不同品種棗黃酮及多糖體外抗氧化性評價

吳小燕+王仁才+劉瓊

摘要：采用超聲法提取3個品種棗（Zizphus jujube Mill）中黃酮、多糖并測定其含量，以維生素C作為陽性對照，測定其黃酮及多糖的還原力與對羥基自由基、超氧陰離子自由基及DPPH自由基的清除能力，比較其體外抗氧化性能。結(jié)果表明，小米棗黃酮、多糖含量分別為0.96、7.24 mg/g，明顯高于其余兩個品種；不同品種棗黃酮及多糖的抗氧化性均與濃度呈正相關(guān)，且同一品種棗黃酮抗氧化性強(qiáng)于多糖；不同品種棗抗氧化性與黃酮及多糖的含量呈正相關(guān)；小米棗黃酮濃度為1.00 mg/mL時，其對超氧陰離子、DPPH、OH自由基的清除率分別為77.37%、58.81%、56.98%，均低于維生素C。小米棗中的黃酮、多糖化合物具有良好的抗氧化性能，為其在抗衰老、抗腫瘤等方面的應(yīng)用研究提供了相關(guān)理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：棗（Zizphus jujube Mill）；黃酮；多糖；維生素C；抗氧化能力

中圖分類號：S665.1；R284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）07-1330-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.034

Evaluation of in Vitro Antioxidant Activity of Flavonoids and Polysaccharides from Different Varieties of Jujube

WU Xiao-yan， WANG Ren-cai， LIU Qiong

（College of Horticulture and Landscape， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract： Using ultrasonic method to extract the flavonoids and polysaccharides from 3 varieties of jujube and determine their contents， using VC as positive control， to determine the reducing power and hydroxyl radical， superoxide anion radical and DPPH radical scavenging capacity of flavonoids and polysaccharides from different varieties of jujube. Results showed that the contents of flavonoids and polysaccharides of Millet jujube was higher than the other two varieties significantly， their contents were 0.96 mg/g，7.24 mg/g. The antioxidant activity of flavonoids and polysaccharides was positively correlated with the concentration of different varieties of jujube. The antioxidant activity of flavonoids was stronger than that of polysaccharide in the same cultivar， the antioxidant activity of different cultivars was positively correlated with the contents of flavonoids and polysaccharides. When the concentration of flavonoids was 1.00 mg/mL，the scavenging rates of superoxide anion，DPPH and OH radical were 77.37%，58.81%，56.98%，which were lower than those of VC. The flavonoids and polysaccharide compounds in Millet jujube have good antioxidant properties， it provides the theoretical basis for its application in anti aging， anti tumor and so on.

Key words： jujube（Zizphus jujube Mill）；flavonoids；polysaccharides；VC；antioxidant capacity

棗（Zizphus jujube Mill）又名紅棗、大棗等，為鼠李科屬小喬木植物棗樹的果實，是目前農(nóng)業(yè)、林業(yè)發(fā)展項目中的重要樹種[1]。棗作為國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用果品[2]，有悠長的種植歷史，在中國南北各地都有種植。棗的營養(yǎng)與功能成分主要有維生素、多糖類[3，4]、膳食纖維、黃酮類[5]、蘆丁[6]、生物堿類[7]、多酚類[8]、皂苷類[9]、有機(jī)酸、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）[10]等，其中對多糖類與黃酮類的研究最多。黃酮類化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用[11，12]。多糖類化合物具有養(yǎng)心安神、緩和藥性[13]、補(bǔ)氣養(yǎng)血、抗氧化延緩衰老[14]、抗腫瘤[15，16]等作用。湖南棗品種資源豐富，其中衡陽市的地方品種由于其黃酮與多糖含量較高而備受關(guān)注。為促進(jìn)中國南方棗資源的利用及對棗種質(zhì)資源的挖掘，本試驗研究探討了湖南衡陽不同品種棗黃酮、多糖的體外抗氧化性能，為促進(jìn)南方優(yōu)質(zhì)品種棗工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米棗、藥棗、糖棗（均采自湖南省衡陽市）的黃酮及多糖提取物粉末；無水乙醇、濃硫酸、蒽酮、葡萄糖、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、DPPH、三氯化鐵、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、鄰苯三酚、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、維生素C，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純（AR）。

