DNA條形碼技術(shù)在金銀花和山銀花鑒定中的應(yīng)用

張嘉熙 張 琦 張曉謙 張彥帥

（北京市第九中學(xué) 北京 100041）

0 前言

金銀花（Lonicera japonica），又名忍冬。 “金銀花”一名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開為白色，后轉(zhuǎn)為黃色，因此得名金銀花。藥材金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬及同屬植物干燥花蕾或帶初開的花。山銀花與金銀花外形十分相像，親緣關(guān)系相近。事實上，山銀花指忍冬科的2種植物：菰腺忍冬（Lonicera hypoglauca）、華南忍冬（Lonicera confusa），生于溪邊、曠野疏林下或灌木叢中，產(chǎn)于我國南方各地。中醫(yī)認(rèn)為金銀花性寒而山銀花藥性熱，金銀花用于清熱解毒、通經(jīng)活絡(luò)，而山銀花則在某些方面與其功效完全相反。金銀花中含有較多的木樨草苷，而山銀花幾乎不含，此外，山銀花中綠原酸的含量略高，這也會導(dǎo)致二者藥用功效略有不同［1］。綜上所述，有必要對兩者進(jìn)行鑒別。

金銀花和山銀花為近緣植物，藥材的形狀特征比較相似，此外，無論是金銀花還是山銀花，都有許多改良品種，用傳統(tǒng)方法鑒別具有一定困難［2］。而DNA條形碼技術(shù)首先由加拿大動物學(xué)家Paul Hebert提出［3］，是以 DNA 分類學(xué)為基礎(chǔ)，利用一段標(biāo)準(zhǔn)DNA序列作為標(biāo)記，實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確和自動化的物種鑒定方法。

DNA條形碼技術(shù)所利用的ITS片段為rDNA上一個片段且ITS區(qū)不加入成熟核糖體，有極大保守性，故在進(jìn)化過程中承受的自然選擇壓力非常小，能容忍更多的變異。在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關(guān)系非常接近的2個種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進(jìn)化特征。ITS2是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯。此外ITS序列片段較小、易于分析，目前已被廣泛應(yīng)用于植物屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 材料來源

1.2 試劑 植物DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，北京），2×TaqPCR Master Mix（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，北京）。

1.3 DNA提取

1）將金銀花和山銀花研磨成粉末狀，各取30 mg置于1.5 mL離心管中，加入 550 μL 65℃預(yù)熱后的Buffer P1和β-巰基乙醇混合液和4 μL RNaseA，劇烈渦旋震蕩至形成均勻膠體，室溫靜置 10 min。 2）加入 130 μL Buffer P2，充分混勻，12 000 r/min離心 3 min。 3）取上清液 200 μL 至分離柱 A，12 000 r/min 離心 3 min。 4）取下液，300 μL Buffer P3，顛倒混勻。加入吸附柱AC，12 000 r/min離心 1 min。5）倒掉廢液，加入 500 μL 漂洗液 WB，12 000 r/min離心1 min，棄廢液。

將吸附柱AC置于干凈離心管中，在吸附膜中間部位加入50 μL洗脫緩沖液EB（提前預(yù)熱至65℃），室溫靜置 3 min，12 000 r/min 離心 1 min。

1.4 PCR擴(kuò)增及測序

ITS2 引物:ITS2F 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′

ITS3R 5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′

1.5 分光光度法測DNA濃度和純度

1.5.1 實驗原理 組成DNA的堿基均具有一定的吸收紫外線特性,最大吸收值在波長250～270 nm之間，腺嘌呤的最大紫外線吸收值在260.5 nm，堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不會改變，但核酸的最大吸收波長是260 nm，吸收低谷在230 nm。該物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。

1.5.2 實驗儀器 石英比色皿、UV-240紫外分光光度計。

1.5.3 實驗過程 1）用EB溶液校準(zhǔn)。2）用移液器量取 2.5 μL樣本于石英比色皿上測量［4］。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花與山銀花PCR擴(kuò)增結(jié)果 由圖1、圖2、表2可以看出提取到適量的目標(biāo)DNA（500 bp）。

