氨基隱性孔雀石綠抗體的制備及ELISA方法的建立

常超+張佳艷+程時(shí)杰+伍金娥

摘要：以N，N-二甲基苯胺、對(duì)硝基苯甲醛為原料，合成改造了氨基隱性孔雀石綠半抗原，并通過紫外、紅外、質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明，氨基隱性孔雀石綠半抗原改造成功。采用重氮化法合成了氨基隱性孔雀石綠人工抗原，并通過紫外光譜進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示偶聯(lián)蛋白成功。免疫大白兔制備了隱性孔雀石綠抗體，抗體效價(jià)達(dá)6.4×104。建立了隱性孔雀石綠ELISA方法，最低檢測(cè)線為0.1 μg/L。

關(guān)鍵詞：孔雀石綠；隱性孔雀石綠；抗體；ELISA

中圖分類號(hào)：O657.7+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）07-1340-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.036

Preparation of Antibody of Amino-Leucomalachite Green

and Development of ELISA Method

CHANG Chao， ZHANG Jia-yan， CHENG Shi-jie， WU Jin-e

（College of Food Science and Technology， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）

Abstract： With N，N-dimethylanilin and p-nitrobenzaldehyde as raw materials，the hapten of amino-leucomalachite green （NH2-LMG） was synthesized and then was identified with ultraviolet，infrared and mass spectrum. The results showed that the artificial antigen of NH2-LMG was successfully synthesized by diazotization method and was identified by ultraviolet spectrum，which indicated the success of the coupling protein. The antibody of NH2-LMG was prepared with immune New Zealand white rabbits，and the antibody titer reached 6.4×104. The ELISA method was developed， with the limit of detection of 0.1 μg/L.

Key words： malachite green； leucomalachite green； antibody； enzyme-linked immunosorbent assay

孔雀石綠（Malachite Green，MG）是合成的三苯甲烷類染料，因具有高效廣譜殺菌作用而曾廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。然而，孔雀石綠在水生動(dòng)物體內(nèi)會(huì)被代謝成隱性孔雀石綠（Leucomalachite Green，LMG），其代謝產(chǎn)物被視為殘留標(biāo)示物，孔雀石綠（圖1）和隱性孔雀石綠（圖2）具有致畸致癌致突變的毒性[1-4]，包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家都已嚴(yán)禁使用。但由于其價(jià)格便宜，違禁使用的事件屢有發(fā)生，給人類的健康帶來巨大的隱患。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)三苯甲烷類物質(zhì)的檢測(cè)主要運(yùn)用色譜技術(shù)，如HPLC、LC-MS等[5-10]，中國(guó)頒布的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1479-2004和GB/T 20361-2006[11，12]也主要采用儀器方法。儀器方法雖然靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但需要昂貴的儀器，樣品處理復(fù)雜，不適合大量樣品的篩選。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）因具有快速、靈敏、高效等優(yōu)點(diǎn)，用于大批量藥物殘留篩選越來越廣泛。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)開始研發(fā)隱性孔雀石綠ELISA方法，但在半抗原改造時(shí)大多數(shù)是在苯環(huán)引入羧基[13-18]。為了能夠篩選出更靈敏的抗體，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)在苯環(huán)上引入硝基，并運(yùn)用紫外、紅外和質(zhì)譜對(duì)半抗原改造進(jìn)行鑒定，采用重氮化法合成人工抗原，并對(duì)抗體進(jìn)行篩選，建立了隱性孔雀石綠ELISA方法，為開發(fā)更靈敏的隱性孔雀石綠試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 2月齡雄性健康新西蘭大白兔，體重1.5±0.5 kg，購(gòu)于湖北省疾病預(yù)防控制中心。

1.1.2 試劑 對(duì)硝基苯甲醛、N，N-二甲基苯胺、二甲基亞砜等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司上海分公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）等，Sigma公司；羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶偶合物（GaR IgG-HRP），碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.3 儀器 NEXUS670型傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)Nicolet儀器公司）；LTQ XL型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Eimer Lambda25型紫外可見吸收光譜儀（美國(guó)Perkin Eimer公司）；MagenllanCE 2.5型酶標(biāo)儀（瑞士SUNRISE公司等）。

