圖4 不同光照下霍山石斛植株中脂溶性多糖的總得率及水溶性多糖和多酚的總含量

3 討論

由圖表分析可知，光照條件不同對組培霍山石斛次生代謝產(chǎn)物的累積具有明顯的影響，LED光照處理的霍山石斛根、莖、葉中脂溶性多糖的總得率及水溶性多糖和多酚的總含量較優(yōu)于紅藍(lán)光組(見圖4)，而藥物的療效基礎(chǔ)與其自身合成的次生代謝產(chǎn)物密不可分。兩組光照處理的霍山石斛莖中水溶性多糖量明顯高于根、葉中的含量，且植株中的水溶性多糖含量明顯高于多酚及脂溶性多糖的含量及得率，現(xiàn)代藥理研究表明，多糖具有多種藥理活性，因此從藥用角度考慮，以霍山石斛莖入藥更為合理，且LED光照處理的組培霍山石斛更有利于次生代謝產(chǎn)物的積累，提高組培石斛的藥用品質(zhì)。

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Study on the Accumulation of the Secondary Metabolitesin Dendrobium Huoshanense by Light

SI Huayang1,2, CHEN Naifu2,3, CHEN Naidong2,3,LIU Guorui2, WANG Na2

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230012,China;2.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Lu’anCity237012;3.WestAnhuiBiotechnologyResearchCenterofNaturalMedicineandTraditionalChineseMedicine,WestAnhuiUniversity,Lu’anCity237012)

By comparing the effects of the red and blue light and LED light treatment to the content of fat soluble polysaccharide, water soluble polysaccharide and polyphenol of dendrobium huoshanense in the three parts of roots, stems and leaves. Experimental results show that the content of Dendrobium huoshanense lipid-soluble polysaccharides, water-soluble polysaccharides and polyphenols were root

dendrobium huoshanense; different light; water soluble polysaccharide; fat soluble polysaccharide; polyphenol

2017-04-08

國家自然科學(xué)基金(81573536、81274021)；安徽省自然科學(xué)基金面上項目(1608085MH221)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點項目(KJ2016A886)；安徽省自然科學(xué)研究重大項目(2015ZD043)；中國博士后基金特別資助(2016T90568)。

司華陽(1990-)，男，安徽巢湖人，碩士研究生，研究方向：植物化學(xué)；陳乃東(1972-)，男，安徽六安人，博士后，副教授，研究方向：中藥與天然藥物活性成分分離鑒定、藥物活性成分結(jié)構(gòu)修飾及其構(gòu)效關(guān)系。通信作者：陳乃富(1962-)，男，安徽六安人，教授，碩導(dǎo)，研究方向：中藥生物技術(shù)、中藥資源與質(zhì)量研究。

R284

A

1009-9735(2017)02-0014-04