圖1 基因組DNA電泳結(jié)果

圖2 PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果

表2 PCR光密度值（檢測DNA的濃度和質(zhì)量）

2.2 金銀花與山銀花ITS2序列種內(nèi)種間變異分析

本研究涉及金銀花與山銀花不同來源的序列共計20條，包括藥材樣品4條，對照藥材樣品16條，藥材序列長度均為228 bp，其他序列長度為221～228 bp。金銀花G+C的含量為75.4%，華南忍冬G+C的含量為73.7%，菰腺忍冬為71.9%，如表3。

表3 G+C含量

金銀花種內(nèi) K2P遺傳距離［5］0.0393。山銀花種內(nèi)遺傳距離為0.0296和0.0424。山銀花與金銀花的K2P遺傳距離為：0.0364和0.0523。種間最小遺傳距離不都大于種內(nèi)遺傳距離，見表 4。

表4 K2P遺傳距離

圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的NJ樹

3 討論

山銀花種類繁多，形態(tài)類似。由于山銀花存在不同種類，本實驗選取菰腺忍冬和華南忍冬，其中C4、C5為菰腺忍冬。根據(jù)上述結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，藥材山銀花不同基原物種在NJ樹上混雜在一起，難以明顯區(qū)分。而金銀花與山銀花位于不同組，由此可推測金銀花山銀花之間是存在一定區(qū)別的。在漸變式物種形成中，體現(xiàn)了2步遺傳差異——第1步是種群間的隨機(jī)遺傳分化，第2步是隔離促成的群體間生殖隔離。在遺傳分化上，第2步可能并不多（盡管是生殖隔離完成的一步），其涉及的常是與生殖有關(guān)的“關(guān)鍵少數(shù)”基因，從而解釋金銀花種內(nèi)和華南忍冬種內(nèi)遺傳距離大于金銀花與華南忍冬種間遺傳距離的現(xiàn)象。

理想的DNA條形碼應(yīng)滿足以下幾個標(biāo)準(zhǔn):①具有可以區(qū)分物種的足夠變異和分化,同時種內(nèi)變異必須足夠?。虎谟懈叨缺Ｊ氐囊镌O(shè)計區(qū)以便于設(shè)計通用引物；③片段足夠短,以便于DNA提取和PCR擴(kuò)增,尤其是對部分降解的DNA的擴(kuò)增［6］。通過分析實驗結(jié)果可知，一些金銀花樣品與山銀花樣品區(qū)分度較低，這說明僅通過ITS2序列不能測定所有種類的金銀花與山銀花，即ITS2序列并不適宜鑒定所有種類山銀花與金銀花。ITS、matK、tmL-tmF序列也可鑒別金銀花及其易混品，rps16也有較好的DNA條形碼應(yīng)用前景,可作為金銀花及其易混品分子鑒別的DNA條形碼候選序列。

由于金銀花與山銀花的ITS序列變異位點太多且繁雜，所以對于這二者的鑒定，ITS2序列可以起到一定作用，但最好結(jié)合其他序列和鑒定方法，這樣的區(qū)分將更加精準(zhǔn)有效。

主要參考文獻(xiàn)

［1］黃位猛.金銀花與山銀花的鑒別.廣東職業(yè)技術(shù)教育與研究,2015(2):191.

［2］楊翠玲.易混品金銀花與山銀花的鑒別.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2006,7(4):48.

［3］Hebert P D,Cywinska A,Ball S L.Biological identifications through DNA barcodes.Proceedings of the Royal Society B,2003,270(1512):313.

［4］周建國,馬雙姣,黃玉龍，等.種子類藥材補骨脂及其混偽品的ITS2條形碼序列鑒定.世界中醫(yī)藥，2016,11(5):786.

［5］Kimura M.A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences.Journal of Molecular Evolution,1980,16(2):111.

［6］閆華學(xué),于杰.DNA條形碼技術(shù)在植物中的研究現(xiàn)狀.植物學(xué)報,2010,45(1):102.