1.2 方法

1.2.1 硝基化隱性孔雀石綠的合成及鑒定 硝基化隱性孔雀石綠（NO2-LMG）合成路線見圖3。稱取對(duì)硝基苯甲醛3.63 g，N，N-二甲基苯胺15 mL，無水ZnCl2 8.00 g，無水乙醇150 mL于圓口燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)100 ℃下回流24 h，反應(yīng)結(jié)束旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉溶劑后將其置于冰箱中，24 h出現(xiàn)沉淀，抽濾后得到黃色沉淀，用丙酮和水的混合溶液對(duì)NO2-LMG粗產(chǎn)物作重結(jié)晶。產(chǎn)物經(jīng)紫外、紅外、質(zhì)譜鑒定，液相色譜測(cè)定其含量。液質(zhì)聯(lián)用儀的色譜條件：柱溫20 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相為乙腈+0.05 mol/L乙酸銨緩沖液（pH 4.5，75∶25）。質(zhì)譜條件：離子源ESI（+）：噴霧電壓4.5 kV；毛細(xì)管電壓16.5 V；毛細(xì)管電流溫度300 ℃；鞘氣30 arb；輔助氣反吹氣流量0 arb；源內(nèi)碰撞電壓8.0 V；毛細(xì)管透鏡電壓55 V。

1.2.2 氨基化隱性孔雀石綠的合成及鑒定 稱取0.75 g硝基隱性孔雀石綠，2.24 g鐵粉，濃鹽酸2 mL，去離子水10 mL于80 ℃下回流反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后趁熱過濾掉鐵粉，母液置于冰箱中，3 h內(nèi)出現(xiàn)淺綠色沉淀，抽濾，水洗3次，真空冷凍干燥后得到氨基隱性孔雀石綠粗產(chǎn)物（NH2-LMG）。產(chǎn)物經(jīng)紫外、紅外、質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜鑒定條件同“1.2.1”。

1.2.3 人工抗原的合成及鑒定 使用重氮化法將NH2-LMG上的氨基與蛋白質(zhì)上的羧基進(jìn)行偶聯(lián)。取氨基隱性孔雀石綠34.5 mg溶于10 mL預(yù)冷的濃鹽酸中，充分溶解。在4 ℃的條件下逐滴向其加入0.1 mol/L的亞硝酸鈉溶液，期間用碘化鉀試紙檢驗(yàn)，變?yōu)樯钏{(lán)色終止滴加。用濃度為0.01 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)上清液pH至7，為A液。將135 mg BSA溶解于10 mL的PBS緩沖液當(dāng)中，為B液。4 ℃磁力攪拌下，將A液緩慢倒入B液中，反應(yīng)過夜， 4 000 r/min離心10 min，取上清液于pH為7.4的PBS緩沖液中透析，產(chǎn)物經(jīng)紫外光譜鑒定。

1.2.4 動(dòng)物免疫試驗(yàn) 6只2月齡體重1.5±0.5 kg 的雄性健康新西蘭大白兔，用NH2-LMG-BSA免疫，設(shè)計(jì)兩個(gè)劑量（0.5 mg/只、1.0 mg/只），每個(gè)劑量各3只，免疫時(shí)間間隔均為1個(gè)月?；A(chǔ)免疫用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑。從第三次免疫開始，每次免疫后7～10 d耳靜脈采血，直接ELISA測(cè)定各抗體效價(jià)。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定IC50。

1.2.5 方法的建立 采用方陣滴定法和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法優(yōu)化抗原包被濃度、抗體工作濃度。在上述最佳條件下，將LMG母液稀釋成0、0.1、0.4、1.6、6.4和25.6 μg/L，按間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法進(jìn)行測(cè)定，以LMG溶液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中抑制率=100%×B/B0， B0和B分別為零標(biāo)準(zhǔn)孔和含藥物孔所對(duì)應(yīng)的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝基隱性孔雀石綠結(jié)構(gòu)表征

KBr壓片，測(cè)得目標(biāo)化合物的紅外光譜見圖4。圖譜顯示1 340、1 690、1 600～1 400 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，1 340 cm-1為NO2的伸縮振動(dòng)峰，1 690 cm-1為C=O的伸縮振動(dòng)峰，1 600～1 400 cm-1為苯環(huán)上的C=C的伸縮振動(dòng)峰，與硝基隱性孔雀石綠的官能團(tuán)一致。