1.2 儀器與設(shè)備

ZW1105051705型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；SB-3200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物股份有限公司）；AUW220D型電子天平、DR-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機(jī)、TG16型臺式高速離心機(jī)（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以甲醇為溶劑配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對照品貯備液，分別精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL對照品溶液于6只10 mL試管中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%的氫氧化鈉溶液4.0 mL，并用去離子水定容至10 mL，搖勻，放置15 min，以去離子水作為空白，在510 nm處測定其吸光度。3次測量取平均值。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以去離子水為溶劑配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖對照品貯備液，分別精密量取0.2、0.4、0.8、1.2、1.4、1.6、2.0 mL對照品溶液于7只10 mL玻璃試管中，加去離子水溶解并定容至10 mL，搖勻。分別取上述7種梯度溶液各0.5 mL，空白對照為0.5 mL去離子水，均加入4.0 mg/mL蒽酮-硫酸試劑4.0 mL，立即蓋上塞子并搖勻，置于沸水浴中加熱3 min，取出用自來水冷卻到室溫后立即測定其在620 nm處的吸光度。3次測量取平均值。

1.3.3 棗黃酮、多糖的提取 分別稱適量不同品種棗于錐形瓶中，加入16倍量60%乙醇溶液，在超聲功率為700 W，溫度為60 ℃，提取時間為20 min下提取2次，抽濾，合并濾液并濃縮，得到黃酮、多糖混合濃縮液，往濃縮液中加入1.0%的三氯乙酸（TCA）溶液離心除去蛋白質(zhì)，然后用95%的乙醇沉淀濃縮液中的多糖，并對多糖進(jìn)行脫色，然后真空干燥成多糖粉末；分離出多糖后的上清液濃縮至無醇味后，稀釋過X-5大孔吸附樹脂，得到純化的黃酮溶液，將其真空干燥成黃酮粉末。稱取適量黃酮、多糖粉末用去離子水配制成一定濃度的溶液待測。

1.3.4 抗氧化活性測定 不同品種棗黃酮、多糖與維生素C的還原能力測定參照郝旭梅等[17]方法進(jìn)行；DPPH自由基清除力測定參照刁靜靜等[18]試驗方法進(jìn)行；OH自由基清除力測定參考楊方美等[19]報道的方法；超氧陰離子自由基清除力測定參照李斐菲等[20]的試驗方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=11.475x+0.007 3（R2=0.999 3）。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

采用硫酸-蒽酮比色法得到無水葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=4.452x-0.045（R2=0.999 1）。

2.3 不同品種棗黃酮、多糖含量

不同品種棗黃酮、多糖含量測定結(jié)果見表1。由表1可知，不同品種棗黃酮含量范圍在0.84～0.96 mg/g，其高低順序為小米棗>藥棗>糖棗；不同品種棗多糖含量范圍在5.03～7.24 mg/g，其高低順序為小米棗>糖棗>藥棗；3個品種棗中，小米棗的黃酮、多糖含量明顯高于其余兩個品種。

2.4 不同品種棗黃酮、多糖還原力

由圖1可知，在試驗選取的濃度范圍（0.04～0.20 mg/mL）內(nèi)，當(dāng)濃度較低時，維生素C的還原力相對較弱，隨著濃度的增大，其還原力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.20 mg/mL時，其還原力高達(dá)2.532。由圖2可知，不同品種棗黃酮及多糖的還原力均與濃度呈正相關(guān)，且同一品種棗黃酮還原力遠(yuǎn)大于多糖的還原力；不同品種棗黃酮還原力強(qiáng)弱順序為小米棗>藥棗>糖棗，不同品種棗多糖還原力強(qiáng)弱為小米棗>糖棗>藥棗，說明不同品種棗還原力強(qiáng)弱與黃酮及多糖含量呈正相關(guān)。其中小米棗黃酮還原力明顯高于其余品種棗的還原力，小米棗黃酮濃度為1.0 mg/mL時，還原力為1.697，與0.16 mg/mL的維生素C還原力相當(dāng)，說明維生素C的還原力為同等條件下小米棗黃酮的6倍。

2.5 DPPH自由基清除率

由圖3可知，在試驗選取的濃度范圍內(nèi)，維生素C對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加逐漸增強(qiáng)后趨于穩(wěn)定，當(dāng)維生素C濃度為0.20 mg/mL時，其對DPPH的清除率為95.11%。由圖4可知，不同品種棗黃酮、多糖對DPPH的清除率均隨濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到一定值后，清除率增加緩慢并趨于穩(wěn)定，同一品種棗黃酮對DPPH的清除率均高于多糖；不同品種棗對DPPH的清除率強(qiáng)弱與黃酮及多糖含量呈正相關(guān)。其中小米棗黃酮濃度為0.8 mg/mL時清除率為51.06%，與0.08 mg/mL的維生素C對DPPH的清除率相當(dāng)，說明維生素C對DPPH的清除率為同等條件下小米棗黃酮的10倍。