目標(biāo)化合物液相色譜圖（圖5）顯示出峰時(shí)間為3.11 min，質(zhì)譜鑒定顯示一級(jí)質(zhì)譜圖（圖6）中得到一相對(duì)分子質(zhì)量為376.02的離子峰，該相對(duì)分子質(zhì)量與硝基隱性孔雀石綠相對(duì)分子質(zhì)量一致。以母離子m/z 376.2進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定（圖7）：m/z 361.04（M+-CH3），m/z 239.09（M+-NO2-C6H4-CH3），多級(jí)質(zhì)譜分析顯示硝基隱性孔雀石綠合成成功。

2.2 氨基隱性孔雀石綠結(jié)構(gòu)表征

KBr壓片，測(cè)得目標(biāo)化合物的紅外光譜見圖8。圖譜顯示3 433、3 353、1 690、1 600～1 400 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，3 433 cm-1與3 353 cm-1為NH2的伸縮振動(dòng)峰，1 690 cm-1為C=O的伸縮振動(dòng)峰，1 400～600 cm-1為苯環(huán)上的C=C的伸縮振動(dòng)峰，與氨基隱性孔雀石綠的官能團(tuán)一致。

目標(biāo)化合物液相色譜圖（圖9）顯示出峰時(shí)間為1.938 min，質(zhì)譜鑒定顯示一級(jí)質(zhì)譜圖（圖10）得到一分子量為346.12的離子峰，該分子量與氨基隱性孔雀石綠分子量一致。以母離子m/z 346.1進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定（圖11）：m/z 331.13（M+-CH3），多級(jí)質(zhì)譜分析顯示氨基隱性孔雀石綠合成成功。

2.3 人工抗原結(jié)構(gòu)表征

免疫原NH2-LMG-BSA紫外圖譜見圖12。BSA最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，NH2-LMG-BSA最大吸收波長(zhǎng)為259 nm，載體偶聯(lián)半抗原后最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生明顯改變，初步證明NH2-LMG與BSA偶聯(lián)成功。

2.4 抗體質(zhì)量

免疫4次后，直接ELISA 測(cè)定各免疫組效價(jià)，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定IC50，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示除了低劑量組（0.5 mg）中免疫兔Rab-3沒有免疫反應(yīng)，其他免疫兔均有反應(yīng)。免疫兔Rab-2產(chǎn)生的抗體靈敏度更高，建議選擇該抗體。通過測(cè)定交叉反應(yīng)率，顯示該抗體除了對(duì)隱性孔雀石綠（100%）以及原型藥孔雀石綠（30%）有反應(yīng)，對(duì)其他藥物沒有交叉反應(yīng)（<0.01%）。

2.5 方法的建立

2.5.1 抗原最佳包被濃度 方陣滴定確定抗原包被濃度結(jié)果見表2。OD值在1.000左右的包被抗原濃度為500 μg/L，以500 μg/L為中心濃度，包被300、400、500、600、700 μg/L 5個(gè)濃度作間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，測(cè)定IC50。見表3。結(jié)果表明，包被400 μg/L的抗原，IC50最小，抗體反應(yīng)最靈敏。

2.5.2 抗體最佳工作濃度 方陣滴定確定抗體工作濃度結(jié)果見表1。OD值在1.0左右的抗體工作濃度為3.2×104，以3.0×104為中心濃度，設(shè)計(jì)2.0×104、2.5×104、3.0×104、3.5×104、4.0×104 5個(gè)濃度作間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，抗體稀釋2.5×104，IC50最小，抗體反應(yīng)最靈敏。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以抑制率為縱坐標(biāo)，LMG濃度的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖13。曲線在0.1～25.6 μg/L趨近直線，線性關(guān)系好。

3 小結(jié)

建立小分子化合物免疫化學(xué)最為關(guān)鍵的技術(shù)是獲得高質(zhì)量的抗體，而高質(zhì)量的抗體取決于小分子半抗原的改造和人工抗原的合成?？兹甘G的殘留標(biāo)示物是其代謝產(chǎn)物隱性孔雀石綠，隱性孔雀石綠結(jié)構(gòu)本身不含有羧基和氨基等活性基團(tuán)與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，因此必須對(duì)隱性孔雀石綠半抗原進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造引入羧基或氨基。已報(bào)道的孔雀石綠半抗原改造大多數(shù)是引入羧基，本研究選擇N，N-二甲基苯胺、對(duì)硝基苯甲醛，合成了氨基隱性孔雀石綠半抗原，并通過紫外、紅外、質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，重氮化法將氨基隱性孔雀石綠與蛋白偶聯(lián)，通過紫外和動(dòng)物免疫試驗(yàn)顯示隱性孔雀石綠半抗原和人工抗原合成成功。選擇最優(yōu)的抗體建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，檢測(cè)范圍0.1～25.6 μg/L，檢測(cè)能力0.1 μg/L，為進(jìn)一步開發(fā)隱性孔雀石綠檢測(cè)試劑盒提供了技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1] CULP S J，BLANKENSHIP L R，KUSEWITT D F，et al.Toxicity and metabolism ofmalachite green and leucomalachite green during short-term feeding to Fischer 344 rats and B6C3F1 mice[J].Chemico Biological Interactions，1999，122（3）：153-170.

[2] MAJANATHA M G，SHELTON S D. Carcinogenicity of malachite green chloride and leucomalachite green in B6C3F1 mice and F344 rats[J].Food and Chemical Toxicology，2006，44（8）：1204-1212.

[3] MITTELSTAEDT R A，MEIN W，SHADDOCK J G，et al. Genotoxicity ofmalachite green and leucomalachite green in female Big BlueB6C3F1 mice[J].Mutation Research，2004，561（1-2）： 127-138.

[4] CULP S J，BELAND F A，HEXICH R H，et al.Mutagenicity and carcinogenicity in relation to DNA adduct formation in rats fed leucomalachite green[J].Mutation Research，2002，506-507（2）：55-63.

[5] MITROWSKA K，POSYNIAK A，ZMUDZKI J. Determination of alachite green and leucomalachite green in carp muscle by liquid chromatography with visible and fluorescence detection[J]. Journal of Chromatography A，2005，1089：187-192.

[6] TARBIN J A，BARNES K A，BYGRAVE J，et al. Screening and confirmation of triphenylmethane dyes and theirleucometabolites in trout muscle using HPLC-vis and ESPLCMS[J]. Analyst， 1998，123（12）：2567-2571.

[7] VALLE，CECILIA D，ANTONIO L Z，et al. Determination of the sum of malachite green and leucomalachite green in salmon muscle by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A， 2005，1067（1-2）：101-105.

[8] GERALDINE D，PATRICK P J，CONOR D，et al. Confirmatory analysis of malachite green， leucomalachite green， crystal violet and leucocrystal violet in salmon by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta，2007， 586（1-2）：411-419.

[9] LEE K C，WU J L，CAI Z W.Determination of malachite green and leucomalachite green in edible goldfish muscle by liquid chromatography-ion trap mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B，2006，843（2）：247-251.

[10] VANDERIET J M，MURPHY C J，PEARCE J N，et al. Determination of malachite green and leucomalachite green in a variety of aquacultured products by liquidchromatography with tandem mass spectrometry detection[J].J AOAC Int，2005，88（3）：744-749.

[11] SN/T 1479-2004，進(jìn)出口水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留檢測(cè)[S].

[12] GB/T 20361-2006，水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法[S].

[13] YANG M C，F(xiàn)ANG J M，KUO T F，et al. Production of anti-bodies for selective detection of malachite green and the related triphenylmethane dyes in fish and fishpond water[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55（22）：8851-8856.

[14] XING W W，HE L，YANG H，et al. Development of a sensitive and group-specificpolyclonal antibody-based enzyme-linkedimmunosorbent assay（ELISA） for detectionofmalachite green and leucomalachite greenin water and fish samples[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2009，89： 2165-2173.

[15] OPLATOWSKA M，CONNOLLY L，STEVENSON P，et al.Development and validation of a fast monoclonal based disequilibrium enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of triphenylmethane dyes and their metabolites in fish[J].Analytica Chimica Acta，2011，698：51-60.

[16] 王 權(quán)，李 健，郭德華，等.無色孔雀石綠免疫原的合成與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（6）：534-538.

[17] 沈玉棟，王 宇，孫元明，等.隱性孔雀石綠半抗原及全抗原設(shè)計(jì)、合成及鑒定[J].食品科學(xué)，2008，29（7）：263-266.

[18] 梁莉甜，劉志國(guó)，付云潔，等.隱性孔雀石綠多克隆抗體的制備及鑒定[J].食品科學(xué)，2013，34（7）：227-230.