2.6 OH自由基清除率

由圖5可知，在試驗選取的濃度范圍內(nèi)，維生素C對OH自由基的清除率隨著濃度的增加逐漸增強(qiáng)并趨于穩(wěn)定，當(dāng)維生素C濃度為1.00 mg/mL時，其對OH自由基的清除率為82.63%。由圖6可知，不同品種棗的黃酮及多糖對OH自由基的清除率均隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，但3個品種棗黃酮對OH自由基的清除率增加幅度比多糖緩慢，當(dāng)濃度達(dá)到一定值后，清除率均趨于穩(wěn)定，且同一品種棗的黃酮對OH自由基的清除率均高于多糖；不同品種棗對OH自由基的清除率強(qiáng)弱與黃酮及多糖含量呈正相關(guān)。當(dāng)小米棗黃酮濃度為1.00 mg/mL時，對OH自由基的清除率為56.98%，低于同濃度下維生素C對OH自由基的清除率。

2.7 超氧陰離子自由基清除率

由圖7可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，維生素C對超氧陰離子自由基的清除率隨著濃度的增加逐漸增強(qiáng)后趨于穩(wěn)定，當(dāng)維生素C濃度為0.20 mg/mL時，其對超氧陰離子的清除率為94.72%。由圖8可知，不同品種棗黃酮及多糖在低濃度時對超氧陰離子的清除率均隨濃度的增加而緩慢增強(qiáng)，超過一定濃度后，隨濃度增加清除率增加比較明顯，且同一品種棗黃酮對超氧陰離子自由基的清除率均高于多糖；不同品種棗對超氧陰離子自由基清除力強(qiáng)弱與黃酮及多糖的含量呈正相關(guān)。小米棗黃酮在濃度為1.00 mg/mL時，對超氧陰離子自由基清除率為77.37%，相當(dāng)于0.12 mg/mL的維生素C對超氧陰離子自由基的清除率，說明維生素C對超氧陰離子自由基的清除率為同等條件下小米棗黃酮的8倍。

3 小結(jié)與討論

人體內(nèi)的自由基，特別是活性氧自由基的代謝異常，常會引發(fā)一些心腦血管病、癌癥等疾病，清除體內(nèi)多余自由基有利于人體健康，研究自由基清除劑已成為研究者關(guān)注的熱點[21，22]。植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，由于能提供活潑的氫而中止自由基連鎖反應(yīng)，具有良好的自由基清除效果[23]。近年來，國內(nèi)外在植物多酚清除自由基方面的研究報道較多，如蘋果多酚、茶多酚[24，25]等。但對棗中多酚及多糖的抗氧化性報道相對較少，本研究以湖南衡陽地區(qū)不同品種棗為研究對象，全面考察了其黃酮與多糖的還原力，清除羥基、超氧陰離子、DPPH自由基的能力，為棗功能成分產(chǎn)品的研究提供了有力依據(jù)。采用超聲法提取棗中的黃酮及多糖，分別用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法與硫酸-蒽酮法測定黃酮、多糖含量。結(jié)果表明，3個品種棗中，小米棗中黃酮及多糖的含量均高于其余兩個品種。小米棗中黃酮、多糖含量分別為0.96、7.24 mg/g。

本試驗將維生素C作為對照，綜合考察了3個品種棗的體外抗氧化性。結(jié)果顯示，小米棗的體外抗氧化性能明顯強(qiáng)于糖棗與藥棗，說明3個品種棗中，小米棗的開發(fā)利用價值較高；不同品種棗抗氧化性強(qiáng)弱與黃酮及多糖含量均呈正相關(guān)；3個品種棗黃酮及多糖的還原力、清除羥基自由基、超氧陰離子自由基及DPPH自由基的能力在試驗濃度范圍內(nèi)均與濃度呈正相關(guān)，且均低于維生素C的抗氧化性；同一品種棗黃酮的抗氧化性明顯高于多糖，若將黃酮、多糖復(fù)合在一起作為天然抗氧化劑時，黃酮將作為主抗氧化劑發(fā)揮作用，而多糖作為副抗氧化劑發(fā)揮作用，兩者協(xié)同可發(fā)揮最佳抗氧化性能；當(dāng)濃度為1.00 mg/mL時，小米棗黃酮的還原力、對超氧陰離子、DPPH及OH自由基的清除率分別為1.697、77.37%、58.81%、56.98%，均低于維生素C的抗氧化性，說明小米棗黃酮與多糖均具有一定的體外抗氧化性，但還需在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高其純度或擴(kuò)大濃度范圍，以得到黃酮、多糖發(fā)揮抗氧化性的最佳濃度，并將兩者復(fù)配在一起發(fā)揮協(xié)同增效作用。由于本試驗采用的均為體外化學(xué)方法，因此不能完全代表棗黃酮及多糖在體內(nèi)清除自由基的實際情況，但是為進(jìn)行棗功能成分的相關(guān)保健品的研究開發(fā)提供了參考。

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